材料和试剂

组织标本在本议定书中进行了测试
1. 斑马鱼（Danio rerio）：整个动物，大脑（与任何年龄相容）＆nbsp;
2. 大鼠（Rattus或Mus musculus）：大脑（与任何年龄相容）＆nbsp;
3. 非人类灵长类动物（例如，Macaca mulatta）：大脑（与任何年龄相容）＆nbsp;
4. 人类：大脑（解剖捐赠，与任何年龄兼容）＆nbsp;
注意：为获得最佳效果，请使用PFA灌注大鼠（小鼠）或非人类灵长类大脑。＆nbsp;
CLARITY耗材和试剂
1. 1.5毫升Eppendorfs（USA Scientific，目录号：1615-5500）
2. 50毫升Falcon TM 管（Fisher Scientific，目录号：14-432-22）＆nbsp;
3. DWK Life Sciences Kimble TM 7 ml Solvent-Saver TM 闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：03-340-128）＆nbsp;
4. Thermo Scientific TM Nalgene TM Rapid-Flow TM 无菌一次性瓶顶过滤器，带PES膜，0.45μm（Fisher Scientific，目录号：09- 740-64A）＆NBSP;
5. Razorblades（Fisher Scientific，目录号：12-640）
6. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x，Fisher BioReagents，pH 7.4（Fisher Scientific，目录号：BP3994）（在室温下储存）＆nbsp;
7. 氢氧化钠溶液（1N）（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：SS2661）（室温下储存）
8. 福尔马林溶液，中性缓冲液10％（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）（室温下储存）
9. 200 mg / L MS222（见食谱）
  Tricaine（MS222）（Sigma-Aldrich，目录号：E10521-10G）（室温下保存）
10. 含有0.02％叠氮化钠（pH 7.4）的0.1 M PBS（参见配方）
  叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）（在室温下储存）
11. 多聚甲醛（PFA）固定溶液（4％PFA，1x PBS，）pH 7.4（见食谱）
  多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）（室温下保存）
12. CLARITY Solution（pH 8.5）（见食谱）
  1. 硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B7901）
  2. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-500G）
  3. 氢氧化锂一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：254274）
  注意：不含丙烯酰胺的溶液可缩短清除时间（Xu 等。，2017）。通过最佳的经心脏灌注，我们发现丙烯酰胺不是维持组织结构的必要组分。＆nbsp;
13. 0.05 M TBS（pH 8.0）（见食谱）
  Tris Buffer Saline（TBS）（Sigma-Aldrich，目录号：T6664）（室温下保存）
14. 2 M盐酸（HCl）（见食谱）
  盐酸，37％用于分析（HCI）（Acros Organics，目录号：450550025）（在室温下储存）
15. 0.1 M硼酸（pH 8.5）（见食谱）
免疫组化试剂
1. Click-iT TM EdU Alexa Fluor TM 488流式细胞仪检测试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：C10420）
  1. CuSO 4 （储存在4°C）
  2. 荧光染料叠氮化物（储存在-20°C）
  3. 反应缓冲液添加剂（-20°C保存）
  注意：如果Click-iT TM 套件不可用，请参阅Lindsey 等，2017，了解替代试剂。
2. 含有1％Triton X-100的0.05 M TBS（pH 8.0）（见食谱）
  Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）（室温下储存）
3. 抗体（表1和2）
  
