材料和试剂

带有凸轮的无菌培养皿92×16 mm（SARSTEDT，目录号：82.1473）
移液器吸头10μl，200μl和1,000μl（STARLAB，目录号：S1111-3700，S1113-1700，S1111-6701）
1.5毫升微型管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
无菌血清移液器（5,10和25 ml）（SARSTEDT，目录号：86.1253.001,86.1254.001和86.1685.001）
无菌50毫升带蓝色螺帽的CELLSTAR管（Greiner BIO-ONE，目录号：227261）
Concentric Luer-Lok Syringe 50 ml（BD Plastipak，BD Luer Lok，目录号：10636531）
0.22μm注射器过滤器（PES膜，无菌）（STARLAB，目录号：E4780-1226）
诊断显微镜载玻片（12个孔，编号5.2 mm）（Thermo Scientific，目录号：10028210）
显微镜载玻片SuperFrost plus（25×75×1 mm）（R。Langenbrinck Labor + Medizintechnik，目录号：03-0060）
方形盖板（22×22 mm，厚度1.5）（VWR，目录号：631-0125）
半微量比色皿（聚苯乙烯，10×4×45 mm）（SARSTEDT，目录号：67.742）
Milli-Q优质水（ddH 2 O）和蒸馏水
来自酪蛋白的蛋白胨，酶消化（Sigma-Aldrich，目录号：82303）
来自大豆的蛋白胨，酶消化（Fluka Analytical，目录号：90765）
氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：27810.295）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（VWR，目录号：26931.263）
D-葡萄糖（无水）（Melford，目录号：G1400）
Bacto Agar（BD Diagnostics，目录号：214030）
Bacto Tryptone（BD Diagnostics，目录号：211699）
酵母提取物粉末（Ohly KAT，目录号：FllOHLYKAT）
FDAA 7-羟基呋喃羰基氨基-D-丙氨酸（HADA）由印第安纳大学Michael S. VanNieuwenhze提供（Kuru et al。，2015）＆nbsp;
无水二甲基亚砜（DMSO）（Invitrogen，目录号：D12345）
柠檬酸（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：C2404）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：28245.298）
10×PBS缓冲液，含0.017 M KH 2 PO 4 ，0.05 M Na 2 HPO 4 ，1.5 M NaCl ，pH 7.4（磷酸盐水）（Lonza Walkersville INC，AccuGENE，目录号：51226）
16％多聚甲醛（甲醛）水溶液（电子显微镜科学，目录号：15710-S）
SB Molecular Biology Grade琼脂糖（Severn Biotech LtD。，目录号：30 10 50）
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）和胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（见食谱）
Miller Luria-Bertani（LB）培养基和LB琼脂（参见食谱）
HADA股票解决方案（见食谱）
10×柠檬酸钠缓冲液，pH 2.25（见食谱）
1×柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0（见食谱）
1×磷酸盐缓冲盐水pH 7.4（PBS）（见食谱）
3％多聚甲醛溶液（见食谱）
用于显微成像的琼脂玻片（见食谱）

设备

无菌，柔性和一次性接种环（VWR，目录号：612935P）
玻璃烧杯，600毫升和1,000毫升（PYREX，目录号：1000 / 18D和1000 / 22D，分别）
高级单细胞分析天平（Kern，型号：ABT 120-4NM）
IKA RH basic 2磁力搅拌器（IKA，目录号：0003339002）
pH计（Cole-Parmer，Jenway，型号：3510，目录号：351001）
移液器（Gilson，目录号：F167300和F167500）
超低温冷冻机VIP TM 系列-86°C（三洋，产品目录号：MDF-U73V）
舒适TP 1410桌面高，台面下冰箱（利勃海尔，目录号：4016803034339）
Vortex（IKA，型号：Minishaker MS2）
微波MS106 0.6 FT（松井）
50 L实验室孵化器，带数字控制（GenLab培养箱：INC / 50 / DIG）
微量离心机accuSpin Micro 17R，冷藏（Fisher Scientific，目录号：11526873）
Nikon Eclipse Ti显微镜（Nikon Plan Fluor×100 / 1.30 Oil Ph3 DLL物镜）配备Photometrics / Cool SNAP HQ2CCD相机，使用相位对比度和DAPI通道（滤光片组：色度49000，激发波长350/50 nm，发射460 / 50纳米）
高压灭菌器

软件

ImageJ（Rasband WS / US NIH，Bethesda，Maryland，USA / https://imagej.nih.gov/ij/ ）＆NBSP;
MetaMorph ® 7.0版（显微镜自动化与图像分析软件/ Molecular DevicesLLC / https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy ）

