材料和试剂

注意：除非另有说明，否则材料/试剂均在室温下储存。

飞行和胚胎选择
1. 显微镜载玻片（25 x 75 x 1 mm）（Fisher，目录号：125447）
2. Miracloth（Fisher，目录号：80058-394）
3. 玻璃底微孔盘（MatTek，目录号：P35G-1.5-14-C）
4. Axygen 1.7 ml透明管（VWR，目录号：10011-722）
5. 瓶子，6盎司。瓶（VWR，目录号：75813-108）
6. 瓶塞（VWR，目录号：89168-890）
7. 板; 60 x 15 mm培养皿（Fisher，目录号：FB0875713A）
8. Yeast（Lab Scientific，目录号：FLY-8040-5F）
9. 糖蜜（Lab Scientific，目录号：FLY-8008-16）
10. 细菌级琼脂（US Biological，目录号：A0930）
11. 黄色玉米面（Lab Scientific，目录号：FLY-8009-20）
12. 对羟基苯甲酸甲酯（Lab Scientific，目录号：FLY-5501-5）
13. 漂白剂（5.25％次氯酸钠）（Staples，目录号：COX02489）
14. Halocarbon oil 700（Sigma，目录号：H8898-50ML）
15. 乙酸乙酯（Fisher，目录号：E1964）
16. Tegosept（Genesee Scientific，目录号：20-259）
17. 糖蜜食品（见食谱）
18. 糖蜜盘（见食谱）
RNA提取和纯化
1. Parafilm（4英寸x 250英尺）（VWR，目录号：52858-032）
2. Exel 27 G皮下注射一次性针头（Fisher，目录号：148099）
3. Corning Barrier Tips，1-20μl（Fisher，目录号：10320725）
4. Corning Barrier Tips，1-200μl（Fisher，目录号：10320727）
5. Corning Barrier Tips，100-1,000μl（Fisher，目录号：10320729）
6. RNase Zap（Fisher，目录号：AM9780）
7. Trizol（Thermo Scientific，目录号：15596026）（4°C储存）
8. 超纯糖原（Fisher，目录号：10814-010）（-20°C储存）
9. 氯仿（Fisher，ICN19400280）
10. 异丙醇（VWR，PL323ZA-4）
11. 乙醇，绝对（200证明）（Fisher，目录号：BP2818500）
飞菌株
His2AvRFP（II）（Bloomington Drosophila Stock Center（BDSC）＃23651）和背景中具有His2Av-RFP的CRY2标记的品系。具有CRY2标签的质粒可以从Addgene（＃26866）获得。该序列用于产生含有CRY2的供体载体，其与引导RNA一起注入 w1118; BestGene Inc.的PBac {y [+ mDint2] = vas-Cas9} VK00027 （BDSC＃51324）胚胎使用3xP3 dsRED选择编辑的等位基因，随后除去该盒。有关Cas9介导的基因组编辑技术的详细信息，请参阅（Hamm et al。，2017）。 RFP标记的组蛋白用于在每个核分裂期间可视化核密度。如果感兴趣的基因位于第二染色体上，则可以使用第三染色体上的His2AV-RFP（Bloomington Drosophila Stock Center（BDSC）＃23650）。独立验证从外部源生成或接收的所有行非常重要。我们对CRY2-ZLD基因座进行了完全测序，以确保修复事件正确发生并通过实验测试两条独立衍生的CRY2-ZLD系，以确保它们在所有实验中表现相同。所有果蝇都在25°C的标准糖蜜食品中在12小时光照/黑暗循环的培养箱中生长。

设备

移液器
胚胎收集笼（Genesee Scientific，59-100）
解剖显微镜（尼康，SMZ1000）
尼康ECLIPSE Ti-E epiflurescence显微镜，具有470±20 nm和572±35 nm滤光片
胚篮（Cantex，5140104）
Pellet Pestles（Fisher，目录编号：12-141-363）
离心分离机
-20°C冰柜
-80°C冰柜

