材料和试剂

35毫米玻璃底盘（IWAKI，目录号：3971-035，厚度1.5号）
细胞培养皿，灭菌（SANSEI MEDICAL CO。，LTD。，目录号：01-013）
移液器吸头（Watson ® Bio Lab，目录号：123R-755YS [200μl]，123R-757CS [1,000μl]）
无菌培养管（16 ml，聚丙烯）（EVERGREEN，目录号：222-2393-080）
牙签（6.5-18厘米）（任何品牌）
注意：使用前消毒。可以重复使用，直到它们破裂。
表达QUEEN-2m的芽殖酵母细胞：
来自Takaine 等的MTY3261（ MATahis3Δ1:: 3×pRS303-PTEF1-QUEEN-2m-TCYC1leu2Δ0ura3Δ0）例如。该菌株衍生自略微修饰的BY4741亲本菌株（ MATahis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0）。，2019。
表达QUEEN-2m的裂殖酵母细胞：
例如，来自Ito et al。，2019的KSP3769（ h-leu1-32 :: Ptif51-QUEEN-2m :: leu1 + ）< br /> 注意：表达QUEEN-2m的酵母菌株和用于在芽殖酵母中表达QUEEN-2m的质粒可从日本酵母遗传资源中心获得（YGRC， http://yeast.nig.ac.jp/yeast/ ）。
Concanavalin A（Sigma-Aldrich，目录号：C-7275）
大豆凝集素（Sigma-Aldrich，目录号：L-1395）
酵母氮碱不含氨基酸（YNB）（Invitrogen，目录号：Q300-09）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
Bacto-peptone（BD，目录号：211677）
D（+） - 葡萄糖（FUJIFILM Wako，目录号：049-31165）＆nbsp;
2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）（FUJIFILM Wako，目录号：046-06483）
注意：2DG是一种有效的糖酵解抑制剂，已用于消耗酵母细胞中的ATP（Serrano，1977; Xu和Bretscher，2014; Takaine et al。，2019）。
琼脂（FUJIFILM Wako，目录号：010-08725）
邻苯二甲酸氢钾（FUJIFILM Wako，目录号：163-03822）
Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（Kishida Chemical Co.，Ltd。，目录号：000-72535）
乙醇（Kishida Chemical Co.，Ltd。，目录号：140-28553）
NH 4 Cl（FUJIFILM Wako，目录号：017-02995）
Uracil（FUJIFILM Wako，目录号：212-00062）
肌醇（FUJIFILM Wako，目录号：096-00285）
L-谷氨酸（FUJIFILM Wako，目录号：072-00501）
硫酸腺嘌呤（FUJIFILM Wako，目录号：018-19613）
L-Leucine（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录号：2713）
L-组氨酸（FUJIFILM Wako，目录号：082-00683）
L-赖氨酸·HCl（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录号：2714）
L-Methionine（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录号：2715）
L-Phenylalanine（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录号：2717）
L-Serine（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录号：2719）
L-Threonine（PEPTIDE INSTITUTE INC。，目录编号：2720）
MgCl 2 ·6H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：132-00175）
CaCl 2 ·2H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：033-25035）
KCl（FUJIFILM Wako，目录号：163-03545）
Na 2 SO 4 （FUJIFILM Wako，目录号：195-03341）
H 3 BO 3 （FUJIFILM Wako，目录号：021-02195）
MnSO 4 ·5H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：139-00825）
ZnSO 4 ·7H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：268-00405）
FeCl 3 ·6H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：095-00875）
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：198-02471）
KI（FUJIFILM Wako，目录号：166-03971）
CuSO 4 ·5H 2 O（FUJIFILM Wako，目录号：031-04411）
柠檬酸（FUJIFILM Wako，目录号：038-05521）
烟酸（FUJIFILM Wako，目录号：142-01232）
生物素（TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO。，LTD。，目录号：B0463）
泛酸钠（FUJIFILM Wako，目录号：198-05651）
100x氨基酸混合（见食谱）
100x L-亮氨酸原料（见食谱）
50x尿嘧啶原料（见食谱）
SC-His液体培养基（见食谱）
YPD琼脂平板（见食谱）
YELA琼脂平板（见食谱）
100x 5低补充剂（见食谱）
50x盐原料（见食谱）
1,000x维生素（见食谱）
10,000x矿物质（见食谱）
EMM液体培养基（见食谱）
2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）培养基（见食谱）
涂有刀豆蛋白A的玻璃底盘（见食谱）
涂有大豆凝集素的玻璃底盘（见食谱）

