材料和试剂

蛋托盘
丁腈手套（ecoSHIELD，ecoshield TM eco nitrile PF 250，目录号：62512X）
注射器5毫升（Codan）
针（BC Microlance TM 3,18 G）
胶带（Magic TM 胶带，隐形，7.5 mm，Scotch，8-1975R2）
胶原蛋白海绵（Avitene TM Ultrafoam TM ，BARD，目录号：1050050）
培养皿10厘米（TC皿100，标准）（Sarstedt，目录号：83.3902）
管50毫升（Sarstedt，目录号：62.547.254）
移液器
组织包埋海绵（Kartell，目录号：02922-04）
嵌入盒（Sakura，Tissue-Tek ® Uni-Cassette ®，Biopsy Gray，目录号：4172）
塑料容器
受精Ross 308肉鸡蛋（WüthrichGeflügelAG，Belp，Schweiz）
OE19食管腺癌细胞（ECACC，目录号：96071721）
抗体（Dako，M7240）
抗体（Novus Biologicals，NB600-1384）
抗体（MBL兔多克隆，LabForce，Nunningen，瑞士，＃PM0045）
RPMI-1640（Sigma-Aldrich，Acuderm inc。，目录号：R8758）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
VPS34抑制剂（VPS34-IN1，Selleckchem，目录号：1382716-33-3）
Accutase（StemPro TM ，Thermo Fisher，目录号：A1110501）
乙酸（冰川，100％）（默克，目录号：100063）
用于分析的氯仿（默克，目录号：102445）
福尔马林（Thommen-Furler，目录号：612103）
石蜡（Tissue-Tec ®，Sakura，目录号：4656）
甲醇用于分析（默克，目录号：106009）
绝对乙醇（默克，目录号：107017）
二甲苯（Sigma，目录号：16446）
Mayer的hemalum解决方案（默克，目录号：109249）
Eosin yellowish（Gurr，目录号：34197）（适用于工作溶液，参见食谱）
Phloxin B（Gurr，目录号：43064）
DAB检测试剂盒（（Venta Roche）
聚合物精制检测试剂盒（Leica，Biosystems，目录号：DS9800）
Carnoy的固定剂（见食谱）
曙红 - phloxin工作液（见食谱）
HER2 IHC（见食谱）
Ki76 IHC（见食谱）
LC3B IHC（见食谱）
P62 / SQSTM1 IHC（见食谱）

设备

操作剪刀（14厘米，锋利，笔直）（World Precision Instruments，目录号：501218-G）
镊子
活检穿孔器，8 mm（Acu-Punch，目录号：P850）
带旋转抽屉的加湿培养箱（Rcom，Maru 300 MAX）
加湿培养箱固定（Rcom，Maru孵化器和育雏器100）
层流罩（Kojair ®，BioWizard Silver SL-130蓝色系列）
水浴（GFL 1013，GFL_20007）
立体显微镜（OLYMPUS，SZX16）
烤箱（Binder，ED56）
Benchmark Ultra免疫染色剂（Venta Roche）
Leica Bond RX免疫染色剂（Leica Biosystems，Muttenz，Switzerland）

软件

Olympus CellSens Standard 1.15（奥林巴斯公司， www.olympus-sis.com ）

程序

孵化
用蒸馏水和组织清洁受精鸡蛋，然后在旋转培养箱（37°C和60％湿度）中孵育。
打开鸡蛋（孵化第3天）
1. 在第一步中，在制作窗户的一侧用乙醇清洁蛋壳。在层流罩下工作。
2. 将鸡蛋侧身放在鸡蛋托盘上。用一把锋利的剪刀在鸡蛋底部打一个洞（图2A）。
3. 现在，用注射器取出约3毫升蛋白（图2B）。确保以陡峭的角度引入针头，以避免伤害蛋黄。
4. 丢弃取出的蛋白，并用一条胶带封闭孔。
5. 为了避免蛋壳过度破碎，在蛋的侧面放一条条纹（长度足以覆盖将被切割的窗户）的胶带（图2C）。
6. 再次，使用锋利的剪刀在透明胶带的一侧打孔，以便将剪刀插入蛋中。现在，切出一个椭圆形窗口（图2D）。
7. 丢弃切出的蛋壳，并用另一条胶带关闭窗户（图2E）。
8. 从现在开始，将鸡蛋在蛋托（37°C，60％湿度）的固定培养箱中孵育。
  
