材料和试剂

移液器吸头（200和1,000μl，Fisher Scientific，目录号分别为02-707-407和02-707-413）
激光安全眼镜（Thorlabs，目录号：LG3）
吸气移液器（Celltreat，目录号：229265）
5和10 ml血清移液器（Corning，目录号：357543和357551）
15毫升离心管（Corning，目录号：352095）
50毫升离心管（Corning，目录号：430829）
24孔玻璃底黑墙板（Greiner Sensoplates，目录号：662892）
T75烧瓶（康宁，目录号：353136）
铝箔（Fisher Scientific，01-213-105）
表达mCherry的NIH：OVCAR5细胞系（Rizvi et al。，2019）（其后为“mCherry-Ovcar5”）
Visudyne ®（Bausch＆amp; Lomb注射用Verteporfin）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）没有Ca 2 + ＆amp; Mg 2 + （Corning，Cellgro，目录号：21-031-CV）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：26140079）
100x青霉素 - 链霉素溶液（Corning，目录号：30001Cl）
胰蛋白酶-EDTA溶液（Corning Cellgro，目录号：25-052-Cl）
康宁生长因子减少（GFR）基质胶®基质（此后为“基质胶”）（康宁，目录号：354230）
使用细胞恢复溶液的基质胶基质（Corning，目录号：354253）
RPMI 1640 medium（Corning，Cellgro，目录号：10-040-CV）
DMSO（Sigma，目录号：D2438）
RPMI生长培养基（见食谱）
4％基质胶（见食谱）
Visudyne ®工作解决方案（见食谱）

设备

移液器（P1000和P200，Gilson，目录号：F123602和F123601，分别）
细胞培养生物安全柜（Baker Company，目录号：SG-200）＆nbsp;
移液器（Biotang，目录号：710932）
分析天平（赛多利斯，目录号：ENTRIS2241SUS）
倒置光学显微镜（VWR，目录号：89404-462）
5x空气物镜（NA 0.16）镜头（PerkinElmer，目录号：HH14000402）
冷冻室（-20°C）（Thermo Scientific，型号：20LFEETSA）
LASER Source（690 nm）（Intense Ltd.，型号：Intense系列7400）
激光功率计（Ophir Vega，目录号：7Z01560）＆nbsp;
激光快门控制器（INLINE-TTL电子快门）
离心机（Beckman，型号：Allegra 6R）
高内容成像仪器（Operetta CLS，PerkinElmer）
加湿细胞培养箱（Thermo Scientific，型号：Forma TM 310）
细胞计数器（Beckman Coulter，型号：Z1粒子计数器）