程序

提前准备以下解决方案
1. TSB（或LB）和TSB（LB）琼脂平板（见食谱）。
2. 50 mM HADA原液（参见配方）。
3. 10和1x柠檬酸钠缓冲液，1x PBS和3％多聚甲醛（见食谱）。
  注意：使用前过滤并冷却10x和1x柠檬酸钠缓冲液，1x PBS和3％多聚甲醛溶液。
种植细胞
1. 在冰上解冻细菌菌株的甘油储备溶液。使用接种环将菌株BW25113（Datsenko和Wanner，2000），D456（Edwards和Donachie，1993）和CS703-1（Meberg 等人，，2001）在TSB琼脂平板上划线并孵育将板在37℃下过夜。＆nbsp;
2. 用单个细菌菌落接种25ml TSB（或LB）培养基，并在37℃下孵育过夜。＆nbsp;
3. 将过夜培养物稀释至TSB（或LB）培养基中的OD 578 0.1，并在37℃下生长直至它们达到指数OD 578 0.4。
标记细胞
1. 在无菌的1.5 ml微量管中，将最终体积为500μl的预热（37°C）TSB（或LB）的细胞稀释至OD 578 0.1。＆nbsp;
2. 向样品中加入2.5μl50mMD-丙氨酸荧光衍生物（HADA）储备溶液以达到250μM的终浓度，并在37℃下振荡孵育30分钟。
停止细菌生长和洗涤步骤，以去除多余的HADA
1. 向生长的培养物中加入十分之一的最终体积（50μl）冰冷的10x柠檬酸钠缓冲液（pH 2.25）。将样品置于冰上直至离心机（步骤2）准备好使用。
2. 将样品在16,200 x g 4℃下离心2分钟。＆nbsp;
3. 小心取出上清液，通过轻轻吹打将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的1x柠檬酸钠缓冲液（pH3.0）中。＆nbsp;
4. 将样品在16,200 x g 4℃下离心2分钟。小心取出上清液，轻轻移液，将细胞重悬于1.5 ml冰冷的1x PBS（pH 7.4）中，再次离心。＆nbsp;
5. 用冰冷的1x PBS（pH 7.4）重复洗涤步骤一段时间。小心取出样品的上清液，不要接触细胞颗粒。
  注意：据报道，HADA在酸性pH或非缓冲水中几乎不发荧光，在pH7.0以上成像的细胞显示HADA标记的最大亮度（Kuru等，2015）。因此，使用1×PBS（pH 7.4）的最后两个洗涤步骤是至关重要的。
细胞固定
1. 将细胞沉淀重悬于12.5μl1×PBS和12.5μl3％多聚甲醛（参见食谱）中进行细胞固定。＆nbsp;
2. 通过移液充分混合并储存在冰上或4℃下直至显微镜分析。
  注意：应立即对标记细胞进行显微镜分析。
显微分析
1. 在准备好的显微琼脂糖载玻片的孔中移取3μl固定细胞（参见食谱），并将方形盖玻片小心地放在上面并轻轻按压。＆nbsp;
2. 使用配备有Photometrics / Cool SNAP HQ2CCD相机的Nikon Eclipse Ti显微镜（Nikon Plan Fluor×100 / 1.30 Oil Ph3 DLL物镜），使用相位对比度和DAPI通道（滤光片组：色度49000，激发350 /分析）分析标记的细胞50纳米，发射460/50纳米）。＆nbsp;
3. 相位对比度的曝光时间为100毫秒，荧光图像的曝光时间为1秒。
  注意：使用这种优化的方案，所有分析的细胞都被完全标记，显示了在收缩细胞隔膜上的更强信号（参见图1）。向生长的细胞中加入10倍柠檬酸钠缓冲液，用pH3.0的1x柠檬酸钠缓冲液进行初始洗涤，并在冰上快速处理样品，改善了未掺入的HADA的去除，并导致背景荧光信号降低，信号改善检测。
  
  图1.使用荧光D-氨基酸HADA对大肠杆菌细胞进行PG标记。 A. BW25113（Datsenko和Wanner，2000），D456（将Edwards和Donachie，1993）和CS703-1（Meberg 等，，2011）细胞与250μMHADA一起温育30分钟（长脉冲标记）。在4℃下进行短暂洗涤步骤之前，将10倍柠檬酸钠缓冲液（pH 2.25）的十分之一加入细胞培养物中。首先用1x柠檬酸钠缓冲液（pH3.0）洗涤细胞一次，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）洗涤两次。用3％多聚甲醛固定细胞，并通过相差（左）和使用DAPI通道的荧光显微镜（右）显现。比例尺，2μm。 B.可选

数据分析

ImageJ用于裁剪图像以制备图形，并且MetaMorph（v7）用于量化来自至少两个独立实验的~50个细胞的隔膜和侧壁处的荧光信号。可以量化隔膜和侧壁位置处每单位面积的荧光强度，减去背景，并计算侧壁与隔膜信号密度的比率。值应以平均值±SD给出;应使用学生t检验来确定结果的显着性（Peters et al。，2018）。

