材料和试剂

2.0毫升无菌圆底微量离心管（USA Scientific，目录号：1620-2700）
0.5毫升无菌微量离心管（USA Scientific，目录号：1605-0000）
10μl无菌移液器吸头（USA Scientific，目录号：1111-3810）
200μl无菌移液器吸头（USA Scientific，目录号：1111-1810）
1000μl无菌移液器吸头（USA Scientific，目录号：1111-2821）
25 ml血清移液器（USA Scientific，目录号：1072-5410）
15毫升无菌锥形离心管（VWR International，目录号：10025-686）＆nbsp;
50毫升无菌锥形离心管（VWR International，目录号：1025-698）
移液器（研究 - 包括3-pack [2-20μl，20-200μl，100-1000μl]，Eppendorf，目录号：EPPR3OP2）
硝酸纤维素膜（Sigma-Aldrich，目录号：GE10600002）
吸墨纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：88600）
铝箔（VWR International，目录号：89107-724）
3厘米塑料培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150318）
Saran wrap（VWR International，目录号：89136-664）
Ames的媒介（Sigma-Aldrich，目录号：A1420-10X1L）
丙烯酰胺ReadySol IEF 40％（GE Healthcare，目录号：17-1310-01）
4-（2-羟乙基）-1-哌啶乙磺酸（HEPES）（Omnipur，目录号：5320）
氟化钠（NaF）（Fischer Scientific，目录号：S299-100）
腺苷（Sigma-Aldrich，目录号：A-4036）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P-7626）
乙二胺四乙酸（EDTA）（VWR，目录号：BDH4616）
罗氏蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
Milli-Q水
液氮
95％O 2 / 5％CO 2 气瓶
氯化镁（MgCl 2 ）（EMD，目录号：MX0045-1）
牛血清白蛋白（BSA） - 不含脂肪酸（Sigma-Aldrich，目录号：A-8806）
氯化钠（NaCl）（EMD，目录号：SX0420-3）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
Tween-20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
脱脂奶（Sigma-Aldrich，目录号：M7409）
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（Avanti Polar Lipids，目录号：850520）
11- cis - 视网膜（国家眼科研究所）或9- cis - 视黄醛（Sigma-Aldrich，目录号：R5754）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-1L）
谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G-1251）
氢氧化钠（EMD，目录号：SX0593-3）
二硫苏糖醇（DTT）（Research Products International Corp [RPI]，目录号：D11000-1000）
矿物油（Bio-Rad，目录号：1632129）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
TEMED（西格玛奥德里奇，目录号：T9281）
视紫红质抗体RET-P1（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-57433）
过氧化物酶标记的抗小鼠IgG（Vector Laboratories，目录号：PI-2000）
用于IEF的Pharmalyte 2.5-5（GE Healthcare，目录号：17-0451-01）
用于IEF的Pharmalyte 5-8（GE Healthcare，目录号：17-0453-01）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
绝对乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
ECL western blotting检测试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2209）
缓冲液A（均质缓冲液）（见食谱）
缓冲液B（再生缓冲液）（见食谱）
缓冲液C（增溶缓冲液）（见食谱）
11- 顺式 - 视觉库存（见食谱）
IEF凝胶解决方案（见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1x含Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐水（见食谱）