设备

倒置荧光显微镜（Nikon，Eclipse Ti-E）配备：
1. 100x物镜（尼康，Apo TIRF 100x油DIC N2 / NA 1.49）
2. 高压汞灯（尼康，Intensilight C-HGFIE 130W）
3. 电子倍增电荷耦合器件相机（Andor-Oxford Instruments，iXon3 DU897E-CS0-＃BV80）
4. FITC滤光片套装（尼康，Ex465-495 / DM505 / BA515-555）
5. 定制的Ex409过滤器套件（Semrock，Ex393-425 / DM506 / BA516-556）
6. 中性密度（ND）滤光片（尼康，ND4 [MBN21804]和ND8 [MBN21808]）
台式吸气器（INTEGRA，VACUSIP）
倒置常规显微镜（Nikon，Eclipse Ts2）配备40倍物镜（尼康，CFI Achromat LWD ADL 40XF / NA 0.55，目录号：MRP46402）
高压灭菌器（TOMY SEIKO CO。，LTD，LBS-325）
纯水系统（Merck Millipore，Milli-Q ® Integral 15）
Erlenmeyer烧瓶（50 ml）（HARIO，目录号：82-0144）
硅胶塞（用于50毫升烧瓶）（Shin-Etsu Polymer，SILICOSEN T22）
孵化器（TAITEC，INCUBATE BOX M-200F）
培养旋转器（TAITEC，RT-50）
旋转振动筛（NISSIN，NX-20）
移液器（BM EQUIPMENT Co.，LTD，PipetPAL ®，型号：PAL-200 [20-200μl]，PAL-1000 [100-1,000μl]）

软件

NIS-Element AR ver。 4.30.01（尼康， https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/ ）
斐济版2.0.0-rc-69 / 1.52n（斐济贡献者[Schindelin et al。，2012]， http ：//fiji.sc/# ）
Microsoft ® Excel for Mac 2011版。 14.7.3（Microsoft， https://products.office.com/ja-jp/excel）
KaleidaGraph ver。 4.5.1（HULINKS， https://www.hulinks.co.jp/software/stat_graph / kaleida ）