程序

飞行和胚胎选择
1. 长大2-3瓶 His2AvRFP（II）和 CRY2; His2AvRFP（II）在25°C的标准糖蜜食品中在12小时光照/黑暗循环的培养箱中飞行。
  注意：使用His2AvRFP（II）果蝇作为所有光遗传学实验的对照至关重要。我们控制了导致基因表达的非特异性变化的三个特征：单独的蓝光暴露，CRY2标签的存在，以及由延长的蓝光暴露引起的轻微发育延迟。使用His2AvRFP（II）暴露于相同蓝光方案的果蝇使我们能够识别从蓝光暴露而不是CRY2介导的蛋白质失活变化的基因组，并将它们从我们的下游分析中排除。
2. 将苍蝇从2-3瓶倒入一个带有糖蜜盘和一小块湿酵母的小胚胎收集笼中。允许恢复24小时。
3. 让雌性在新鲜的糖蜜盘上预先放置1小时。
4. 执行适当的时间过程以捕获感兴趣的时间点。对于专注于NC10-14的实验，我们允许果蝇放置60分钟。
5. 在所需的放置期后，将胚胎收集到网状胚胎篮中并用去离子水彻底洗涤。
6. 将胚胎在用去离子水稀释的50％市售漂白剂中脱胚3分钟（最终= 2.6％次氯酸钠溶液）。
7. 用去离子水洗涤去离子胚胎3分钟。
8. 使用小型油漆刷或其他类似仪器将显微镜载玻片上的胚胎从网篮中取出一滴卤烃油700。
  注意：一旦脱落，胚胎就会脆弱。在随后的所有步骤中要小心对待它们。
9. 将胚胎放在Nikon SMZ1000（或类似）解剖显微镜上，选择5-7个比所需时间点更年轻的胚胎，并将它们移到玻璃底微孔培养皿的盖玻片上，同时加入少量的卤代烃油700.（我们建议使用发展生物学学会的“互动飞行”网站 https：// www .sdbonline.org / sites / fly / aimain / 2stages.htm 作为分期胚胎的资源。）以相同的方向定向除一个胚胎外的所有胚胎，以便在蓝光暴露后更容易最终选择目标胚胎（图1）。
  
  图1.如何在盖玻片上组织胚胎以便在照射后轻松识别正确的胚胎。使用少量的卤烃油700来安装胚胎非常重要。＆nbsp; < br />
光遗传失活
1. 将装载的胚胎移至Nikon ECLIPSE Ti-E（或类似的）表面荧光显微镜上进行光遗传学灭活。使用落射荧光显微镜上的RFP通道，通过确定2,500μm方形中的细胞核密度来识别比所需时间点更年轻的胚胎（McDaniel et al。，2019）（表1）。
  注意：此步骤仅适用于NC10及以后的时间点，因为在NC10之前，细胞核位于胚胎内部，不易观察。
  
  表1.通过核密度分期果蝇胚胎。长度和核密度/2,500μm 2 表示NC10和NC14之间的每个NC。
2. 一旦胚胎达到所需的核循环，开始将胚胎暴露于通过470±20nm过滤器过滤的光。每隔30秒，切换到一个572±35的滤波器，曝光30ms，以显示His2Av-RFP信号。这种方法允许您连续分期胚胎，而不会在非蓝光下留出足够的时间让CRY2标记的蛋白质重新折叠。继续将胚胎暴露于蓝光，短暂切换成RFP成像，直到胚胎达到所需的发育阶段。胚胎暴露在蓝光下的时间长短因实验设计而异。
  注意：使用电动滤光轮可以自动完成此过程。
3. 在完成时间过程后，立即将发光的胚胎放到一个新的糖蜜盘上，并快速工作，短时间滚动以去除任何多余的卤烃油700（图2，视频1）。
  
  图2.从胚胎中去除多余的油。使用您选择的工具，将胚胎在糖蜜盘上滚动，直到除去过量的Halocarbon 700油，然后将胚胎移至Trizol /糖原溶液中。
  
  视频1.去除糖蜜盘上过量的Halocarbon 700油
4. 去除多余的油后，将胚胎移入一片封闭膜上的5μlTrizol+200μg/μl糖原滴。
5. 用27号针头戳胚胎一次或两次。这最好在显微镜下进行，以确保胚胎和/或Trizol不被吸入针头。
  注意：此处要非常小心，以确保胚胎和/或Trizol不会通过毛细管作用吸入针头（图3，视频2）。还要注意不要穿透封口膜。在此步骤中任何Trizol的丢失都会降低下游测序文库的复杂性。
  