  表1.本议定书中使用的一级抗体
  
  表2.本议定书使用的二抗
4. 柠檬酸钠缓冲液（室温下储存，参见食谱）
  柠檬酸三钠（二水合物）（Fisher Scientific，目录号：78-101-KG）
5. 50％甲酰胺/ 50％2x SSC（见食谱）
  一个。 Formamide认证ACS，Fisher Chemical（Fisher Scientific，目录号：75-12-7）（4°C储存）
  湾20x SSC缓冲液（Ambion，目录号：AM9763）（室温下储存）
6. EdU标签解决方案（见食谱）
成像用品和试剂
1. 铝箔（Sigma-Aldrich，目录号：326852）
2. 油漆刷＆nbsp;
3. 15毫升聚丙烯锥形管（Falcon，Fisher Scientific，目录号：352096）
4. Blu Tack（柔韧的粘合剂，可以很容易地形成任何形状，Amazon.com）
5. Pelco黑墙玻璃底盘（Ted Pella，目录号：14032-120）
6. Camco 25573 Bullseye Level（亚马逊）
7. 在0.1M PBS中的80％甘油溶液（参见食谱）
  甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7893）（在室温下储存）＆nbsp;

设备

显微镜：
1. 直立式立体显微镜（例如，Zeiss）
2. 共聚焦显微镜（例如，Leica SP8使用HC Fluotar 25x / 0.96 W VISIR物镜）
搅拌热板（例如，Fisher Scientific，目录号：6796220）＆nbsp;
化学罩＆nbsp;
Vibratome（例如，Pelco 102 Vibratome切片系统）＆nbsp;
摇杆（轨道或管摇杆）
孵化器（37°C）＆nbsp;
镊子（例如，Fisher Scientific，目录号：12000122）

软件

ImageJ /斐济（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达），Imaris的Bitplane，LasX（徕卡软件）

程序

CLARITY的组织处理和免疫标记
注释：处理来自此处描述的所有物种的组织的常见注释：

所有洗涤，清洁和染色程序包括将包含组织的小瓶或试管放置在试管中列出的整个期间的管摇杆上。如果使用轨道振动器，请大力摇晃。样品应完全浸入水中，并在摇杆上自由浮动。无论何时存在荧光团，都要用铝箔覆盖样品。
在协议的清除和甘油孵育步骤之后，一些组织更容易发生体积变化（扩张）（图1A）。如果尺寸变量在最终分析中具有重要性，则通过CLARITY前后的体积位移测量组织/器官的体积。
此处描述的所有动物程序均符合国际道德标准。在开始实验之前，请获得您的机构动物护理和使用委员会的批准。

斑马鱼
光学清晰的斑马鱼幼虫为发育遗传学，神经科学，癌症研究，代谢和传染病研究提供了杰出的脊椎动物模型（Brothers et al。，2011; Wolman and Granato，2012; Palha et al。，2013; Fior et al。，2017; Kamel和Ninov，2017; Migault et al。，2018; Vanwalleghem et al。，2018）。随着幼虫继续成熟，它们会形成限制透明度并干扰成像的色素细胞。缺乏色素的转基因动物的使用（White et al。，2008; Antinucci et al。，2016）和CLARITY技术允许在整个成年斑马鱼或其中进行可视化个体器官（Cronan et al。，2015;Frétaud et al。，2017; Lindsey et al。，2017; Kaufman et al。，2018）。
＆NBSP;我们使用成年斑马鱼来研究成人神经发生。每天，成千上万的神经干细胞或祖细胞在成年斑马鱼脑的16个神经源性壁龛以及脊髓和肠道中进行细胞分裂。我们发现，在大脑中，细胞分裂周期遵循昼夜节律模式（Akle et al。，2017）。大多数新生细胞最终分化为特化神经元（Zupanc et al。，2005; Grandel et al。，2006; Kaslin et al。，2009; Chapouton et al。，2010）。事实证明，CLARITY是整个大脑中干细胞，祖细胞和成熟神经元定量的最佳策略（见视频1）。
＆NBSP;斑马鱼是研究成人神经发生动力学及其在正常和病理衰老中的变化的优秀模型（Stankiewicz et al。，2019）。为了跟踪干细胞，神经祖细胞及其后代的动力学，我们使用脉冲追踪技术，使用BrdU脉冲，接着是EdU追踪。以下方案描述了对S期标志物（BrdU和EdU）和M期标志物（pH3）进行三重标记的程序。如果仅标记EdU，则按照第1天的步骤1和7进行第二天的0.05 TBS（2 x 15分钟）洗涤。仅限BrdU，请遵循第1天的第1-6步和第2-9天的步骤3-7。