程序

细胞制备
1. 使用移液管尖端在YPD（用于 S.cerevisiae ）或YELA（用于 S.pombe ）琼脂平板上从冷冻原种中分离酵母细胞，并在30°下孵育C持续1-2天。
2. 预培养的准备：＆nbsp;
  1. 对于芽殖酵母，使用无菌牙签在16ml培养管中接种2ml含有环状细胞的SC-H，并在30℃下培养过夜，使用旋转器以约40rpm旋转。
  2. 对于裂殖酵母，使用无菌牙签在16ml培养管中接种2ml含有环状细胞的EMM，并在30℃下使用旋转振荡器以150rpm振荡培养过夜。
3. 主要文化的准备：
  1. 对于芽殖酵母，在16ml培养管中用2.85ml SC-H（1:20）稀释0.15ml过夜培养物，并在30℃下以约40rpm旋转培养。
  2. 对于裂殖酵母，在50ml烧瓶（1:20）中用9.5ml EMM稀释0.5ml过夜培养物，并在30℃下以150rpm振荡培养。＆nbsp;
4. 将酵母细胞培养至对数中期。芽殖酵母需要大约3小时，本文所述的实验条件下裂殖酵母需要大约5小时。可以根据个体培养系统优化稀释比和孵育时间。
5. 用相同的培养基稀释细胞培养物10倍，并将100μl细胞置于用伴刀豆球蛋白A包被的35mm玻璃底皿中用于 S. S的酿酒酵母或大豆凝集素。 pombe （见食谱）。
6. 等待5分钟，轻轻抽吸除去大部分培养基，并用300μl新鲜培养基洗涤固定在玻璃表面上的细胞三次。
7. 使用倒置的常规显微镜观察用40x物镜固定在玻璃底皿上的酵母细胞以检查细胞密度。
8. 如果细胞太稀疏，重复步骤A2-A3。
9. 用4-5ml培养基填充培养皿，并在显微镜观察之前将培养皿在室内孵育用于荧光显微镜检查（保持在25℃）至少30分钟。
10. 可选：为了消耗细胞内ATP，用300μl2DG培养基替换培养基三次。在10分钟内获取QUEEN荧光图像。
注意：培养皿中填充有相对于细胞体积过量的培养基，以便通过观察期间营养物质或分泌成分的消耗来最小化培养基化学组成的变化。重要的是将培养基保持在恒定和稳定的温度下，因为QUEEN对ATP的亲和力取决于温度（Yaginuma 等，2014）：更高温度导致QUEEN比率降低，而温度降低导致QUEEN比率提高。
图像采集
1. 在成像前至少1小时打开荧光显微镜系统，以达到约25°C的稳定和恒定温度。
2. 用100x物镜观察固定在玻璃底盘上的酵母细胞，使用倒置荧光显微镜通过明视场成像并聚焦细胞。
3. 使用来自单个 z 平面的FITC（ex480图像）和Ex409（ex409图像）滤镜组拍摄明场图像和QUEEN的两个荧光图像。
4. 关于延时成像，降低激发光的强度和曝光时间（详见表1），以防止QUEEN荧光的光漂白并最大限度地减少对细胞的损害。
5. 将组合图像（明场和QUEEN）保存为nd2文件。
注意：亮场图像对于计算QUEEN比率是不必要的，但对于检查细胞活力或细胞边界很有用。红色荧光（发射波长> 620nm）与QUEEN荧光相容。在单时间点成像中，从每个实验条件的几个视野中收集细胞图像，为定量分析提供足够的样本量。 3-5个视野的观察结果得到n> 1。总共100个细胞是合适的。用于QUEEN荧光显微镜的参数总结在表1中。

表1. QUEEN荧光显微镜的参数
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：800px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>
Ex480
Ex409
Binning
1×1（无分档）

曝光时间（毫秒）*

单个时间点
900/1800
150/300
延时
300/900
50/150
读取模式
EM增益3 MHz 14位

EM增益放大器
200

转换收益
5×

荧光激发光的ND滤镜

单个时间点
ND32（Eclipse Ti-E）×ND16（C-HGFIE）

延时
ND32（Eclipse Ti-E）×ND32（C-HGFIE）

*获取在萌芽/裂殖酵母中表达的QUEEN图像的曝光时间。

数据分析

在以下部分中，斐济软件中的菜单命令和选项以粗体字体表示。

QUEEN比率的计算（单时间点成像）
1. 使用Fiji软件打开nd2文件作为hyperstack文件（多通道和一个时间帧）并将hyperstack分成每个通道图像（一个明场图像，两个QUEEN图像）：图像 - ＆gt;颜色 - ＆gt;拆分通道（图1A，原始图像）。
2. 使用滚球算法（图1A，减去背景）减去QUEEN图像的背景（单元格外的区域中的像素值）：处理 - ＆gt;减去背景。设置滚球半径 20（对于 S.cerevisiae ）或50（对于 S.pombe ）像素，并取消选中所有复选框。
3. 将QUEEN图像转换为带符号的32位浮点灰度：图像 - ＆gt;类型 - ＆gt; 32位
4. 使用修改的IsoData算法（默认算法）评估图像的最大和最小阈值：图像 - ＆gt;调整 - ＆gt;阈值即可。选中深色背景复选框，然后点击自动和应用。选中将背景像素设置为NaN ，将背景（非阈值）像素设置为 NaN （非数字）值（图1A，阈值）。
5. 将ex409图像的像素值除以ex480图像的像素值以计算每个像素处的QUEEN比率：处理 - ＆gt;图像计算器，Image1：ex409图像，操作：分割，图像2：ex480图像。
6. 将彩虹光滑查找表（或任何其他表，如果可取的话）应用于比率图像以表示伪彩色中的QUEEN比率：图像 - ＆gt;查找表 - ＆gt;彩虹光滑。
7. 调整显示范围以包括图像中QUEEN比率的最小值和最大值：图像 - ＆gt;调整 - ＆gt;亮度/对比度 - ＆gt;设置即可。例如，分别设置最小显示值 0.5和最大显示值 3（图1B，比率图像）。
8. 将比率图像和明场图像保存为tiff文件：文件 - ＆gt;另存为......
9. 可选：可以通过运行以下宏来自动执行步骤1-7：插件 - ＆gt;宏 - ＆gt;安装... ，选择并打开stack2ratio.jim宏。打开一个nd2文件，在宏窗口中应用运行。
QUEEN比率计算宏（stack2ratio.jim）
// Macro从这里开始
title = getTitle（）;
run（“Split Channels”）;
c1 =“C1-”+ title; //频道＃1：明场图像
c2 =“C2-”+ title; //频道＃2：ex480图片
c3 =“C3-”+ title; //频道＃3：ex409图片

