材料和试剂

兔网织红细胞溶解物系统，Nuclease Treatment（Promega Corporation，目录号：L4960）
标记的半胱氨酸和甲硫氨酸（PerkinElmer，目录号：072007MC）
SUPERase-In（Life Technologies，Ambion ^®，目录号：AM2696）
线粒体
山梨醇
维拉霉素
寡霉素
抗霉素
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（Sigma-Aldrich）
氨基酸
考马斯亮蓝G250
Digitonin（Calbiochem，目录号：CAS 11024-24-1）
RNA用于体外翻译（参见Recipes）
导入缓冲区（IB）（参见配方）
蓝色天然裂解缓冲液（见配方）
10x BN（蓝色本地）负载染料（参见配方）
RNA（参见配方）
ATP（参见配方）
NADH（见配方）
AVO（参见配方）
蛋白酶K（PK）（参见配方）
Apyrase（参见配方）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（参见配方）
胰蛋白酶（见配方）

设备

带温度控制的水浴
离心机
过滤器 - 0.45μmAcrodisc注射器过滤器（Pall Life Sciences）

程序

翻译反应（30℃，50分钟） - 15μl反应，根据需要标度。
1. 10μl兔网织红细胞裂解液
2. 1μl氨基酸混合物（1mM，但不含半胱氨酸或甲硫氨酸）
3. 1μlRNA
4. 1μl³⁵ S标记的半胱氨酸和甲硫氨酸
5. 1μlSUPERase-In（最多添加2.5μl）。
线粒体制备
1. 100微升导入缓冲液（IB）每50微克线粒体
2. 100μlIB：
  的标准条件
  1. ATP（0.4M）1μl
  2. NADH（0.5M）0.4μl
  3. 通过倒置混合并在进口温度（25℃标准）下静置5分钟以平衡
  4. 每100μl导入加入5μl翻译反应（反应混合物可以通过加入水和2.4 M山梨醇稀释至0.6 M的最终山梨醇浓度，因此高达15μl的此溶液可以添加到100μl的进口缓冲液如果转换效率低则帮助增加信号），并在进口温度下孵育，在合适的时间点除去样品，如第3部分所述
3. 可选添加：
  1. AVO混合的线粒体抑制剂用于消耗膜电位（每100μl1μl）
  2. Apyrase-每100μlIB2μl - 在25℃处理裂解物和线粒体10分钟。
塞子解决方案
1. 在标准条件下，每100μl进口加入100μl冷IB
2. 添加包括以下内容，但可能需要优化浓度：
  1. 胰蛋白酶：每100μl终止溶液1μl/μl
  2. SBTI：4μl/200μl混合物
  3. PK：每100μl终止溶液2μl/μl
  4. PMSF：1mM终浓度（加入时为涡流）
  5. 含PK /胰蛋白酶的溶液在加入抑制剂之前需要20分钟
3. 在每个时间点删除95 如果添加5微升翻译反应/100微升IB或105微升，如果加入15微升/100微升IB。
样品处理
1. 一旦添加到所有样品中的抑制剂以4℃/8,000×g/10分钟旋转。
2. 取出并弃去上清液。
3. 加入100μl冷IB（不重悬沉淀 - 如果蛋白酶用于塞子溶液中，则加入蛋白酶抑制剂）
4. 以4℃/8,000转/分钟旋转/5分钟。
5. 取出并弃去上清液。
  （对于蓝色原生PAGE：
6. 重悬在50μl冷蓝色天然裂解缓冲液（见Recipes）每2微升线粒体。
7. 让样品在冰上15分钟，用温和的涡旋每5分钟（抗体移位：加入2μl抗体，在冰上放置1小时 - 每20分钟轻轻涡旋一次，然后按照下面的方法继续）
8. 以4℃/14,000×10 6 g/10分钟（或15,000，如果可得到的话）旋转样品。
9. 删除45μl上清液到新管用5μl蓝色天然装载染料

食谱

来自使用5μg线性质粒DNA（或1.5μg具有SP6启动子的PCR产物）的体外转录反应的RNA。
导入缓冲区（IB）
0.6M山梨醇 50mM HEPES（用KOH调节至pH7.4）
2mM KPi（通过将1μMKH 2 PO 4与1MK 2 HPO 4混合而制备的pH 7.4）
25 mM KCl
10mM MgCl 2/
0.5mM EDTA 在室温（室温）存储的1mM DTT
ATP
将0.4M的等分试样储存在-20℃（pH至7）下
NADH
0.5微升的等分试样储存在-20℃下
AVO
将100×储存在EtOH& （1μM缬氨霉素，20μM寡霉素，8μM抗霉素），保存在-20℃下
PK（蛋白酶K）
将5mg/ml等分试样储存在-20℃的IB中
PMSF
0.2M在EtOH中，在室温下储存最多1个月
胰蛋白酶
使用10mg/ml原液（最终给予0.1mg/ml）20分钟（储存在-20℃）
SBTI
50mg/ml（在冰上5分钟）（储存在-20℃）
Apyrase
500单位/ml在-20℃下贮存的50％甘油中
10x BN（蓝色本机）装载染料
0.5 M氨基己酸
0.1 M Bis Tris pH 7.0
10％考马斯亮蓝G250 - 过滤并在室温下贮存
蓝色天然裂解缓冲液
20mM Tris-HCl
0.1mM EDTA
50mM NaCl 10％甘油（在室温下储存）
加入PMSF和5％w/v毛地黄皂苷（Calbiochem-加热溶解并在4℃储存），使得在使用前最终浓度为1％洋地黄皂苷和1mM PMSF。

致谢

该方案改编自：Hewitt等人（2012）。在Traven实验室和Lithgow实验室在白色假丝酵母（Candida albicans）线粒体上的工作得到澳大利亚国家卫生和医学研究理事会（APP1023973）的项目赠款的支持。 V.H.是澳大利亚研究生奖的获得者。

参考文献

Chan，N.C.和T.Lithgow（2008）。 SAM复合物功能的外周膜亚基在线粒体外膜生物发生中独立地。 Mol Biol Cell 19（1）：126-136
Hewitt，VL，Heinz，E.，Shingu-Vazquez，M.，Qu，Y.，Jelicic，B.，Lo，TL，Beilharz，TH，Dumsday，G.，Gabriel，K.，Traven，A.and Lithgow ，T.（2012）。线粒体生物发生的模型系统揭示了蛋白质输入和膜组装途径的进化重新布线。 Proc Natl Acad Sci U S A 109（49）：E3358-3366。
Hewitt，V.，Lithgow，T。和Traven，A。（2013）。从线粒体的制备 3（4）： e330。