  图2.打开鸡蛋。在孵化的第3天，打开鸡蛋并进一步保持在静止的培养箱中。在第一步中，在蛋（A）的“底部”将蛋壳冲入蛋壳中。然后，使用注射器除去约3ml的蛋清，并用胶带（B）封闭孔。另一条胶带粘在蛋的一侧（C）。在苏格兰威士忌的区域切开一个窗口，以避免蛋壳碎屑落在膜上，使用锋利的剪刀（D）。最后，窗口关闭，另外还有一条胶带（E）。
胶原蛋白支架的制备（播种前24小时）
1. 在层流罩中工作。每个样品打一个胶原蛋白支架。
2. 使用无菌镊子和刀片切除适量的胶原蛋白海绵。
3. 最好在无菌培养皿中冲出支架。使用8毫米活检穿孔器来获得所需的支架数量。
4. 将支架浸泡在培养基中，以后将用于细胞接种过夜或周末在4°C下在50 ml Falcon管中使用。
播种癌细胞（孵化第7天）
1. 准备癌细胞播种。为此，用Accutase分离细胞。在分离期间，Accutase应该比胰蛋白酶对细胞的刺激性要小。当用Accutase分离细胞时，我们经历了更好的结果。然而，这种作用可能依赖于细胞系，在某些情况下，Accutase可能会被胰蛋白酶替代。
2. 计数细胞并制备在20μl（= 5×10 6 细胞，1ml）中的1×10 6个细胞悬浮液，每个CAM每个支架需要细胞悬浮液。。
3. 将制备的支架在37℃的水浴中预热。
4. 在层流罩中准备膜上的种子细胞。准备鸡蛋托盘，无菌镊子，培养皿和移液器。
5. 将支架从管中取出并滴入培养皿中。
6. 将一个鸡蛋从培养箱中取出，放入发动机罩中，然后取下关闭窗户的胶带。
7. 在培养皿中的支架上移取20μl细胞悬浮液并将支架倒置，使细胞夹在CAM和支架之间，到蛋中的膜上。
8. 用新的胶带条关闭窗口，将鸡蛋放回培养箱中。
收获肿瘤（孵化第14天）
1. 将鸡蛋放在冰上（至少30分钟）。
2. 在此期间，准备200毫升（约30个样本）的Carnoy固定剂（见食谱）。在通风橱下工作。
3. 将蛋壳中的窗口切得更宽（再次使用锋利的剪刀;可以切割胶带），以便于处理（图3A）。
4. 如果需要，使用立体显微镜拍摄CAM中的肿瘤。如果肿瘤细胞表达绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP）并且您的立体显微镜上有相应的通道，荧光可能有助于定位微肿瘤。
5. 使用锋利的剪刀和镊子切除包含肿瘤的CAM区域（图3B）。
6. 将移除的CAM与肿瘤一起放入福尔马林中并将其置于嵌入海绵上（图3C）。福尔马林用于预浸嵌海绵并将CAM展开在海绵上。后来使用的Carnoy固定剂具有很强的侵蚀性，可以改变海绵的刚性，因此不建议用于扩散膜。＆nbsp;
7. 取出样品并滴干。将海绵放入带标签的嵌入模具中，用另外的海绵覆盖样品，使肿瘤夹在两块海绵之间（图3D）。
8. 关闭模具，将样品放入Carnoy的固定剂中12小时。
9. 在56-60°C下，在两个合适的塑料容器（最终体积约400 ml）中熔化约260 g的石蜡颗粒过夜。
  