selectWindow（c2）;
run（“Subtract Background ...”，“rolling = 20 stack”）;
run（“32位”）;
setAutoThreshold（“Default dark”）;
run（“NaN Background”，“stack”）;

selectWindow（c3）;
run（“Subtract Background ...”，“rolling = 20 stack”）;
run（“32位”）;
setAutoThreshold（“默认黑暗”）;
run（“NaN Background”，“stack”）;

imageCalculator（“Divide create stack”，c3，c2）;
run（“Rainbow Smooth”）;
setMinAndMax（0.5,3）; //
重命名（“比率 - ”+标题）;
// Macro end here here

注意：最佳滚球半径取决于成像系统的空间分辨率（我们系统中的0.16μm/像素）和检查的酵母细胞的平均大小。因此，读者需要通过反复试验，根据自己的成像系统调整滚球半径。

图1.生成QUEEN比率图像。 A.表达QUEEN的芽殖酵母细胞图像的图像处理。右图显示ex409图像中指示的沿虚线的像素值的线轮廓。 B从（A）中所示的ex480和ex409图像计算的亮场图像和QUEEN比图像用三个不同的查找表表示。白色比例尺=5μm。
QUEEN比率的计算（延时成像）
1. 使用Fiji软件打开nd2文件作为hyperstack文件（多通道和多个时间帧）。
2. 通过选择矩形选择工具（参见图2A），绘制感兴趣区域（ROI）以在整个时间过程中包括细胞（以及必要时的后代细胞）。
3. 创建一个由ROI组成的新的hyperstack文件：图像 - ＆gt;重复即可。选中重复 hyperstack 复选框并保留所有频道（c）和相框（t）。
4. 将hyperstack拆分为每个通道堆栈（包含时间范围）：图像 - ＆gt;颜色 - ＆gt;拆分频道。
5. 使用如步骤A2中所述的滚球算法减去背景。处理堆栈中的所有图像。
6. 将QUEEN堆栈转换为带符号的32位浮点灰度：图像 - ＆gt;类型 - ＆gt; 32位
7. 显示上一个时间范围：图片 - ＆gt;堆栈 - ＆gt;设置切片。输入最后一个切片编号。
  注意：对于一堆32位图像，使用当前显示的图像（切片）计算最大和最小阈值，而不是为每个图像计算。使用最后时间框架评估阈值在本文所述的实验条件下是合适的。
8. 如步骤A4中所述创建阈值堆栈。
9. 按步骤A5-A8所述计算并保存QUEEN比率堆栈。
测量单个细胞中的平均QUEEN比率（单个时间点成像）
1. 使用斐济软件打开QUEEN比率图像（图2B）。
2. 通过选择矩形或多边形选择工具（图2A），绘制ROI以包含活细胞并在ROI管理器中注册ROI：分析 - ＆gt ;工具 - ＆gt;投资回报率经理。点击添加或按 t 注册投资回报率（图2C）。
3. 重复步骤2。
4. 设置度量：分析 - ＆gt;设置测量... ，选中平均灰度值复选框。
5. 选择存储在ROI管理器中的所有ROI并测量ROI中像素值（QUEEN比率）的平均值： ROI manager - ＆gt;取消选择 - ＆gt;测量
6. 将数据表保存为逗号分隔值（csv）格式的文本文件：激活结果窗口（图2D），然后文件 - ＆gt;另存为......
  
