材料和试剂

锥形瓶（Duran，目录号：2121628）
微量离心管（Eppendorf，Safe-Lock管，目录号：0030120086,0030120094）
离心管（Sarstedt，目录号：62.554.502,62.547.254）
培养管（TPP，目录号：91016）
移液器吸头（VWR，目录号：89041-404,89041-412,89041-400）
血清移液器（VWR，目录号：612-3702,612-3700,612-3698）
6孔组织培养试板（TPP，目录号：92406）
TC7细胞（人细胞系，Caco-2结肠腺癌细胞的衍生物）（Chantret et al。，1994）＆nbsp;
福氏志贺菌 M90T（Sansonetti et al。，1982）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：21885-025）
青霉素 - 链霉素溶液（10,000 U / ml）（Gibco，目录号：15140122）
最低必需培养基非必需氨基酸溶液（100x）（Gibco，目录号：11140-035）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）解决方案（Gibco，目录号：14190-144）
胎牛血清（Gibco，目录号：10500056）
HEPES 1 M解决方案（Gibco，目录号：15630-080）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Gibco，目录号：25300-054）
台盼蓝染色（0.4％）（Thermo Scientific，目录号：T10282）
琼脂糖（VWR生命科学，目录号：35-1020）
胰蛋白酶大豆汤（TSB）即用型粉末（默克，目录号：105459）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）即用型粉末（默克，目录号：105458）
乙醇（VWR chemicals，目录号：20821.558）
刚果红（西格玛，目录号：C6277）＆nbsp;
脱氧胆酸钠（西格玛，目录号：30970）
硫酸庆大霉素（西格玛，目录号：G1264）
无菌一次性petriplates（西格玛，目录号：P5606-400EA）
刚果红解决方案（见食谱）
生长培养基（见食谱）
感染缓冲液（见食谱）
脱氧胆酸钠溶液（见食谱）
庆大霉素溶液（见食谱）

设备

生物安全柜（Thermo Scientific，HERAsafe KS 18）
分光光度计（Amersham，Utrospec 2100 pro）
移液器控制器（VWR，Accurpette）
CO 2 培养箱（Thermo Scientific，Heracell VIOS 160i）
台式离心机（VWR，Micro Star 17R）
离心机（Eppendorf，5810R带转子A-4-81用于板）
水浴（格兰特，JBA 12）
移液器（Eppendorf，Research plus）
倒置显微镜（Motic，AE2000双目）
细胞计数器（Thermo Scientific，Countess II FL）
细胞计数器载玻片（Thermo Scientific，Countess Cell Counting Chamber Slides，C10228）
轨道振动筛（EdmundBühler，Swip SM25）
真空泵（VWR，迷你隔膜真空泵VP 86）

软件

Prism 7（GraphPad， https://www.graphpad.com ）

程序

注意：实验应在生物安全2级实验室进行。

细菌的制备
参考协议 - 噬斑测定的程序A，以确定TC7人肠上皮细胞中弗氏志贺氏菌的侵袭和细胞间传播（Sharma和Puhar，2019）。
TC7细胞的制备
参考方案 - 斑块试验的程序B，以确定TC7人肠上皮细胞中弗氏志贺氏菌的侵袭和细胞间传播（Sharma和Puhar，2019）。
感染和细胞裂解
第3天
1. 在第3天，当细菌达到OD 600nm = 0.3-0.4时，将1-1.5ml培养物移液到微量离心管中。
2. 将管在3,000 x g 下旋转5分钟。吸出上清液。在室温下加入等体积的PBS，并通过轻敲微量离心管或通过轻轻涡旋重悬沉淀。
3. 重复步骤C2至少两次，最后在室温下将沉淀重悬于感染缓冲液（参见食谱）中。记录细菌悬浮液的OD 600nm 。
  推荐的该实验感染复数（MOI）为5.由于每个孔中有1×10 6 细胞，每孔所需的细菌数量为5×10 6 。
  OD 600nm = 1时志贺氏杆菌细胞的数量为0.5×10 9 / ml;因此，在OD = z时，细菌细胞的数量= z×0.5×10 9 。使用以下公式计算感染每个孔所需的细菌悬浮液的体积：
  