视频1.在清除的成年斑马鱼脑中的S期标记物EdU的3D共聚焦成像。在2小时EdU（绿色）脉冲之后（尺寸：2,000μm×3,600μm×1,100μm）。
注意：脉管系统中的绿色自发荧光，特别是在视顶盖和小脑中突出。

用于CLARITY的斑马鱼组织的制备
1. 用过量的MS222安乐死鱼（参见食谱1）或放入冰冷的水中直至鳃盖运动停止。＆nbsp;
2. 该方案可用于成像整个成年斑马鱼而无需解剖或单个器官和组织切片。下面描述的每个程序的时间将根据样本的厚度而增加。为了处理脑组织，用新的剃刀刀片切割鳃后面的头部。避免CNS受到任何压迫或撕裂。＆nbsp;
3. 在4°C的1.5 ml Eppendorfs中将头部固定在4％PFA中过夜（参见配方2）。＆nbsp;
4. 根据Gupta和Mullins，2010年，使用镊子在立体显微镜下解剖大脑。＆nbsp;
5. 将脑转移到含有0.1M PBS和0.02％叠氮化钠的1.5ml Eppendorf管中（见配方3）并在4℃下储存，直至使用。每两周更换一次存储解决方案。这样，样品可以存放长达6个月。
  ＆nbsp;
斑马鱼脑的CLARITY处理（图1A）
1. 从缓冲液中除去大脑（含有0.02％叠氮化钠的0.1M PBS）并将最多6个脑转移到含有5ml 0.05M TBS的7ml闪烁瓶中（参见方法4）。洗1小时。＆nbsp;
2. 使用相同的闪烁瓶替换TBS和CLARITY溶液（参见配方5）。＆nbsp;
3. 将大脑在37°C孵育30分钟。在室温下摇动4-6天，直到组织完全透明（图1A）。
  
  图1.不同物种大脑中的光学组织清除。 A.固定，清除和甘油孵育后的斑马鱼脑。 B.大鼠脑半球，矢状切1毫米厚，前（左）和后清除（右）。 C.非人灵长类动物（NHP）枕叶部分（主要视觉区域，V1），1mm厚，前（左）和后清除（右）。 A，B以毫米为单位，C，英寸在顶部。脑定向：A，前部; P，后部; D，背; V，腹侧。注意清算后的体积变化。＆nbsp;
CLARITY处理的斑马鱼组织中蛋白质的免疫标记
第1天：整个斑马鱼脑的BrdU / EdU免疫组织化学
注意：在执行以下步骤后，大脑会再次变为不透明，但会在协议中稍后重新获得透明度，如下所示。
1. 用0.05M TBS（2×1h）洗涤，从组织中完全除去CLARITY溶液。
2. 在37℃下孵育50％甲酰胺/ 50％2x SSC（参见配方6）1小时45分钟。＆nbsp;
3. 用0.05M TBS（2×15分钟）洗涤。
4. 在37°C下孵育2 M HCl（参见配方7）30分钟。＆nbsp;
5. 用0.1 M硼酸（参见配方8）冲洗8分钟。＆nbsp;
6. 用0.05M TBS（2×15分钟）洗涤。
7. 在EdU Click-iT ®反应混合物中孵育，在室温下用铝箔覆盖30分钟，然后在4℃下孵育过夜（见配方9）。
注意：对于那些与BrdU不同，不需要抗原修复的抗体（步骤2-5），仅遵循第1天第1步，并立即进入下面的第2-9天方案。