设备

光刺激器：用于光刺激视网膜的灯凳
该装置（图1）包含中性状态光源，中性密度滤光片，干涉滤光片和其他光学元件，这些光学元件将500 nm光线聚焦在直径约为5 mm的光斑上均匀强度，其中包含重新光谱的Petri贡献选择光的强度，持续时间和波长，以漂白（光活化）特定部分的视紫红质。
Thorlabs组件是模块化的，可用于各种光学元件的组合，用于Thorlabs中使用的所有光学元件的漂白。强烈的白光由6V 100钨丝提供图1中使用的光源（内部设置）取自废弃的Zeiss显微镜，但来自任何其他制造商制造商的照明器制造商也将服务于此目的。 MB2218具有1/4“-20螺纹孔阵列，用于连接铝板上光路中的元件（Thorlabs; MB 12 18），这些元件以线性方式排列，以便进行调整。首先是一个滤光轮（Thorlabs; CFW 6），其位置为5英寸直径的中性密度滤光片。以下中性密度滤光片ar用过：
NE05B-A直径25.0 mm的吸收型ND滤光片ND = 0.5
NE10B-A直径25.0 mm的吸收型ND滤光片ND = 1.0
NE20B-A直径25.0 mm的吸收型ND滤光片ND = 2.0
NE30B-A直径25.0 mm的吸收型ND滤光片ND = 3.0
NE40B-A直径25.0 mm的吸收型ND滤光片ND = 4.0
下一个过滤器安装在车轮中5个空间的1英寸安装孔中。接下来是两个笼板（Thorlabs; CP02），每个板都有一个直径为1英寸的孔，用于接受光学元件。在这种光滤波器的研究下，根据研究的灵敏度，可以将该滤波器改变为具有不同带通特性的另一滤波器。第二部分是1英寸直径的平面凸透镜，焦距为5厘米（Thorlabs; LA 1951-A）。这两个部件通过中间光管连接在一起（Thorlabs;一种安装在笼子立方体上的非偏振分束器（Thorlabs; CCM1-BS013），它包含一个镜子，可将光线垂直引导至4 mm孔径，视网膜溶液放置在该孔径上。谅解备忘录这些包括连接到底板的安装底座（Thorlabs; BA2，BA1S），安装杆（Thorlabs; ER2，ER3）和安装柱;通常情况下，在彩色滤光片和镜头之间放置一层薄薄的不透明塑料板或卡板作为快门。由于曝光时曝光时间相对较长，因此去掉电子背景光刺激足够准确。
光刺激器可以使用以下部件构建（图1）：
1. 卤钨灯（Thorlabs，目录号：QTH10B）
2. 铝板（Thorlabs，目录号：MB1218）＆nbsp;
3. 具有中性密度过滤器位置的过滤轮（Thorlabs，目录号：CFW6）
4. 中性密度滤光片（Thorlabs，产品目录号：NE05B-A; NE10B-A; NE20B-A; NE30B-A; NE40B-A）
5. 笼板（Thorlabs，目录号：CP02）
6. 干涉滤光片（Thorlabs，目录号：FD1G）
7. 平凸透镜（Thorlabs，目录号：LA1951-A）
8. 中间光管（Thorlabs，目录号：SM1L10）＆nbsp;
9. 笼式立方体非偏振分束器（Thorlabs，目录号：CCM1-BS013）
10. 安装基座（Thorlabs，目录号：BA2; BA1S）
11. 安装杆（Thorlabs，目录号：ER2; ER3）
12. 安装柱（Thorlabs，目录号：TR1）＆nbsp;
黑色，不透光的Delrin塑料盒（图2）
任选地在光照后在黑暗中进行不同时期的孵育，以测试在黑暗中视紫红质磷酸化的持续性。
荧光灯（B＆H，Porta-trace / Gagne LED灯箱（11“x18”），目录号：POLB1118L2）
荧光灯 - Lithonia照明（Aubuchon Hardware，目录号：676883）＆nbsp;
均质器（Kinematica，Polytron，型号：PT1200C）
注意：Polytron PT-1200C有三个提示，每个提示针对不同的体积进行了优化。使用的速度（最大）为3.5米/秒。
Hoefer双凝胶脚轮（Hoefer，目录号：SE6015）
夹具组件（Hoefer，目录号：SE6003U）
凸轮（Hoefer，目录号：SE6005L）＆nbsp;
Spacer（Hoefer，目录号：SE6119-2-.75）
注意：请参阅Hoefer目录中的蛋白质电泳 http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Hoefer_Catalog_Protein_Electrophoresis.pdf 。
IEF系统（GE Healthcare，Amersham Pharmacia，型号：Multiphor II系统）
冷却系统（GE Healthcare，Amersham Pharmacia，型号：MultiTemp III系统）
电聚焦带（GE Healthcare，Amersham Pharmacia，目录号：18100440）
样品应用条（GE Healthcare，目录号：18-1002-26）
电源（Bio-Rad，型号：PowerPac 3000）
离心分离机
4°C冰箱
-80°C冰箱
昏暗的红色灯泡（亚马逊，Delta 1 Brightlab Universal Red Junior Safelight 11 W灯泡，目录号：35110）
Nutator（VWR International，目录号：82007-202）
弯曲镊子（Electron Microscopy Sciences，目录号：78752-11）
Scalpel（电子显微镜科学，目录号：72042-11）