  所需的细菌悬浮液体积（ml）= 5 x 10 6 / zx 0.5 x 10 9
4. 从细胞中吸出培养基，并在室温下向每个孔中加入2ml无菌PBS。
5. 轻轻旋转盘子，小心地吸出所有液体。在至少2次洗涤后，在室温下向每个孔中加入2ml感染缓冲液（参见食谱）。
6. 将所需体积的细菌悬浮液（通常约10μl，在步骤C3中计算）添加到6孔板的每个孔中。在室温下将板在180 x g 下离心10分钟。
7. 将板在37℃，10％CO 2 下孵育所需的感染时间，通常为1小时。当志贺氏菌在37°C（35°C及以上）的温育温度下与细胞接触时，通过T3SS分泌效应蛋白，从而介导细菌入侵。
8. 孵育后，如步骤C4和C5，用无菌PBS洗涤孔三次。
9. 向每个孔中加入2ml庆大霉素溶液（参见配方），并将板在37℃和10％CO 2 下再孵育1小时。如果评估细胞内细菌存活和繁殖，则可以延长该孵育时间。
10. 与庆大霉素一起温育后，用PBS洗涤孔三次（如步骤C4和C5）。
11. 从孔中吸出PBS并加入1ml脱氧胆酸钠溶液（参见配方）以裂解TC7细胞（细菌抵抗脱氧胆酸盐）。
12. 使用1 ml移液器，将细胞从表面刮下并用吸管上下移动以有效裂解细胞并使裂解液均质化。
电镀
1. 如下在无菌PBS中制备该裂解物的对数连续稀释液。
2. 在1.5 ml微量离心管中分配450μl无菌PBS。
3. 向一个试管中加入50μl细胞裂解液，并将其标记为10 -1 稀释液（如图1所示）。将管涡旋几秒钟，并将50μl悬浮液从该管转移至含有450μl无菌PBS的下一个管中。将该新管标记为10 -2 稀释液。重复此步骤以获得裂解物的进一步稀释液（图1）。
4. 对于较短的感染时间点，较低的稀释度将提供显着的结果。例如，如果感染时间为1小时，10 -1 稀释就足够了;但如果感染时间增加到2小时，由于细菌繁殖，10 -2 稀释将更合适。同样，考虑更高的稀释度，甚至更长的感染时间。
  
  图1.细胞裂解物的对数连续稀释的示意图
5. 标记琼脂平板上的部分（在板的底部），如图2所示。
6. 放入10μl稀释的悬浮液（10 -1 / 10 -2 / 10 -3 / 10 -4
7. 每种稀释液至少滴三滴（图2中的R1，R2和R3;代表技术重复）。＆nbsp;
8. 在另一个平板上，以相似的方式标记扇区（在平板的底部）并放入由复制孔的裂解物制备的悬浮液滴。该板用作另一技术复制品。
9. 将板在37℃孵育过夜。
10. 计算掉落中的殖民地。只考虑其中菌落数在可计数范围内（3-30个菌落）的稀释液。
11. 同时，对起始细菌悬浮液进行对数连续稀释，并以与上述类似的方式在TSA板上点10μl滴。＆nbsp;
12. 将板在37℃下孵育过夜，与其他板一起孵育，并计数滴中的菌落，类似于步骤D10。接种物的菌落计数用作对步骤C3中进行的计算的验证。
  
  图2. TSA板上的区域，用于将多达四种不同稀释液滴入一式三份

数据分析

从原始菌落计数中，使用以下公式确定CFU / ml：

CFU / ml =菌落数×稀释倍数×100
例如，如果在10 -2 稀释液中计数15个菌落，则使用上述公式计算CFU / ml如下：

CFU / ml = 15（菌落数）×100（稀释因子，10 -2 ）×100 = 150,000或1.5×10 5
使用Prism软件绘制每个待分析菌株的以CFU / ml表示的细菌数量与时间的关系，并使用相同的软件进行统计分析（图3）。要在固定时间点仅比较两个样本值，请使用学生的 t - test。然而，为了研究多个样本在多个时间点的统计显着性，使用双向ANOVA和Tukey的事后检验。

图3.两种不同菌株在不同感染时间内CFU / ml的细胞内细菌数量的示例图。每个点代表从复制品获得的独立值。

笔记

为了制备弗氏志贺氏菌的甘油储液，在新鲜的TSB中将过夜培养物稀释200倍，并在37℃和200rpm摇动下孵育。定期监测培养物的OD 600 。在OD 600 = 0.6时，在2ml冷冻管中取出1ml培养物并加入无菌甘油至浓度为15-50％（v / v）。轻轻混合并将管储存在-80°C。冷冻原料在-80°C下稳定多年，然而，多次冻融循环可能会缩短保质期。
仔细选择刚果红琼脂上的红色菌落进行实验。灰白色菌落失去了毒力质粒并且是入侵缺陷的。如果在过夜培养后不立即使用平板，但保持在4°C（可能长达3周），需要标记白色菌落，因为刚果红的非特异性结合它们会变红。侵袭性菌落的红色染色仅在35°C以上的生长期间发生。
刚果红能够通过志贺氏菌中的III型分泌系统（T3SS）诱导分泌。染料与具有活性T3SS的细菌菌落结合，使其呈现红色。这是一种简单快速的筛选方法，用于区分毒性志贺氏菌菌落与无毒菌株（由于毒力质粒的固化）。不幸的是，刚果红的作用机制尚不清楚。
培养TC7细胞并在青霉素和链霉素（100U / ml）存在下维持。然而，感染缓冲液中不含任何抗生素（可抑制细菌生长）。这也强调了在开始感染之前洗涤细胞单层的重要性。
加入细菌后，将6孔板离心以帮助结合，因为志贺氏菌缺乏粘附因子。
保留入侵后所需的所有缓冲液和试剂，然后在使用前加热至37°C。介导入侵的T3SS效应子的分泌是温度依赖性的。它在35°C以上有效，但在室温下无效。为了使入侵同步，重要的是在入侵前将细菌保持在室温下的缓冲液中。
含有庆大霉素的培养基应在使用当天制备。
即使在较长时间的孵育期间，庆大霉素也不能穿透细胞并杀死细胞内的细菌。细胞内细菌一直保持“保护”状态。
脱氧胆酸盐是一种去污剂，因此TC7细胞裂解液应该用很少的移液来制造，以避免气泡。
使用专用的孵化器进行感染。
使用移液器控制器时，轻轻地用重力（Accurpipette中的“G”设置）或以最低流速将溶液分配到6孔板中以避免分离细胞单层。
在旋转平板，清洗细胞和离心过程中要小心，因为融合的细胞单层很容易脱落。
TC7细胞可以在没有血清的培养基中存活约6小时。因此，感染时间长达约6小时不需要额外的血清。然而，对于更长的孵育时间，可以在庆大霉素处理后加入血清。
如需进一步阅读和详细介绍本手稿中未详述的基本方法（如细菌接种，倒板，等），建议读者阅读以下书籍：实验室手册（卡布奇诺和威尔士，2017）和动物细胞培养：基础技术和专业应用手册（Freshney，2010）。