软件

和谐4.6（PerkinElmer）
GraphPad Prism 8
（可选）ImageJ或qVista软件

程序

注意：按照标准的无菌技术，在无菌生物安全柜内进行所有与细胞培养相关的工作。

基质胶板的制备
1. 通过将小瓶浸入冰冷的步入式冷藏室中，将一小瓶Matrigel解冻一夜。
2. 在处理基质胶之前，将一盒无菌移液管吸头（1,000μl）和玻璃底黑壁24孔板置于冰或冰袋上至少15分钟。
3. 使用P1000移液器，在每个孔中轻轻分配250μlMatrigel，不会引入任何气泡，同时将板保持在平坦的冰袋上。
4. 将板在37℃下在细胞培养箱中孵育20-30分钟以聚合Matrigel。
5. 加入500μl/孔含有4％基质胶的RPMI生长培养基（参见食谱），以避免进一步干燥基质胶床。
6. 将培养板保持在细胞培养箱中，直到程序B中的mCherry-Ovcar5细胞准备好。
细胞接种和3D培养
1. 在具有RPMI生长培养基的T75烧瓶中，在37℃，5％CO 2 的潮湿细胞培养箱中维持mCherry-Ovcar5细胞的2D培养物。
2. 使用倒置光学显微镜检查mCherry-Ovcar5细胞的汇合情况。使用具有50％-80％汇合的板。
3. 用10ml DPBS替换烧瓶中的现有培养基并孵育10分钟。
4. 弃去DPBS并向烧瓶中加入2-3ml胰蛋白酶-EDTA溶液。
5. 在37°C孵育3-5分钟。
6. 在光学显微镜下观察板，检查细胞是否完全脱离表面。
7. 通过加入10ml RMPI生长培养基淬灭胰蛋白酶并重悬细胞。
8. 将细胞悬浮液转移到15ml管中。
9. 在室温下将管在450 x g 离心5分钟。
10. 弃去上清液，用10ml RPMI生长培养基重悬细胞沉淀。
11. 使用Beckman Coulter Counter通过将细胞大小设置在8-20μm之间来确定细胞浓度。
12. 在RPMI生长培养基中制备13ml细胞悬浮液，以达到10,000个细胞/500μl的浓度。
13. 向24孔板的每个孔中加入500μl细胞悬浮液，在含有2％Matrigel的1ml培养基中终浓度为10,000个细胞。
14. 将板孵育7天以允许3D肿瘤结节形成，并在第4天用含有2％Matrigel的新鲜RPMI生长培养基替换培养基。
体外光动力疗法
1. 在第7天，在倒置光学显微镜下观察平板以确保在Matrigel床上形成肿瘤结节（参见图1A）。
2. 通过在RPMI生长培养基中稀释Visudyne原液以达到1μMPS浓度，制备13ml Visudyne工作溶液（参见配方）。
3. 在黑暗中保护PS溶液，并在黑暗或弱光环境中执行以下步骤。
4. 设置非常慢的抽吸速度并将P200移液器吸头（不带棉/过滤器）连接到抽吸移液管，并轻轻吸出每个孔中的现有介质，而不会破坏3D结节。
5. 每孔加入500μlVisudyne工作溶液，“无处理”和“仅有光”对照孔除外。在每个对照孔中加入500μlRPMI生长培养基。＆nbsp;
6. 在37℃下在细胞培养箱中孵育90分钟。
7. 用新鲜的RPMI生长培养基替代含有Visudyne的培养基。
8. 在PS孵育期间，使用激光功率计通过将光密度（辐照度）调节至50 mW / cm 2 2 来准备激光光源和控制器。
9. 为了进行PDT，通过使用定制的可编程TTL快门改变曝光时间，以不同剂量的光（例如0-10J / cm 2）垂直地通过板的底部直接施用690nm光照射每个孔。
  注意：不要在'无处理'井中使用任何激光，而是将最高剂量的激光应用于'仅光照'对照孔。＆nbsp;
10. 在光照射后将板孵育另外4天。
成像
1. 在第11天，通过分析mCherry荧光对板成像以定量残留的活肿瘤（参见图1B）。
2. 将平板置于Operetta CLS上，这是一种具有共聚能力的高含量成像仪器，同时将温度保持在37°C，含5％CO 2 。
3. 分别使用530-560nm和570-650nm的激发和发射滤光片对表达mCherry的细胞进行成像。
4. 通过将视觉上最佳拟合的焦平面保持在10-14个z平面的中间，步长为50μm，在Z-堆叠模式下设置图像采集参数。＆nbsp;
5. 根据“无处理”控制组调整LED功率和曝光时间，使相机传感器不饱和，留下宽动态范围以捕获最高和最低。＆nbsp;
6. 使用5 x空中物镜（NA 0.16）镜头以2×2马赛克格式（每个512 x 512像素，重叠10％）获取图像。＆nbsp;

数据分析

使用Operetta CLS附带的Harmony 4.6（PerkinElmer）软件进行图像分析。
首先从同一平面缝合图像马赛克，然后生成二维“最大强度投影”（MIP）以获得每个井的全局图像。
基于“无治疗对照”设定mCherry荧光的阈值以确定“活肿瘤区域”。＆nbsp;
将残留肿瘤区域的值导出为cvs。使用其他软件（例如Microsoft ® Excel或GraphPad Prism）文件并准备可呈现的图形（参见图1C）

代表性成果
来自PDT治疗3D卵巢肿瘤结节的代表性结果如图1所示。

图1. 3D卵巢癌结节的光动力疗法。 A.如何在Matrigel床上生长的3D卵巢癌结节上进行PDT的示意图。比例尺：500μm。 B.显示10J / cm 2 PDT处理后3D肿瘤结节的代表性荧光图像以及“无治疗”对照。在PDT处理后4天拍摄图像。比例尺：500μm。 C.使用高含量成像系统进行表达mCherry的肿瘤区域的定量，并在标准化为“无治疗”对照后在图中呈现为“分数肿瘤区域”（残留的活肿瘤区域）。根据出版商的书面许可，对已发表的文章（Rizvi et al 。，2019）改编并复制了图像。

