材料和试剂

盐酸氯胺酮（100mg/ml）（Ketaset FORT DODGE）
甲苯噻嗪盐酸盐（100mg/ml）（甲苯噻嗪类）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 PO 4·1/2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9638 ）
磷酸钠七水合物（NaH 2 PO 4 PO 4，7H 2 O 2）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390 ）
氢氧化钠（NaOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP359）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
磷酸盐缓冲液（PB）
磷酸盐缓冲液（PBS）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E7889）
阻塞缓冲区
正常山羊血清（NGS）（Sigma-Aldrich，目录号：G-6767）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
原发性抗体
1. 兔抗肌球蛋白VIIa抗体（毛细胞特异性标记）（Proteus Biosciences，目录号：25-6790）以1:50的稀释度在封闭缓冲液中。
2. 豚鼠抗VGLUT3（囊泡谷氨酸转运蛋白3）抗体以1:5000在封闭缓冲液中（来自Dr. Robert Edward，Department of Neurology，UCSF的礼物）
二抗
1. Cy2缀合的山羊抗兔二级IgG抗体（Jackson ImmunoResearch）以1:4,000的PBS稀释。
2. Cy3缀合的山羊抗豚鼠第二IgG抗体（Jackson ImmunoResearch）以1:4,000的PBS稀释。
  注意：次级抗体应在PBS（不是封闭缓冲液）中稀释。
DAPI复染色核（PBS中1.5μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D9564）。
Antifade FuorSave试剂（Calbiochem，目录号：34589）
10x PB（参见配方）
10x PBS（见配方）
4％PFA-PB（50ml）（参见配方）
阻止缓冲区（参见配方）

设备

注射器（1ml注射器25G1）（BD Bioscience，目录号：329622）
0.5ml微量离心管帽（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-681-311）
微切割剪（Fine Science Tools，目录号：15002-08）
细镊子（Ted Pella，目录号：5621）
手术刀（羽毛）
5ml Vials（Denville，目录号：T8200-S）
巴斯德移液管（用于冲洗组织）（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-20）
SuperFrost载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550）
盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-548-5A）
培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：1007）
铝箔
冰箱
摇台
解剖显微镜
共聚焦显微镜

程序

耳蜗提取和灌注
1. 麻醉小鼠（小鼠过量用200μl氯化酮盐酸盐，100mg/ml和盐酸赛拉嗪10mg/ml的混合物/100g小鼠重量）。
2. 捏住脚趾，检查动物是否完全睡着，然后断开鼠标。
3. 快速小心地从颅骨中取出耳蜗，并将它们放在培养皿中如下：
  1. 将鼠标头切成两半。
  2. 删除大脑。
  3. 抓住头部，使头骨的"碗"朝上。
  4. 颞骨在后面，并且不连续到颅骨（有许多小骨头连接到头骨）。
  5. 推入颅骨和颞骨（远离耳蜗区域）之间的连接处，以将其从头骨上分离。
  6. 小心地分离远离耳蜗的外来骨骼。
    Parker等人（2010）的以下视频显示，在min 3和4之间，如何解剖来自P3-5小鼠的颞骨（耳蜗）。对于较老的小鼠进行相同的程序，但是唯一的区别是骨骼耳蜗变得更硬。
    http://www.jove.com/video/1685/primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ
4. 在耳蜗的顶点做了一个小孔后，使用注射器通过圆形和椭圆形窗口（RW和OW）推动大约0.5毫升冰冷的4％PFA-PB（为了方向，参考整个耳蜗图片与传说在图1中（Glen等人，2008））
  
  图1.显示鼠标脱钙左颞骨。此标记的图片有助于整个颞骨的鼠标解剖结构的取向，在重现此协议方面取得了良好的成功[此图片来自MacDonald等人（2008年）的论文]。
  
  注意：为了有一个非常好的固定，圆窗膜应该被刺穿，并应在耳蜗灌注之前去除镫骨。
5. 将耳蜗在5 ml 4％PFA-PB中在4°C轻轻搅拌下固定2小时。
6. 使用1ml注射器通过RW和OW灌注3次PB来冲洗耳蜗
7. 在4℃下，在温和搅拌下，在新鲜PB中洗涤3×15分钟
耳蜗脱钙和Corti解剖器官成表面准备
1. 将耳蜗转移到含有5％EDTA的5ml管中，并在4℃，温和搅拌下孵育
  