第2-9天：整个斑马鱼脑的抗体免疫组化
1. 用0.05M TBS（2×15分钟）洗涤。
2. 添加一抗：抗BrdU Alexa Fluor 647（标记为S期增殖; 1：200）。＆nbsp;
3. 在4°C下在溶液中孵育4天。在摇动器上搅拌期间，样品应完全浸没并自由浮动在溶液中。保持样品用铝箔覆盖。＆nbsp;
4. 用0.05 M TBS（2 x 1 h）洗涤。＆nbsp;
5. 在室温下将二抗驴抗兔Alexa Fluor 555（1：750）在0.05M TBS中孵育过夜。＆nbsp;
6. 在室温下用0.05M TBS洗涤2天，以减少非特异性染色。＆nbsp;
7. 对于长期储存，在4°C下保持0.05 M TBS并用铝箔覆盖。
该基本方案可与多种抗体并行使用。例如，我们使用抗磷酸组蛋白H3（Ser10）（pH3）（有丝分裂标记; 1：500）或HuC / HuD（新神经元标记; 1：500）抗体同时染色BrdU和EdU。为此，我们在第2-9步第5天添加pH3抗体（或HuC / D抗体）。＆nbsp;

哺乳动物
在研究哺乳动物胚胎和成人大脑的神经源性生态位中的神经发生时，缺乏组织透明度是主要障碍（Stankiewicz et al。，2019）。 CLARITY允许对全脑标本中的多个细胞进行深层组织荧光成像（Chung et al。，2013）。重要的是，CLARITY还允许树突和轴突形态的可视化，包括与神经疾病相关的神经元过程的变化，以及正常衰老。例如，在阿尔茨海默氏病中，大规模细胞死亡导致较短的，较少分枝的顶端树突（Buell和Coleman，1981）和树突棘的数量减少（el Hachimi和Foncin，1990; Ferrer和Gullotta，1990）。类似地，在帕金森氏病中，纹状体神经元具有截短的树突和减少数量的树突棘（McNeill 等人，，1988）。相反，中度等级的亨廷顿氏病显示树突分支和刺的数量增加，并且在疾病的后期阶段观察到截短的树突状乔木和脊柱损失（Ferrante et al。，1991 ）。在正常衰老中，例如，在较老的恒河猴中，Brodmann Area 46中长突出神经元的树突变短且不太复杂，前额叶皮质中的树突失去脊柱和突触（Coskren et al 。，2015）。可视化树突结构中的这种变化提供了对病理状况的本质的见解。然而，从数字组织图像量化枝晶结构目前是一个高度劳动密集型的过程，需要大量的手工标记，并且在大型项目中完成极具挑战性（Helmstaedter et al。，2013）。 CLARITY处理的组织允许优化3D成像和树枝状结构和形态的精确量化。因此，可以完整地分析大的感兴趣区域甚至整个大脑结构，同时避免典型的分段脑，例如，中断轴突投射，转弯或分支，或细胞重复计数等问题。在这里，我们描述了我们在研究啮齿动物（图2和图3）中的轴突形态和连接以及非人灵长类动物（NHP）脑中的微柱结构时所遵循的协议（图4和图5）。