食谱

刚果红解决方案
1％（w / v）刚果红在水中
称取1g刚果红染料，并将其溶于70ml水中。将溶液的体积调至100 ml，并使用0.2μm膜过滤器对溶液进行过滤灭菌。刚果红溶液在室温下长时间稳定
生长媒介
DMEM
1x氨基酸溶液
100 U / ml Pen-Strep溶液
10％热灭活FBS
向500ml DMEM中加入5ml氨基酸溶液，5ml Pen-Strep溶液和50ml FBS（通过在55℃温育30分钟灭活）
注意：生长培养基必须在4°C下储存，可以使用3-4周。
感染缓冲区
DMEM（无血清）
20 mM HEPES，pH 7.4
向50ml无血清DMEM中加入1ml 1M无菌HEPES pH 7.4
注意：感染缓冲液在4°C下稳定数月。
脱氧胆酸钠溶液
PBS中0.5％脱氧胆酸钠
向40毫升PBS中加入200毫克脱氧胆酸钠并过滤灭菌注意：该溶液在室温下稳定数月。
庆大霉素溶液
感染缓冲液中50μg/ ml庆大霉素
向15 ml感染缓冲液中加入25 mg / ml（水中制备）的25 mg庆大霉素
注意：庆大霉素的储备溶液必须在-20°C下以小等分试样储存。虽然冷冻储备溶液可稳定数月，但反复冻融循环可能使抗生素效率低下。工作的庆大霉素溶液不应存放，并且总是做好新鲜的准备。

致谢

我们感谢Puhar实验室的成员进行批判性阅读。如。在Emmanuelle Charpentier的赞助下，获得MIMS卓越选择博士后计划的津贴。该计划由Kempe Foundations和Knut以及Alice Wallenberg基金会资助。 A.P.承认来自MIMS，UCMR，Umeå大学和Wallenberg Academy Fellow计划的慷慨资助。该方案用于Puhar 等人（2013）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Ashida，H.，Mimuro，H。和Sasakawa，C。（2015）。 Shigella 通过提供具有特定作用的效应蛋白来操纵宿主免疫反应。< / a> 前免疫 6：219。
Cappuccino，J.G。和Welsh，C.T（2017）。微生物学：实验室手册，第11版。 ISBN：978-0134298672。
Chantret，I.，Rodolosse，A.，Barbat，A.，Dussaulx，E.，Brot-Laroche，E.，Zweibaum，A。和Rousset，M。（1994）。从细胞系Caco-2的早期和晚期分离的克隆中蔗糖酶 - 异麦芽糖酶的差异表达：葡萄糖依赖性负调节的证据。 J Cell Sci 107（Pt 1）：213-225。
Freshney，R。I.（2010）。动物细胞培养：基础技术手册和专业应用。第六版。 ISBN：9780470528129。
Puhar，A。和Sansonetti，P。J.（2014）。 III型分泌系统。 Curr Biol 24（17 ）：R784-791。
Puhar，A.，Tronchere，H.，Payrastre，B.，Nhieu，G。T.和Sansonetti，P。J.（2013）。志贺氏菌效应器通过调节危险信号ATP的上皮释放来抑制炎症产生脂质介质PtdIns5P。 Immunity 39（6）：1121-1131。
Sansonetti，P.J。，Kopecko，D.J。和Formal，S.B。（1982）。参与质粒对弗氏志贺氏菌的侵袭能力。感染免疫 35（3）：852-860。
Shigellosis-第3-2018章黄皮书|旅行者的健康| CDC。可在以下网址获得： https：//wwwnc.cdc。 gov / travel / yellowbook / 2018 / infectious-diseases-related-to-travel / shigellosis 。