  产后年龄
  < P7
  P7-P15
  P15-P21
  P21
  
  5％EDTA时间
  1-2小时
  2-4小时
  5-8小时
  12- 24小时
  
  注意：在进行下一步之前，您需要检查耳蜗是否很好地脱钙。不足的脱钙不会帮助获得完整和好的Corti器官。良好的脱钙是当耳蜗与镊子接触时和耳蜗骨变得透明时变软。以下视频中显示了已脱钙耳蜗的图片。
  http：//www.masseyeandear.org/research/ent/eaton-peabody/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/
2. 在4℃下，在温和搅拌下，在新鲜PB中洗涤3×15分钟
3. 耳囊，侧壁，Reissner膜和胸膜应按顺序移除，然后解剖Corti的器官（对于耳蜗解剖的取向，参见耳蜗中匝横截面图2）。
  
  图2.显示用甲苯胺蓝染色的小鼠耳蜗转的中间模块横截面。这个标记的20x视图部分有助于在此协议中所需的鼠标耳蜗解剖结构的方向，以重现此协议的成功。
4. 将Corti的剩余器官进一步解剖成表面制剂，并显微切割成单个匝注意：Liberman实验室的视频显示了表面准备的方法
  
  。 http：//www.masseyeandear.org/research/ent/eaton-peabody/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/
免疫荧光
1. 然后将显微解剖的耳蜗单匝置于含有封闭缓冲液的0.5ml Ependorf管盖中，并在摇摆平台上在室温（RT）温育1小时。
2. 在摇动平台上在4℃下在封闭缓冲液中稀释的一抗中孵育过夜注意：将耳蜗旋转盖放在小培养皿中，并用石蜡膜包装，可以防止脱水。
3. 在PBS中冲洗3×15分钟。
4. 与在PBS中的二抗在室温下在摇摆平台上孵育2小时。
  注意：由于第二抗体对光敏感，所以组织应该用铝箔包裹以防止光照。
5. 在PBS中冲洗3x 15分钟。
6. 在室温下用DAPI在PBS中染色细胞核15分钟
7. 在PBS中冲洗3×15分钟。
8. 安装耳蜗整个安装转小心幻灯片。
  注意：在安装Corti的整个装配机构时，方向是非常重要的。毛细胞毛细胞静纤毛应该面向上并且与盖玻片接触，而图2中标记为绿色的基底膜应该在底部并且与载玻片接触。利伯曼实验室的视频显示了耳蜗表面准备的正确方向，视频幻灯片如图3所示。
  
  图3.显示Liberman实验室视频的幻灯片。 " http://www.masseyeandear.org/research/ent/eaton-peabody/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/"介绍整个座位的正确方向和准备科尔蒂器官。毛细胞毛细胞静纤毛应该面向上并且与盖玻片接触，而图2中标记为绿色的基底膜应该在底部并且与载玻片接触。在此步骤如果耳蜗表面的方向准备工作正常，它提供了在显微镜下的染色组件的非常好的视图

食谱

10x PB
将0.23g无水NaH 2 PO 4和2.17g Na 2 HPO 4七水合物溶于80ml ddH _{2 O。调节pH至7.4，使最终体积为100 ml}
10x PBS
将0.23g无水NaH 2 PO 4和2.17g Na 2 HPO 4·7H水溶液和8.75g NaCl溶解在80ml ddH 2 O。调节pH至7.4，使最终体积为100 ml
4％PFA-PB（50ml）将2g PFA溶解在约40ml ddH 2 O 2中（注意：1 - 您需要加热水并加入NaOH溶解PFA。2-在整个过程中保持温度低于60℃，以避免PFA聚合物的破坏）
在PFA溶解后，加入5ml 10×PB。冷却至室温，并将pH调节至7.4。使最终体积为100 ml。过滤并储存在4°C
注意：在一周或更短时间内使用此解决方案
阻塞缓冲区
含有0.3％TritonX-100和0.3％皂苷的PBS的20％正常山羊血清（NGS）

致谢

我们承认听力研究公司和NIH R21 DC012118-01的这项工作的支持。我们感谢神经元杂志和质量眼和耳朵我们在本文中使用的一些说明图像。

参考文献

Akil，O.，Seal，R.P.，Burke，K.，Wang，C.，Alemi，A.，During，M.，Edwards，R.H。和Lustig，L.R。使用病毒介导的基因治疗恢复VGLUT3敲除小鼠的听力。神经元 75（2）：283-293。

MacDonald，G.H.and Rubel，E.W。（2008）。通过荧光激光扫描共聚焦显微镜对完整小鼠耳蜗的三维成像。 em> Hear Res 243（1-2）：1-10。

Parker，M.，Brugeaud，A.，Edge，A.S.B。（2010）。 corti小鼠器官的原代培养和质粒电穿孔。 J Vis Exp （36）e1685。