的啮齿动物

为CLARITY准备啮齿动物大脑
1. 进行标准的心脏灌注，首先使用冷冻的0.1 M PBS（pH 7.4），然后在37°C下使用4％PFA溶液。
  注意：冷冻PBS用于清除整个血管系统的血液。此后，37°C PFA用于血管舒张，可以更有效，更均匀地固定脑组织，提高免疫组化的整体质量（Fix et al。，2000 ）＆NBSP;
2. 根据Gage 等，2012年，将头脑从颅骨移除并在4°PFA溶液中在4％PFA溶液中后固定24小时。＆nbsp;
3. 将大脑转移到含有0.02％叠氮化钠的0.1 M PBS中，并在4°C下储存，直至使用（见配方3）。我们通常使用一个半球块。
4. 每两周更换一次存储解决方案。这样，样品可以存放长达6个月。
啮齿动物组织的CLARITY处理（图1B）
1. 从缓冲液中取出一个脑并转移到含有0.05M TBS的50ml Falcon管中。在室温下放置摇杆5小时。＆nbsp;
2. 处理大鼠整个大脑或解剖成较小的立方体，或在Vibratome上切割厚的部分，0.5 mm-5 mm。＆nbsp;
3. 在CLARITY溶液中在37℃下在50ml Falcon管中孵育脑组织4-10天（取决于组织的厚度），直到组织透明（图1B）。对于成年大鼠脑，一个半球在大约6天内清除。加倍组织厚度通常需要加倍孵化时间。
CLARITY处理的啮齿动物组织中蛋白质的免疫标记（图2和3）。
注意：抗体质量和穿透组织的速率是可变的。在我们的经验中，以相对大量表达的蛋白质需要更少的孵化时间。
1. 用0.01 M PBS洗涤组织24-48小时，以完全去除CLARITY溶液。＆nbsp;
2. 将组织转移到闪烁瓶或新鲜的falcon管中，并添加一抗（s）溶液：抗MAP2（树突标记物; 1：500）和抗NeuN（神经元标记物1：500）在0.05 M TBS中含1％ Triton X-100（见食谱10）。＆nbsp;
3. 在室温下孵育12小时，然后在4℃下孵育4天。＆nbsp;
4. 用摇床上的0.05 M TBS在室温下冲洗组织12小时。＆nbsp;
5. 在第二抗体溶液中孵育：例如，抗兔Alexa Fluor 488（1：500），抗小鼠Alexa Fluor 568（1：500）在0.05 M TBS中含1％Triton X -100。在室温下摇动一夜，然后在4°C下保持2天。
6. 在室温下用0.05M TBS洗涤2天以减少非特异性染色。对于长期储存，保持在4°C的0.05 M TBS覆盖铝箔长达一个月。
图2. CLARITY处理的小鼠海马。 A.小鼠海马齿状回（Dg）重建，其中轴突用SMI-312（绿色）和具有NeuN（红色）的神经元标记。块尺寸：1,700μm×700μm×500μm。首先采集高分辨率的单个堆栈，然后缝合以进行3D渲染和可视化。图像是在Leica SP8共聚焦上获得的，具有25x水浸物镜。 A中的白色框在B（轴突，绿色）和C（神经元，红色）中扩大，其重叠在D中显示。齿状回神经元内轴突的分叉是可见的。（比例尺：B，C和D中60μm）

图3.来自大鼠脑的CLARITY处理组织，揭示纹状体和皮质中的轴突形态。大脑脑冠状块以NF-H染色，呈绿色。 A.纹状体（Str）和伞状（Fi）中的轴突束（SMI-312，绿色）。可以在左上角观察隔垫。 B.大脑皮质的基底表面，其中可以观察到胼call体下面的投射纤维下降到纹状体中。 C.大鼠小脑叶片的轴突形态。箭头显示浦肯野细胞周围的轴突。可以观察到颗粒层（G1）和分子层（M1）中的轴突形态的差异，以及白质中的轴突（Wm）。图像是在Leica SP8共聚焦上获得的，具有25x水浸物镜。（比例尺：A中为1,000μm，B和C中为200μm）。＆nbsp;