笔记

在PDT照射期间，始终使用LASER安全眼镜来保护眼睛。
PDT可以在生物安全柜外进行，同时保持细胞内容物在封闭盖板中无菌。
PS通常是光敏感的。因此，PS孵化应该在黑暗中进行。在培养过程中，多孔板可以用铝箔包裹，以避免意外的光照。
如果使用非荧光细胞，也可以确定治疗反应分析。在那种情况下，可以如前所述使用常规活力染料，例如钙黄绿素-AM和碘化丙锭（Anbil 等人，，2013）。
或者，可以使用ImageJ或qVista软件（Celli 等人，，2014）进行图像分析。
有大量的PS及其脂质体和抗体偶联制剂。用于PDT处理的PS制剂决定了孵育时间，光剂量和光照射的波长。
PDT也可以在2D单层培养中进行，这可能需要优化光剂量。通常，2D培养的LD 50 与3D培养相比较低。
通过使用Cell Recovery Solution（Corning，354253）按照制造商的方案解聚Matrigel基质，可以收获PDT处理的细胞用于下游应用（例如qPCR，流式细胞术，等。

食谱

RPMI生长介质
1. 将10％（v / v）FBS，100 IU / ml青霉素和100μg/ ml链霉素加入500 ml RPMI 1640培养基中
2. 除非另有说明，否则在37℃下将生长培养基预热至所有程序
4％Matrigel
将400μlMatrigel加入10ml RPMI生长培养基中
Visudyne工作溶液（1μM维替泊芬）
1. 首先，使用以下方法确定Visudyne原液的PS浓度，然后通过在RPMI生长培养基中稀释原液来制备Visudyne工作溶液以达到1μMPS浓度：通过扫描从DMSO中设置UV-Vis仪器的“空白” 200nm至800nm
2. 用适量的DMSO稀释你的Visudyne，产生687nm的吸光度值，介于0.1和1之间。
3. 测量稀释的Visudyne从200nm-800nm的吸光度
4. 使用以下等式计算您的Visudyne浓度：

致谢

该协议首先在先前的出版物中报道（Rizvi et al。，2019）。我们要感谢资助来源和原始出版物的作者。这些数字是在出版商的书面许可下复制的。作者要感谢Saad Mohammad和Joseph Swain的有益讨论。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

Anbil，S.，Rizvi，I.，Celli，J.P.，Alagic，N.，Pogue，B.W。和Hasan，T。（2013）。治疗反应指标对光动力治疗计划和卵巢癌三维模型结果的影响。 J Biomed Opt 18（9）：098004。
Celli，J.P.，Rizvi，I.，Blanden，A.R.，Massodi，I.，Glidden，M.D.，Pogue，B.W。和Hasan，T。（2014）。基于成像的平台，用于对3D肿瘤模型中的治疗反应进行高含量，定量评估。< / a> Sci Rep 4：3751。
Celli，J.P.，Spring，B.Q.，Rizvi，I.，Evans，C.L.，Samkoe，K.S.，Verma，S.，Pogue，B.W。和Hasan，T。（2010）。成像和光动力疗法：机制，监测和优化。 Chem Rev 110（5）：2795-2838。＆nbsp;
Goff，B.A.，Blake，J.，Bamberg，M。P.和Hasan，T。（1996）。在小鼠卵巢癌模型中用光动力疗法和免疫结合物治疗卵巢癌。 em> Br J Cancer 74（8）：1194-1198。
Obaid，G.，Broekgaarden，M.，Bulin，A.L.，Huang，H.C.，Kuriakose，J.，Liu，J。和Hasan，T。（2016）。光子医学：光动力疗法和纳米技术的融合。 Nanoscale 8：12471-12503。
Rizvi，I.，Bulin，A.L。，Briars，E.，Anbil，S。和Hasan，T。（2016）。第11章：注意差距：3D模型在光动力疗法中。 In：Photodynamic Medicine。 pp.197-221。
Rizvi，I.，Celli，J.P.，Evans，C.L.，Abu-Yousif，A.O.，Muzikansky，A.，Pogue，B.W。，Finkelstein，D。和Hasan，T。（2010）。在微转移性卵巢癌的三维模型中通过光动力疗法协同增强卡铂疗效。 Cancer Res 70（22）：9319-9328。
Rizvi，I.，Nath，S.，Obaid，G.，Ruhi，M.K.，Moore，K.，Bano，S.，Kessel，D。和Hasan，T。（2019）。 visudyne与苯并卟啉衍生物的脂质锚定脂质体制剂的组合可增强3D中的光动力疗法效果卵巢癌模型。 Photochem Photobiol 95（1）：419-429。