  图3.肿瘤的收获。为了收获肿瘤，将鸡蛋放在冰上至少30分钟。在此期间，窗户被放大以实现更精确的操作（A）。如果需要，现在可以拍摄鸡蛋中的肿瘤图片。如果支架几乎不可见，用荧光团标记肿瘤细胞可以帮助识别肿瘤区域。然后切除肿瘤周围的CAM部分（B），夹在两个嵌入海绵（C）之间并置于包埋模具（D）中。样品现在可以固定，用石蜡浸泡并嵌入。
脱水和包埋（收获后12小时）
1. 固定12小时后开始脱水过程。
2. 将固定组织在甲醇中放置2次，每次30分钟。
3. 然后，将样品在乙醇中放置2次，每次20分钟。
4. 然后是2个二甲苯浴，每个15分钟。
5. 现在，在纸巾上滴下干燥的盒子，尽可能多地去除二甲苯。
6. 将样品在56°C温热石蜡中孵育两次，每次30分钟，以浸泡组织。
切割和染色
为了进一步加工（包埋，切割和染色），将样品送到常规组织病理学实验室。

数据分析

苏木精 - 伊红染色后可以很好地观察肿瘤细胞（图4）。在概述图中，可以观察到由OE19食道腺癌肿瘤细胞（T）新形成的腺体结构。在CAM测定中产生的微肿瘤与小鼠异种移植模型中由OE19细胞形成的肿瘤相当（Wang 等，，2014）。一些肿瘤OE19细胞显示侵入生长进入基质。此外，可以看到部分胶原支架（SC），微肿瘤下部的血管（BV）和CAM的上皮层。使用泛细胞角蛋白染色通过免疫组织化学（IHC）使肿瘤细胞可见。 Ki67染色（人特异性）证明了高增殖活性。通过IHC染色也证实了Her2在肿瘤细胞中的过表达（抗体信息参见“食谱”）。

图4. CAM中肿瘤的免疫组织化学染色。 OE19食管腺癌细胞（1×10 6 在CAM上接种7天）。 SC =支架; BV =血管; T =肿瘤和CAM =绒毛尿囊膜。这里显示的是苏木精和曙红（H＆amp; E）的污渍;和人类特异性IHC染色：泛细胞角蛋白（PanCK），一种上皮标记物; HER2，一种受体酪氨酸激酶，在OE19细胞和Ki-67中扩增，与增殖有关。

在接种OE19细胞之前，一组用早期自噬抑制剂VPS34-IN1治疗，这被认为对巨自噬具有特异性（Bago et al。，2014）。在将它们接种到CAM上之前，将抑制剂以5μM的浓度施加到细胞上。
这些与我们之前用于体外实验的浓度相同（Janser et al。，2018）。切除并用自噬标记物染色后，比较LC3B和p62未处理和预处理的肿瘤（图5）。在未处理的样品中，p62和LC3的染色是连续的，VPS34-IN1处理的样品的染色模式显示清楚的点形成。我们已经证明VPS34-IN1在OE19细胞中体外抑制巨自噬（Janser et al。，2018），因此这清楚地表明我们可以在CAM模型中生长的微肿瘤中捕获阻断的自噬。由于CAM代表了一种相对便宜的3D肿瘤模型，可以评估几个参数（IHC，显微镜），这可以作为补充体外数据的选择方法，并更深入地了解自噬在癌症中的作用。

图5.使用CAM测定评估巨自噬。 OE19食管腺癌对照细胞（上图“DMSO”）并用巨自噬抑制剂VPS34-IN1（下图“VPS34-IN1”）处理。显示了苏木精和曙红（H＆amp; E）和两个巨自噬标记物p62和LC3B的染色。在放大倍数中，指示正在进行的巨自噬的自噬标记的点状结构清晰可见。