PRIMATES：非人类灵长类动物（NHP）和人类

用于CLARITY的灵长类动物组织的制备
1. NHP ：用冷冻的0.1M PBS（1L）进行标准的心脏灌注，然后在37℃下进行温热的4％PFA溶液（8L）。
  注意：冷冻PBS用于有效清除整个血管系统的血液。此后，37°C PFA用于提供血管舒张，使脑组织更有效和均匀固定，提高后续免疫组化处理的整体质量（Fix and Garman，2000）。＆nbsp;
2. NHP ：根据Mortazavi et al。，2018年，从头骨中移除大脑，并在4°C的4％PFA溶液中将整个大脑后固定24小时。
3. 人类：脑组织保持在10％福尔马林溶液中。
注意：其余程序对所有灵长类动物都是通用的，NHP和人类。
1. 根据感兴趣的解剖区域将大脑解剖成块或切片。我们通常使用Vibratome准备一个半球的块或部分，厚度为0.5-1 mm。＆nbsp;
2. 将脑块或切片转移到含有0.1M PBS和0.02％叠氮化钠的50ml Falcon管中，并在4℃下储存，直至使用（见配方3）。每两周更换一次存储解决方案。这样，样品可以存放长达6个月。
CLARITY处理灵长类脑组织（图1C）
1. 从缓冲液中取出脑组织，转移到含有0.05M TBS的50ml Falcon管中。在室温下放置摇杆5小时。＆nbsp;
2. 将组织在37℃下在摇瓶中在含有CLARITY溶液的50ml Falcon管中孵育4-15天（取决于组织的厚度），直到组织透明（图1C）。由于非人类灵长类动物（NHP）大脑中的脂质含量增加，特别是人类（Rouser et al。，1972），与斑马鱼或啮齿动物大脑相比，0.5 mm的切片大约清除在约6-8天内4天和1毫米厚的切片。一个5毫米的块/部分需要大约1个月才能清除。
CLARITY处理的灵长类动物组织中蛋白质的免疫标记（图4和5）
注意：灵长类动物脑组织中的高脂质含量和固定长度，固定剂类型，感兴趣区域和块大小等因素会影响组织清除率。某些蛋白质可能会被甲醛中的长期固定所掩盖。为了增加抗原性，使用柠檬酸钠缓冲液步骤C2（参见方法11）。抗体质量和渗透到组织中的速率是可变的。在我们的经验中，以相对大量表达的蛋白质需要更少的孵化时间。
1. 用0.01M PBS洗涤组织48小时，以完全除去CLARITY溶液。
2. 福尔马林固定的脑组织，特别是那些长时间保持固定剂的脑组织，需要抗原修复以增加抗原性。为此，将样品转移到闪烁瓶或新鲜的falcon管中，并加入柠檬酸钠缓冲液（参见配方11）。在室温下，在摇杆上孵育20-24小时。在摇臂上用0.01M TBS洗涤组织12小时。
3. 在含有1％Triton X的0.05 M TBS中，在一抗溶液中，例如，抗MAP2（树突的标记; 1：500）和抗NeuN（神经元标记1：500）孵育-100群组。
4. 在室温下在一抗（或几种抗体）溶液中孵育12小时，然后在4℃下孵育4天。＆nbsp;
5. 在室温下用0.05M TBS冲洗组织12小时。
6. 将组织孵育在二抗溶液中，例如，抗兔Alexa Fluor 488（1：500），抗小鼠Alexa Fluor 568（1：500）在0.05 M TBS中含1％ Triton X-100。在室温下摇动一夜，然后在4°C下用铝箔覆盖4天。＆nbsp;
7. 在室温下用0.05M TBS洗涤2天，以减少非特异性染色。＆nbsp;
8. 对于长期储存，请在4°C下保持0.05 M TBS。
图4. CLARITY处理的恒河猴脑组织，显示神经元，树突和轴突。来自扣带皮层的厚块，三重标记为MAP2（树突，红色），Neun（神经元，洋红色）和NF-H（轴突，绿色）（尺寸：1,700μm×3,200μm×500μm）。 A.与其局部树突（红色）和轴突（轴突）相关的皮质微柱。 B和C.B显示扣带皮层的层2,3和致密层4，并且在C中具有更高的放大倍数，其中树枝状束可以单独解析（白色箭头）。图像是在Leica SP8共聚焦上获得的，具有25x水浸物镜。（比例尺：B中100μm，C中20μm）。

图5. CLARITY处理的人类小脑和运动皮层，显示神经元和轴突投影。 A.人类小脑，厚切片：NeuN（颗粒细胞神经元，红色）与SMI-312（泛轴突，绿色）可以在叶片中观察到轴突形态;箭头指向浦肯野细胞层（尺寸：600μm×600μm×200μm）。 B.人体运动皮层，厚部分：用MAP2染色的皮质层3的3D叠层图像（红色）;箭头指向锥体神经元（350μmx350μmx150μm）。