软件

ImageJ（NIH / https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

样品制备
注意：与样品接触的所有材料和设备必须清洁。尽量减少样品的处理和操作。
视紫红质是由视蛋白和11- 顺式 - 视黄醛组成的色蛋白。当眼睛暴露在光线下时，视紫红质的11- 顺式 - 视黄醛成分转化为全部配置的改变导致视蛋白与视网膜分离，导致漂白，其中视紫红质通过受体磷酸化失活。完全暗适应只能在所有视紫红质被去磷酸化时发生，这一过程在完全黑暗中需要> 3小时。可变时间段再次发生变化由于所有视紫红质物种都未被磷酸化，因此不会暴露在光线下。
1. 视紫红质磷酸化可以在红外光或暗红光下的解剖，制备和等电聚焦中得到说明。我们使用Delta 1 Brightlab Universal Red Junior Safelight 11 W灯泡作为房间暗适应组织的处理用作漂白样品的对照。所有小鼠均通过体外实验<原位原位小鼠或已经分离的视网膜中，然后在黑暗中温育不同时间。在暴露于光线之前暗夜适应。
2. 对于每个实验条件，通过颈椎脱位在昏暗的红光或红外光下处死。在实验时小鼠可以是3-15周龄的任何菌株或性别。包括在内进行比较。
3. 将弯曲的镊子放在眼睛的背景下（视频1）。安乐死后，将鼠标放在平坦干净的表面上，并通过施加压力将眼睛伸出。用手握住眼球。用手托住手术刀，从上到下轻轻切开角膜（背侧到腹侧）。用弯曲的方式在眼睛下方施加压力。将视网膜置于缓冲的Ames培养基中（1.9 g / L NaHCO 3 用95％O <镜片通过镊子进行显影，并继续从底部施加压力以拉出视网膜。 sub> 2 / 5％CO 2（Ames和Nesbett，1981）。在五种不同的实验条件下进行磷酸化测定：a）冷冻暗适应的视网膜并将其储存在 - 80°C（深色），b）暗适应视网膜，漂白剂和immedia计算冷冻并储存在-80°C（0 h），c）暗适应视网膜，漂白，在黑暗中孵育1小时，立即冷冻并储存在-80°C（1小时），d）暗适应视网膜，漂白，在黑暗中孵育2小时，立即冷冻并储存在-80°C（2小时），e）暗适应视网膜，漂白，在黑暗中孵育3小时，立即冷冻并储存在-80°C（3） h）进一步处理这些样品进行IEF分析。对于漂白，将视网膜置于缓冲的Ames培养基中（1.9 g / L NaHCO 3 鼓泡，95％O 2 / 5毫米直径“O”形环中心的5％CO2）连接到3厘米塑料培养皿的中心。这个培养皿位于校准光刺激器的台上，如图所示如图1所示。
  
  视频1.视网膜解剖。该视频由南加州大学动物护理大学根据南加州大学动物研究伦理委员会根据IACUC批准协议ID 11853和20575.
  
  ＆nbsp;光刺激器由可变强度钨卤素光源，500 nm（绿色）干涉滤光片（一组最敏感的彩色干涉光）和中性密度滤光片（调节强度）组成光斑是光刺激的强度，波长和时间，以提供精确的漂白。光斑足以提供均匀的强度，以提供均匀的暴露于整个视网膜。 >
  
  图1.光刺激器的照片。 A.光刺激器的部件; 1-钨卤素光源。光路以黄色突出显示; 2-铝板安装组件; 3-二4-Cage板，500 nm（绿色）干涉滤光片，安装在中性密度滤光片旁边; 5-Cage板，平面凸透镜; 6-Cage立方安装非偏振光束; B.与射束轴成45°角的前表面镜，向上反射以填充5毫米的孔径，含有视网膜的培养皿位于其上。
4. 由光刺激器漂白的光色素部分根据以下关系计算：
  