笔记

该方案是用OE19食管腺癌细胞建立的。此外，我们测试了一组乳腺癌细胞系（SKBR3，T47D和MCF7）和两个结肠癌细胞系（LS174T，CaCo2），我们也观察到了良好的结果。
胶原蛋白支架比Matrigel ®更容易处理，也可以更好地接枝。由于胶原蛋白海绵吸收细胞悬浮液，与我们使用Matrigel ®支架的实验相比，在接种步骤中损失的细胞更少。
在孵化器外操作期间，鸡蛋不应该变冷。因此，如果一次只处理一个鸡蛋并且每个工作步骤都做好准备，则胚胎存活率方面的成功率要高得多。
取决于将使用哪种细胞系，当接种在无血清培养基中时，肿瘤细胞将在CAM上生长得更好。
接种在CAM上的胶原支架上的细胞数可以从细胞系到细胞系不同。通常，接种1×10 6个和2×10个 6 细胞。
该CAM协议已经过优化，可用于评估3D模型中的自噬。通常，这种改进的CAM方案也允许确定肿瘤生物学的其他方面，例如，例如，遗传修饰或处理的癌细胞侵入CAM，以及通过免疫组织化学染色切割的胱天蛋白酶-3的细胞死亡。使用胶原海绵作为支架可以改善用于3D中癌细胞的治疗反应研究的CAM测定。
可以用EGFP，mCherry或其他荧光蛋白标记肿瘤细胞（图6）。这将有助于微型肿瘤在CAM上的定位以进行切除（有时肿瘤是透明的并且难以找到）。标记细胞的另一个优点是有迹象表明微肿瘤是否形成以及它有多大。如果可见新肿瘤，则无需继续该过程。此外，荧光的强度也可以用作读出的活力。

图6. CAM中的mCherry和EGFP标记的肿瘤细胞。 mCherry标记的MCF7乳腺癌细胞。亮场（A）和红色荧光（B）图片。 EGFP标记的OE19食管腺癌细胞，明视野（C）和绿色荧光（D）图片。

食谱

Carnoy的固定剂
混合60％甲醇，30％氯仿和10％冰醋酸。
曙红 - phloxin工作液
1. 用10克曙红粉和1000毫升蒸馏水配制1％的储备液。＆nbsp;
2. 用10克phloxin粉和1,000ml蒸馏水配制1％的储备液。＆nbsp;
3. 用10％的曙红原液，1％的phloxin原液，88.5％的乙醇和0.5％的冰醋酸制备工作溶液。
HER2 IHC
使用Benchmark Ultra免疫染色剂（Venta Roche）进行。抗体（克隆4B5，Venta Roche，Rotkreuz，瑞士）未经稀释应用，EDTA抗原修复35分钟
Ki76 IHC
用Leica Bond RX免疫染色剂（Leica Biosystems，Muttenz，Switzerland）进行。将抗体（M7240，Dako）以1：200稀释，在95℃下用Tris抗原修复30分钟
LC3B IHC
与Leica Bond RX免疫染色剂一样。将抗体（＃NB600-1384，Novus Biologicals）以1：4,000稀释，并在95℃温育30分钟
P62 / SQSTM1 IHC
用Leica Bond RX免疫染色剂进行。将抗体（＃PM0045，MBL兔多克隆，LabForce，Nunningen，Switzerland）以1：9,000稀释并在95℃温育30分钟
注意：为了可视化，根据制造商的说明，使用Bond聚合物精确检测试剂盒（Leica，Biosystems，DS9800）和Ultra view DAB检测试剂盒（Venta Roche）进行可视化。

致谢

作者感谢Deborah Krauer和Silvia Rhis提供的出色技术支持。作者感谢伯尔尼大学病理学研究所的转化研究组（TRU），特别是JoséGalvánHernándes博士和Carmen Cardozo博士对该项目的出色技术支持。这种方法的建立得到了瑞士癌症联盟（KFS 3700-08-2015）的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。资助者在研究设计，方法的发展，手稿的撰写以及决定公布结果方面都没有任何作用。

参考

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Barth，S.，Glick，D。和Macleod，K.F。（2010）。自噬：分析和工件。 J Pathol 221（ 2）：117-124。
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