  图3.如何在刺戳胚胎以释放RNA时定向针。以高角度定位针头以防止毛细管作用将Trizol或胚胎吸入针头。
  
  视频2.在Trizol中摧毁胚胎
6. 将胚胎在Trizol中孵育2-3分钟直至胚胎不再可见。
7. 在封口膜中加入另外5μlTrizol/糖原溶液，将10μl转移到另外30μlTrizol/糖原溶液的管中（总共40μl）。＆nbsp;
8. 将溶解的胚胎在室温下在Trizol /糖原溶液中孵育10分钟。
9. 储存在-80°C直至收集所有胚胎。
  注意：
  1. 对于我们的实验，我们为每种情况收集了4个单独的胚胎。
  2. 为了最好地控制蓝光介导的基因表达变化，将未标记的His2AvRFP（II）胚胎处理至相同的蓝光暴露时间过程。这将允许识别脱靶基因表达变化并将其排除在进一步分析之外。
  3. 我们发现，在没有任何蓝光照射的情况下，我们在相同的发育时间点收集我们的CRY2-Zld胚胎，进行“无光”控制也很有帮助。这使我们能够识别出一小部分错误表达的基因，可能是由于存在CRY2标签。
  4. 因为我们正在准备我们的胚胎，我们希望确保每个胚胎都暴露在相同数量的蓝光下。使用的落射荧光显微镜照射胚胎超出直接可视化的胚胎。因此，我们仅从安装的5-7个胚胎中提取RNA。唯一的例外是“无光”对照实验，因为发育阶段是唯一测量的变量。
RNA提取和纯化
在开始之前，用RNase Zap擦拭移液器和工作表面以从工作区域移除所有RNase。本节仅使用屏障尖端和无RNase试剂和试管。另外，将台式离心机预冷至4°C。该程序改编自Lott 等人（2011）。
1. 解冻所有胚胎样本。
2. 用一次性颗粒研杵研磨以确保胚胎完全均质化，并且RNA完全释放到溶液中。
3. 向每个样品中加入960μlTrizol+200μg/μl糖原溶液。在室温下孵育5分钟。
  注意：将新的Trizol /糖原溶液直接吸到研杵上，将残留的RNA洗去管中。
4. 加入200μl氯仿。剧烈混合15秒并在室温下孵育5分钟。
5. 将样品在12,000 x g 4℃下离心15分钟。
6. 在样品旋转的同时，准备一套带有500μl异丙醇的新标记管。
  注意：离心后，样品将分为三层。红底层含有蛋白质。将存在DNA所在的小间期和含有RNA的透明顶层。
7. 用异丙醇将透明的上层转移到合适的管中。上层应该有~500μl的液体。将管倒置8-10次以彻底混合。
8. 将管移至-20°C冰箱以沉淀RNA。将它们在-20°C孵育至少30分钟，但如果需要，可将它们在那里放置数小时至过夜。
9. 将样品在12,000 x g 4℃下离心15分钟。
10. 小心取出上清液。您可能看不到RNA颗粒，因此移液器非常缓慢以避免意外去除任何RNA。
11. 向每个管中加入1ml 75％乙醇并将样品倒置混合。
12. 将样品在12,000 x g 4℃下离心5分钟。
13. 小心取出上清液，再用1 ml 75％乙醇洗涤。
14. 将样品在12,000 x g 4℃下离心5分钟。
15. 小心取出上清液，用1 ml 75％乙醇洗涤第三次。
16. 将管再次短暂离心以收集残留的乙醇并小心地将其除去。＆nbsp;
17. 让样品干燥5分钟。
18. 向每个管中加入50μl不含RNase的水并冷藏30-60分钟以使RNA重悬。然后，您可以将这些样品储存在-80°C或直接进行文库制备。
  注意：
  1. 用于重悬样品的水量将根据使用的文库制备试剂盒而有所不同。 TruSeq RNA样品制备v2试剂盒的理想输入为50μl。
  2. 对于我们的样品，我们直接从RNA提取/纯化到文库制备的第一天。