  哪里，
  F 是漂白色素的一部分;
  I 是漂白光的强度;
  P 是原位测量的视色素（每分子5.7×10 -9 μm 2 ）的光敏性在峰值吸收的波长;
  t 是光照时间（Woodruff et al。，2004）。
  
  应调节曝光时间和光照强度，以每秒总色素的0.03％的速率漂白。
5. 漂白后，将视网膜在黑暗中在Ames培养基中的不透光Delrin室（图2）中孵育，其中1.9 g / L NaHCO 3和3.33 g / L无脂肪酸牛血清在该塑料室中的溶液用95％O 2 2/5％CO 2 气体混合物平衡，其将pH设定为7.4。表明，加入10μM11-顺式 - 视黄醛以促进视紫红质再生（11- 顺式 - 视黄醛原液制备，参见食谱）。
6. 在室温下（RT）将视网膜在黑暗中孵育不同时间长达3小时。在孵育期结束时，在黑暗中移除视网膜并将其放入单独的2 ml微量离心管中。
  
  图2.定制的Delrin不透光腔体。左侧盖子显示有标记的进气口（顶部）和出口（底部）。腔室的下部显示在右侧。这些菜肴充满了艾姆斯的媒介，其中视网膜组织在黑暗中孵化期间浸没。
7. 微量离心管在液氮中快速冷冻，用不透光的铝箔包裹，标记，并在-80℃下储存。＆nbsp;
将小鼠暴露于荧光15分钟，这将产生约90％的漂白剂（Berry 等人，，2016）。对于体内实验，黑暗使小鼠适应过夜。从暗适应的小鼠中解剖视网膜。漂白实验的内部设置如图3所示。在体内漂白实验中不需要光刺激器。在五种不同的实验条件下进行磷酸化测定。同时将不同的光照射到15分钟的光线上，将黑暗放置在光线下15分钟和光线的黑暗（0小时，1小时，2小时，3小时），然后解剖并冻结视网膜并储存在-80°C。进一步处理这些视网膜样品进行IEF分析。

图3.用于体内实验漂白的内部设置。 A.荧光灯B.实验室中的荧光光源设置。将小鼠置于中心的盒子中并暴露在光线下。 br />
IEF分析的处理样本
1. 使用Polytron（约30秒）解冻冷冻的视网膜并将视网膜均质化在400μl缓冲液A（均化缓冲液，参见食谱）中。＆nbsp;
2. 将样品离心15分钟（19,000 x g ，4℃），弃去上清液。
3. 用1ml 10mM HEPES，pH7.5洗涤沉淀3次，并将沉淀重悬于1ml缓冲液B（再生缓冲液，参见配方）中。
4. 向样品中加入过量的9- <顺式> 或11 - 顺式 - 视黄醛（~900-1,200pmol）（11- <顺式> - 视黄醛或9 - cis -retinal stock preparation，见Recipes）。
5. 将样品在4°C下在章动器上孵育过夜。
6. 第二天早上，将样品离心15分钟（19,000 x g ，4℃），弃去上清液。
7. 用1ml 10mM HEPES，pH7.5洗涤沉淀3次，并将沉淀重悬于100μl冷缓冲液C（增溶缓冲液，参见配方）中，在4℃下3小时。
8. 离心样品并将上清液转移到0.5ml微量离心管中。
9. 为了制备10μl最终样品用于加载到凝胶上，将5μl上清液样品与5μl甘油混合。
10. 如方法B所述，将最终样品加载到制备的丙烯酰胺凝胶上。
IEF凝胶制备和电泳（图4）
1. 根据制造商的说明组装Hoefer凝胶铸造设备（图4A-4B）。
2. C.按照制造商的说明将IEF电泳系统连接到冷却系统，并将温度设置为10°C。
3. 准备20毫升IEF凝胶溶液（见食谱）。
4. 轻轻旋转溶液以混合组分并在不超过2分钟的时间内将溶液脱气以避免过早聚合。
5. 使用25ml血清移液管将凝胶溶液转移到铸造设备中（图4C）。＆nbsp;
6. 让凝胶聚合至少90分钟。
7. 使用板分离工具轻轻提起其中一块玻璃板，使凝胶粘在另一块玻璃板上。
  注意：如果凝胶粘在玻璃板上，请清洁玻璃板，然后用一层硅烷涂上一块玻璃板。＆nbsp;
8. 饱和电解质条带，阳极含有0.04 M谷氨酸，阴极含有1M氢氧化钠，直接放在IEF凝胶的暴露表面上。确保电子条正确放置并与凝胶完全接触电解液条的长度不应超过凝胶的长度。
  注意：凝胶在电极条周围膨胀，特别是在阴极处。如果条纹干扰运行，偶尔用吸墨纸吸干条纹。
9. 涂在凝胶板上，凝胶露出面向上（图4D）。
  注意：矿物油涂在IEF系统的冷却平台上，因此玻璃板和冷却板之间有良好的接触，以便均匀冷却。
10. 将铂丝电极轻轻放在电解液条上并安装安全盖。＆nbsp;
11. 使用Bio-Rad PowerPac 3000高压电源，以23 W恒定功率（使用pH梯度）预凝胶凝胶40分钟。＆nbsp;
12. 在阳极电解液条附近的凝胶上的应用条样品。在应用样品和阳极电解质条之间保持1cm的距离，以保护蛋白质免受极端侧的影响。 pH（图4D）。
13. 用新鲜溶液更换电解液条（如果条带看起来干燥），并使用硅胶样品应用条将蛋白质样品加载到凝胶上。＆nbsp;
14. 关闭电泳槽，在恒定的23 W下进行等电聚焦2小时或直到电压不超过3,000 V.
  