  图2.酵母细胞中平均QUEEN比率的测量。裂殖酵母细胞的测量结果如下所示。 A. 矩形或多边形选择工具。 B.裂殖酵母细胞的QUEEN比率图像。使用矩形（单元格＃1-4）或多边形（单元格＃5-7）选择工具绘制单元格的轮廓。 C. 投资回报率经理。 D. 结果窗口。白色比例尺=5μm。
注意：由于背景像素被分配给NaN值，因此在计算像素值的平均值时被忽略，因此不一定需要精确绘制单元轮廓。对应于细胞内部的平均QUEEN比率（以像素为单位）表示细胞的细胞质ATP水平。
测量细胞中的平均QUEEN比率（延时成像）
1. 使用斐济软件打开QUEEN比率堆栈。
2. 通过选择矩形或多边形选择工具，绘制ROI以包含单元格并在ROI管理器中注册ROI。
3. 如有必要，请重复步骤2。
4. 选择存储在ROI管理器中的ROI，并在整个时间序列中测量ROI中像素值的平均值： ROI manager - ＆gt;更多 - ＆gt;多重措施。选中测量所有切片和每行一行复选框。
5. 保存结果，如步骤C6所述。
数据分析
1. 将数据导入Microsoft ® Excel，并计算平均值和标准差。
2. 在Excel软件中使用未配对的单尾Welch的 t -test计算 P 值，并评估两组数据之间差异的显着性。
3. 使用KaleidaGraph软件将数据绘制为点图。点图的一个例子如图3所示。
  注意：以点图形式呈现数据似乎是传达分布特征的最有效方式。即使存在一些异常值，数据通常也遵循正态分布。
  
  图3.数据分析的例子芽殖酵母细胞中平均QUEEN比率的测量数据集用四种不同类型的图表表示。样本大小= 191个细胞，平均值= 1.67，方差= 0.0228，标准偏差（SD）= 0.151。 A.条形图。数据显示为总体的平均值±1×SD（误差条）。 B.点图。每个点对应于单元内的平均QUEEN比率。水平条表示人口的平均值。 C.箱子图。该图显示数据的第75个 th 和25个 th 百分位数（四分位数间距）作为框的上边缘和下边缘。方框中的水平条表示人口的中位数。晶须和圆圈分别表示1.5倍的四分位数范围和异常值。 D.直方图。数据显示为概率密度。具有与数据相同的均值和方差的正态分布显示为红色曲线。

笔记

基于（1）细胞内ATP浓度，（2）QUEEN对ATP的亲和力，和（3）成像系统的设置和条件，计算细胞中的平均QUEEN比率。因此，许多因素影响QUEEN比率，包括细胞培养条件，培养基批次，温度（如程序A中所述），荧光激发灯的功率输出和滤光器的条件（激发，用于荧光显微镜的发射和中性密度。这些因素每天略有不同，难以严格控制。因此，建议对在同一天进行的实验获得的数据进行比较，而不是汇集在不同日期进行的实验的数据。
读者需要针对自己的成像系统优化荧光显微镜的成像参数。由于约409nm的激发光具有细胞毒性并且可能影响QUEEN的荧光发射光谱，因此其强度和曝光时间需要最小化。建议对成像参数进行调整，以使2DG中耗尽ATP的细胞中的平均QUEEN比率（对应于最小平均QUEEN比率）计算为0.7-0.8。在优选条件下，QUEEN-2m的动态范围（最大和最小平均QUEEN比率之间的比率）预计将达到3.0倍（Yaginuma et al。，2014; Takaine et al。，2019）。
除了计算QUEEN比率之外，还可以通过运行宏来自动测量平均QUEEN比率（步骤C1-C5）。此外，可以批量处理数据分析中的步骤A1-A8和C1-C5：通过运行批量宏来自动且顺序地处理多个nd2文件。然而，细胞轮廓和批处理的自动绘制都超出了本研究的范围，因此被省略。这些宏可以根据要求从作者处获得。