食谱

注意：如有必要，可以购买现成的盘子和瓶子。

糖蜜食品
1. 配料： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>水
  2.66 L
  酵母
  33克
  黄玉米棒
  163克
  琼脂
  16克
  糖蜜
  200毫升
  在95％乙醇中的10％对羟基苯甲酸甲酯
  38毫升
2. 煮沸80％的水，加入琼脂，让其溶解
3. 在剩余的20％的水中，加入酵母，让其溶解，然后在玉米面中搅拌
4. 将糖蜜加入琼脂溶液中，然后在酵母/玉米面混合物中搅拌
5. 将混合物煮沸并煮沸5-10分钟
6. 关闭加热并冷却至少5分钟
7. 搅拌10％对羟基苯甲酸甲酯
8. 倒入瓶中
糖蜜盘
1. 配料： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>细菌级琼脂
  22克
  糖蜜
  90毫升
  水
  562毫升
2. 混合并加入搅拌棒，高压灭菌器灭菌（液体循环; 45分钟）
3. 在磁力搅拌板上搅拌的同时将溶液冷却至60℃
4. 加入5毫升乙酸乙酯
5. 加入5毫升10％Tegosept（乙醇中）
6. 充分混合并倒入盘子中

致谢

我们要感谢哈里森实验室的成员，他们对本协议的创建给予了批判性的阅读和帮助，以及来自威斯康星大学麦迪逊生物化学光学核心和Seth Blair的Elle Grevstad使用他的视频捕获能力解剖显微镜。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

Caussinus，E.，Kanca，O。和Affolter，M。（2011）。由抗GFP纳米抗体介导的荧光融合蛋白敲除。 Nat Struct Mol Biol 19（1）：117-121。
Foe，V。E.和Alberts，B。M.（1983）。在果蝇原肠胚形成之前的五个有丝分裂周期中对细胞核和细胞质行为的研究胚胎发生。 J Cell Sci 61：31-70。
Guglielmi，G.，Barry，J。D.，Huber，W。和De Renzis，S。（2015）。在组织形态发生过程中调节细胞收缩性的光遗传学方法。 Dev Cell 35（5）：646-660。
Hamm，D.C.，Larson，E.D.，Nevil，M.，Marshall，K.E。，Bondra，E.R。和Harrison，M。M.（2017）。塞尔达的一个保守的母体特异性抑制结构域通过Cas9介导的 Drosophila melanogaster诱变揭示。 PLoS Genet 13（12）：e1007120。
Hamm，D。C.和Harrison，M。M.（2018）。管理母系与合子转变的监管原则：来自黑腹果蝇的见解>。 Open Biol 8（12）：180183。
Haruki，H.，Nishikawa，J。和Laemmli，U。K。（2008）。锚定技术：快速，有条件地建立酵母突变体表型。 Mol Cell 31（6）：925-932。
Huang，A.，Amourda，C.，Zhang，S.，Tolwinski，N。S.和Saunders，T.E。（2017）。解码早期 Drosophila 胚胎中形态发生素Bicoid的时间解释。< / a> Elife 6：e26258。
Liu，H.，Yu，X.，Li，K.，Klejnot，J.，Yang，H.，Lisiero，D。和Lin，C。（2008）。 PhotoExcited CRY2与CIB1相互作用以调节拟南芥中的转录和花朵起始。 Science 322（5907）：1535-1539。
Lott，S.E.，Villalta，J.E.，Schroth，G.P.，Luo，S.，Tonkin，L.A。和Eisen，M.B。（2011）。早期 Drosophila melanogaster 发育中合子X转录的非经典补偿通过单一发现-embryo RNA-seq。 PLoS Biol 9（2）：e1000590。
McDaniel，S.L.，Gibson，T.J.，Schulz，K.N.，Fernandez Garcia，M.，Nevil，M.，Jain，S.U.，Lewis，P.W.，Zaret，K.S。和Harrison，M。M.（2019）。继续开展先驱因子Zelda的活动是推动合子基因组激活所必需的。 Mol Cell 74（1）：185-195 e184。
Schulz，K。N.和Harrison，M。M.（2019）。调节合子基因组激活的机制。 Nat Rev Genet 20 （4）：221-234。
卖方，C.A.，Cho，C.Y。和O'Farrell，P.H。（2019）。快速胚胎细胞周期延迟蛋白质/ SetDB1在 Drosophila 。 Genes Dev 33（7-8）：403-417。