笔记

在TSB和LB培养基中进行实验而不改变结果的再现性。

食谱

胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）和胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）
准备1升TSB称重以下试剂：
来自酪蛋白的17克蛋白胨
3克来自大豆的蛋白胨
5克氯化钠
2.5克磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）
2.5克D-葡萄糖（无水）
1. 使用磁力搅拌器在温和搅拌下将所有成分溶解在最终体积的1L蒸馏水中
2. 将pH调节至7.3并在121℃下将溶液高压灭菌15分钟
3. 为了制备TSA，在高压灭菌前向1L TSB中加入15g / L琼脂，高压灭菌后将溶液冷却至48℃，并在无菌条件下倒入琼脂糖板。
Miller Luria-Bertani（LB）培养基和LB琼脂
要准备1升LB，称量以下试剂：
10克Bacto胰蛋白胨
10克氯化钠
5克酵母提取物＆nbsp;
1. 使用磁力搅拌器在温和搅拌下将所有成分溶解在最终体积的1L蒸馏水中
2. 将pH调节至7.3并在121℃下将溶液高压灭菌30分钟
3. 为了制备LB琼脂，在高压灭菌前向1L LB培养基中加入15g / L琼脂，高压灭菌后将溶液冷却至48℃，并在无菌条件下倒入琼脂糖平板。
HADA股票解决方案
1. 在127.77μlDMSO中稀释2.1mg粉末状HADA（328.7g / mol）以产生50mM储备溶液
2. 通过移液管充分混合储备溶液，并将其分装在无菌1.5ml微量管中的10μl份中
3. 不需要对储备溶液进行灭菌。储存在-80°C且避光
4. 在使用前不久在室温下快速解冻储备溶液
5. 避免过度的解冻和再冻结循环，或在室温和光线下长时间暴露
  注意：FDAA的干粉在-20°C或更低温度下稳定数月（Kuru等，2015）。在我们的研究中，我们将HADA储存在-80°C，无论是干粉还是DMSO中的储备液几个月，没有分解迹象或改变标签效力。
10x柠檬酸钠缓冲液，pH 2.25（500 ml）
805 mM柠檬酸
410 mM NaOH
1.19 M NaCl
1. 称取77.5g柠檬酸（无水）和34.9g氯化钠
2. 加入206毫升NaOH溶液（ c = 1 mol / L），用MilliQ水将体积增加至500 ml
3. 通过温和搅拌完全溶解并用pH计检查pH。它应该是2.25
1x柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0（500 ml）
80.5 mM柠檬酸
41 mM NaOH
119 mM NaCl
1. 称取7.74g柠檬酸（无水）和3.49g氯化钠
2. 加入206 ml NaOH溶液（ c = 0.1 mol / L），用MilliQ水将体积增加至500 ml
3. 通过温和搅拌完全溶解并用pH计检查pH。它应该是3.0
1x磷酸盐缓冲盐水pH 7.4（PBS）
准备50毫升1x PBS：
1. 移取5ml市售的10x PBS溶液到无菌Greiner管中
2. 加入45毫升Milli Q水并充分混合
  注意：将制备的溶液（10x和1x柠檬酸钠缓冲液和1×PBS）过滤到无菌的50 ml Greiner管中。使用无菌一次性使用50 ml注射器和0.22μm注射器过滤器（PES膜）进行过滤。使用前将溶液在冰上冷却。
3％多聚甲醛溶液
制备1,000μl3％多聚甲醛用于细胞固定：
1. 在无菌1.5 ml微量管中移取187.5μl16％多聚甲醛溶液，加入812.5μl过滤的1×PBS溶液
2. 在使用前涡旋并在冰上冷却
用于显微成像的琼脂载玻片
制备终浓度为1％w / v的琼脂糖溶液：
1. 通过微波将1g琼脂糖溶解在100ml 1×PBS中
2. 使溶液温度达到约60°C
3. 在诊断显微镜载玻片上的12个孔中的每秒中点~150μl琼脂糖溶液
4. 将显微镜载玻片放在上面，轻轻按下，以获得平坦，均匀和薄的琼脂糖垫
5. 在小心移除顶部显微镜载玻片之前，让垫固化
6. 使用前将琼脂糖垫风干约1分钟
注意：如果琼脂糖载玻片没有正确干燥，细胞不会沉淀在琼脂糖垫上。这可以使细胞成像更加困难。

致谢

这项工作报告了一些用于证明铜抑制肽聚糖LD-转肽酶抑制由于青霉素结合蛋白旁路引起的β-内酰胺抗性的方法（Peters et al。， 2018）。这项工作由Wellcome Trust Grant 101824 / Z / 13 / Z资助;英国医学研究委员会在抗菌药物耐药性交叉理事会倡议合作拨款MR / N002679 / 1（至W.V.）和NIH Grant GM113172（至M.S.V.）内。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

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