  图4. IEF凝胶浇铸和电泳。 A. Hoefer凝胶浇铸设备B.组装凝胶浇注装置C.使用血清移液管浇注凝胶溶液D.在Multiphor IEF系统上涂胶板。阳极条E. E.的取向E.取向E.取向E.取向E取向E.取向E取向E取向E.取向E取向E.取向E取向F.通过毛细管方法进行蛋白质印迹。凝胶，膜和吸墨纸用于蛋白质从凝胶转移到膜上。
准备用于免疫印迹分析的凝胶
1. 从电泳系统中取出凝胶，从凝胶中取出电解液条。
2. 用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗凝胶（参见配方）。
3. 用1x PBS冲洗吸墨纸并将其置于膜上（图4E）。将硝酸纤维素膜切成凝胶大小，用1x PBS润湿膜，并将其置于凝胶上。
4. 通过captolar法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上45分钟（图4F）。＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;
5. 将膜置于封闭溶液（1％TBST中的5％Nonfat-dried milk）（参见配方）中，在室温下放置1小时。用1x TBST洗涤膜10分钟。抗体溶液（视紫红质抗体，5％BSA中的RET-P1，1x TBST）在4℃过夜。第二天，用TBST洗涤膜10分钟。用新鲜缓冲液重复两次。将印迹置于二抗溶液中（使用ECL系统显示条带。使用NIH ImageJ（过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，1％BSA，1x TBST）定量条带的强度。 Berry et al。，2016）。图5显示了视紫红质磷酸化的免疫印迹定量。
  
  使用ImageJ视紫红质的磷酸化的图5.免疫印迹定量。 A.免疫印迹视紫质的等电聚焦从溶解的小鼠视网膜视紫质的之后进行。视紫红质是多磷酸化的体外在完整杆和体内，和视紫红质的磷酸化的量由表示视紫红质的不同磷酸化的物种的多条带表示。0P对应于未磷酸化的视紫红质。数目旁边的“P”（1P，2P，3P B.使用图像J定量带的强度。显示倒置图像（TIFF格式）的屏幕截图。使用矩形图标和值在“分析”命令下测量。＆nbsp;

数据分析

使用任何成像软件反转图像，使背景为黑色，凝胶中的条带为白色。反转图像或者，可以使用ImageJ在“编辑”命令下反转原始灰度图像。使用矩形选择波段，并在“分析”命令下测量像素值（命令+来自样品内所有条带的信号被提供给该样品的总条带的总值，并且通过将该种类的信号除以该条带来计算每个样品的分数。总信号。