剥离抗体并重新组织（所有物种共有）

抗体和EdU Click-iT ®可以脱色（剥离），允许在同一组织中评估多个标签（Murray et al。，2015; Phillips 等人，2016）。

将组织置于CLARITY溶液中，在37°C下在轨道振荡器或管摇杆上放置9-18天。＆nbsp;
从孵化的第10天开始，每隔2天检查污渍是否已完全消除。为此，从摇杆中取出一个代表性样品，在共焦显微镜下拍摄图像，以记录脱色过程的进展。＆nbsp;
一旦完成脱色，在室温下在轨道振荡器或管摇杆上将组织在TBS中洗涤4小时。＆nbsp;
如上所述，重复免疫组化方案。

CLARITY处理组织中的图像采集和量化（所有物种共有）（图2，视频1）

注意：根据免疫组织化学方案，清除的组织变得有些不透明。为了在共聚焦成像之前改善折射率，将组织在0.1M PBS（配方12）中的80％甘油溶液中孵育，直至透明（图1A）。整个斑马鱼脑需要大约10-15分钟才能清除。对于0.5 mm脑切片，啮齿动物组织需要30-60分钟，NHP或人体组织需要1-2小时才能进行成像。时间与部分厚度成比例增加，1毫米厚的人脑部分需要4小时才能清除。

用于成像的组织准备
1. 倒置Pelco黑色墙壁玻璃底盘并将Blu Tack推出一圈以完全封闭组织（参见图6A）。＆nbsp;
2. 在圆圈内加入约500μl80％甘油溶液（见配方12），用刷子/镊子将组织定位在孔的中心。＆nbsp;
3. 在顶部固定Pelco黑墙玻璃底盘。注意不要压扁脑组织以保持3D表现并确保没有气泡。密封良好，以防止成像过程中组织脱水。＆nbsp;
4. 为避免图像采集过程中的眩光，使用圆形校平器确保Pelco碟式三明治的水平位置（参见成像耗材;图6B和6C）。
5. 将Pelco盘式三明治放在显微镜载物台上。＆nbsp;
6. 将水加到Pelco盘的顶部，以便浸入物镜。＆nbsp;
7. 获取包含整个感兴趣区域的z-stack图块。
  
  图6.用于显微镜检查的Pelco培养皿。 A.带有Blu Tack的倒置Pelco培养皿（左）和直立的Pelco培养皿（右）。 B. Pelco盘三明治与圆形校平器在中间，顶视图。 C. Pelco菜三明治，侧视图。
后处理数据重建和量化（图7）
1. 使用Leica本机软件或带有3D拼接插件的FIJI-JAVA 6（Preibisch et al。，2009）拼接z-stack图块，例如。＆nbsp;
2. 将生成的文件传输到运行Bitplane-Imaris程序的计算机。＆nbsp;
3. 隔离与包含感兴趣区域的结构对应的z-stack的一部分，并另存为单独的文件。＆nbsp;
4. 在斐济计数软件上打开文件。＆nbsp;
5. 运行斐济3D对象计数器并分离出通道。
6. 根据体素体积消除假阳性计数（像素 3 ）。
7. 确认共定位
  注意：共定位像素将具有相同的x，y，z坐标。＆nbsp;
图7.使用Imaris by Bitplane进行3D细胞计数和物理分析。左图，A和C代表染色细胞的原始图像。右图，B和D显示程序创建的黄色球体，注释A和C中的每个可见细胞。在CLARITY处理的人脑组织切片（500μm厚）中，神经元标记有NeuN（红色）。 A中的箭头对应于B. C.斑马鱼小脑在CLARITY处理的全脑制备中指出的注释球体。按照脉冲追踪协议（Stankiewicz et al。，2019），划分细胞用BrdU（红色）和EdU（绿色）标记。 C和D中的箭头分别对应于程序的相同EdU标记的细胞或它们的注释。除了细胞在堆叠中的位置（x，y，z坐标）之外，程序还提供细胞直径，体积，强度和细胞间距离的数据。