食谱

100x氨基酸混合
1. 将L-谷氨酸10g，L-赖氨酸12g，L-蛋氨酸4g，L-苯丙氨酸5g，L-丝氨酸38g，L-苏氨酸20g和肌醇0.6g溶于1000ml去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
100x亮氨酸库存
1. 将L-亮氨酸11g溶于1,000ml去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
50x尿嘧啶库存
1. 将尿嘧啶2克溶解在1,000毫升去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
SC-His（根据Hanscho et al。，2012）
1. 混合YNB 3.4 g，葡萄糖20 g，100x氨基酸混合物10 ml，100x亮氨酸原液10 ml，50x尿嘧啶原液20 ml，加入1,000 ml去离子水
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
YPD琼脂平板
1. 将酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，Bacto-peptone 20 g和琼脂20 g混合在1,000 ml去离子水中
2. 在120°C下高压灭菌20分钟＆nbsp;
3. 将培养基倒入细胞培养皿（约20 ml /皿）
4. 使用前将板固化2-3天，用保鲜膜包裹，并在室温下保存
YELA琼脂平板
1. 将酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，硫酸胍0.04 g和琼脂20 g混合在1,000 ml去离子水中
2. 在120°C下高压灭菌20分钟＆nbsp;
3. 将培养基倒入细胞培养皿（约20 ml /皿）
4. 使用前将板固化2-3天，用保鲜膜包裹，并在室温下保存
100x 5低补充剂
1. 将硫酸腺嘌呤10 g，L-赖氨酸3 g，L-亮氨酸6 g，L-组氨酸2 g和尿嘧啶2 g加入1,000 ml去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
50x盐库存
1. 混合MgCl 2 ·6H 2 O 53.3 g，CaCl 2 ·2H 2 O 0.735 g，KCl 50 g和Na 2 SO 4 2克在1,000毫升去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并在室温下储存
1,000x维生素
将烟酸0.1 g，肌醇0.1 g，生物素0.1 mg和泛酸钠10 mg在100 ml无水乙醇中混合，保存在-20°C
注意：这些组件不会完全溶解。
10,000x矿物质
1. 溶解H 3 BO 3 0.05 g，MnSO 4 ·5H 2 O 0.057 g，ZnSO 4 ·7H 2 O 0.04 g，FeCl 3 ·6H 2 O 0.02 g，Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 0.016 g，KI 0.01 g，CuSO 4 ·5H 2 O 0.004 g，和柠檬酸0.1克在100毫升去离子水中
2. 通过过滤灭菌并在室温下储存
EMM
1. 混合邻苯二甲酸氢钾3g，Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 5.54g，葡萄糖20g，50x盐料20ml，和NH 4 Cl 5g，10,000ml矿物质0.1ml，在1,000ml去离子水中
2. 在120℃下高压灭菌20分钟并冷却
3. 加入1,000毫升维生素1毫升，储存在4°C
4. 使用前等分和预热
2DG媒体
与SC-His或EMM相同，除了添加3.28g 2DG（最终20mM）代替葡萄糖
涂有刀豆蛋白A的玻璃底盘
1. 将伴刀豆球蛋白A与2毫克/毫升的灭菌去离子水溶解并等分试样。溶液可以储存在-20℃
2. 将100μl的2mg / ml伴刀豆球蛋白A溶液置于玻璃底皿的玻璃表面上，并在室温下保持5分钟。
3. 吸取伴刀豆球蛋白A并用100μl灭菌的去离子水洗涤玻璃表面三次
4. 使用前将玻璃表面擦干10分钟。培养皿可以在4℃下储存
涂有大豆凝集素的玻璃底盘
1. 用2mg / ml灭菌的去离子水溶解大豆凝集素并等分试样。溶液可以在4℃下储存
2. 将5μl2mg / ml凝集素溶液置于玻璃底皿的玻璃表面上，并用移液管尖端涂抹溶液
3. 使用前将玻璃表面擦干10分钟。培养皿可以在4℃下储存

致谢

这项工作得到了作者的JSPS资助（15K18525,16H04781和19K06654）。这项工作还得到了日本群马大学分子与细胞调控研究所的联合研究计划的支持。该协议已经改编自Takaine 等人（2019）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Diaz-Ruiz，R.，Rigoulet，M。和Devin，A。（2011）。 Warburg和Crabtree效应：关于癌细胞能量代谢和酵母葡萄糖抑制的起源。< / a> Biochim Biophys Acta 1807（6）：568-576。
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