食谱

缓冲液A（均质缓冲液）
25 mM HEPES，pH 7.5
100 mM EDTA
50 mM NaF
5 mM Adenosine
1 mM PMSF
1x蛋白酶抑制剂
Milli-Q水
缓冲液B（再生缓冲液）
10 mM HEPES，pH 7.5
0.1 mM EDTA
50 mM NaF
5 mM Adenosine
1 mM PMSF
1 mM MgCl 2
2％BSA
1x蛋白酶抑制剂
Milli-Q水
缓冲液C（增溶缓冲液）
20 mM HEPES，pH 7.5
0.1 mM EDTA
50 mM NaF
5 mM Adenosine
1 mM PMSF
1 mM MgCl 2
10 mM NaCl
1％正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）
1 mM DTT
1x蛋白酶抑制剂
Milli-Q水
11- cis - 视觉库存
1. 原料和粉末都用不透光的铝箔包裹并储存在-80°C
2. 溶解的视网膜原料在-80℃下稳定3个月，其中粉末形式的视黄醛更稳定。
3. 为了制备工作原液，在微红光条件下在微量离心管中摇动少量的11- 顺式 - 视黄色粉末（<1mg）并将其溶解在无水乙醇中（100-200）微升）。
4. 使用无水乙醇作为空白，以适当稀释度（通常1：500-1：1,000）进行UV光谱测定。＆nbsp;
11- cis - 视觉浓度（ c ）计算如下：

＆nbsp;

哪里，
l = 1 cm路径长度
ε <380> = 24,900 M -1 cm -1

准备浓度为~5至10 mM的11- 顺式 - 视黄醛的储备溶液，以避免在重构过程中将蛋白质暴露于大于1％的无水乙醇。

9- cis - 视觉库存
该过程类似于11- 顺式 - 视黄醛的制备.9- 顺式 - 视网膜浓度（ c ）计算如下： br />
＆nbsp;

哪里，
l = 1 cm路径长度
ε <373> = 36,100 M -1 cm -1
IEF凝胶溶液（体积= 20毫升）
这个配方足以铸造一个160 x 140 x 1 mm的凝胶 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;”border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>40％丙烯酰胺溶液
2.5毫升
1％正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）
0.2克
13.33％甘油
2.67毫升
Pharmalyte pH 2.5-5
0.76毫升
Pharmalyte pH 5-8
0.508毫升
过硫酸铵（22.8毫克/毫升）
0.2毫升
TEMED
0.02毫升
用水补足体积至20毫升
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4
2.7 mM KCl
将pH调节至7.4
1x含Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐水
50mM Tris-HCl pH 7.6
150 mM NaCl
0.1％吐温20

注意：配方1,2,3和5应始终保持新鲜.HEPES，EDTA和BSA的库存可以在4°C下制备和储存。可以制备NaCl，MgCl 2 1x PBS和1x TBST的储备液并在室温下储存。

致谢

这项工作得到NIH R01 EY12155到JC和NIH EY01157到MCC的支持。该协议改编自Adamus et al。，1993。我们感谢Natalie Chen女士，Kasey Rose女士和Dr.我们也感谢Yun Yao女士（USC，美国洛杉矶）帮助解决实验室IEF方法问题以及Natalie Chen女士的问题。用于校对脚本。

竞争利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

道德

美国国立卫生研究院指南和机构动物护理和使用委员会（IACUC）11853（有效期 - 2020年）动物实验的IACUC协议批准ID和20575（有效期 - 2020年6月）。

参考

Adamus，G.，Arendt，A.，Hargrave，PA，Heyduk，T。和Palczewski，K。（1993）。视紫红质的多磷酸化动力学。 Arch Biochem Biophys 304（2）：443-447。
Ames，A.，3rd和Nesbett，FB（1981）。体外 em>视网膜作为中枢神经系统的实验模型。 J Neurochem 37（4）：867-877。
Aur，S。和Schedl，T。（2014）。高度特异性抗体的产生和纯化检测翻译后修饰的蛋白质 i n vivo 。 Nat Protoc 9（2）：375-395。
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