食谱

MS222（200 mg / L）（1 L）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>MS222
200毫克
坦克水
1 L
准备新鲜
多聚甲醛（PFA）固定溶液（4％PFA，1x PBS，）pH 7.4
注意：在啮齿动物和NHP组织使用24小时内准备。通常使用储存的冷冻PFA，然而，长期储存4％PFA会增加转化为甲醛。因此，建议始终使用新鲜配制的PFA。
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：320px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>PBS（10x）
100毫升
PFA
40克
dH 2 O
~900毫升
1. 在化学罩下准备
2. 在搅拌的热板上将800ml 1x PBS加热至60℃
3. 将PFA缓慢加入1x PBS中，在热板上搅拌
4. 通过滴加NaOH逐渐升高pH直至PFA溶解
5. 冷却溶液然后过滤灭菌（0.45μm）
6. 用1x PBS将体积调至1L
7. 用HCl将pH调节至7.4
8. 分装1.5 ml eppendorfs，-20°C保存1年（仅用于斑马鱼）
含有0.02％叠氮化钠（pH 7.4）的0.1 M PBS（在4°C下储存长达4周）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>PBS（10x）
100毫升
叠氮化钠
200毫克
dH 2 O
900毫升
使用NaOH或HCl调节pH
0.05 M TBS（pH 8.0）（在室温下储存长达2周） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>TBS
16克
dH 2 O
1 L
CLARITY Solution（pH 8.5）（在室温下储存长达6个月）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>0.2 M硼酸
12.37克
4％十二烷基硫酸钠（SDS）
40克
20 mM氢氧化锂
0.84克
dH 2 O
最高1升
使用NaOH或HCl调节pH
50％甲酰胺/ 50％2x SSC（每次准备新鲜）＆nbsp;
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Formamide
25毫升
20x SSC
2.5毫升
dH 2 O
22.5毫升
最后一卷
50毫升
2 M盐酸（HCl）（每次准备新鲜）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>HCl
10毫升
20x SSC
40毫升
dH 2 O
50毫升
在化学通风橱下准备，在水中加入酸。
0.1 M硼酸（pH 8.5）（在室温下储存长达6个月）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>硼酸
2.5克
dH 2 O
400毫升
在化学通风橱下准备，加水加水
使用NaOH或HCl将pH调节至8.5
EdU标签解决方案（每次准备新鲜）＆nbsp;
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>PBS（1x）
875μl
CuSO 4
20μl
荧光染料叠氮化物
5μl
反应缓冲剂上瘾
100μl
含有1％Triton X-100的0.05 M TBS（pH 8.0）（在室温下储存长达2周）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>TBS
16克
Triton X-100
10毫升
dH 2 O
1 L
柠檬酸钠缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.5％Triton X-100，pH 9）（在4°C下储存4周）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>柠檬酸三钠（二水合物）
2.94克
Triton X-100
5毫升
dH 2 O
1000毫升
使用NaOH或HCl调节pH
在0.1M PBS中的80％甘油溶液（在室温下储存长达4周）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>PBS（10x）
10毫升
甘油
80克
dH 2 O
90毫升

致谢

这项工作得到了Chaikin-Wile基金会和NSF PHY 1505000的资助。该协议由Chung et al。，2013修改。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

组织作为斑马鱼（＃14366），啮齿动物和NHP（＃14291）正在进行的其他研究的一部分获得。人体组织获自Boston University Medical Campus（BUMC）的Anatomical Donor Program。将动物饲养在BUMC的实验动物科学中心。该设施完全获得实验动物管理评估协会的认可，其中所有程序均严格符合国家卫生指南研究所，生命科学实验动物资源委员会研究所并经BUMC机构动物护理和使用批准。委员会。

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