材料和试剂

用于点样设备的玻璃尖端（PDC 70 Piezo Dispense Capillary，Scienion，Germany）
显微镜载玻片（75 mm x 25 mm x 1 mm）（VWR，丹麦，目录号：48311-703）
显微镜载玻片盖，Gene框架（Thermo Fisher Scientific，丹麦，目录号：AB0576）
负色调光刻胶THB 151N（JSR Micro NV，比利时），储存在阴凉（4-20°C）和黑暗处
硅（Si）晶片（Sigma-Aldrich，丹麦，目录号：646687-1EA，CAS号：7440-21-3）
AZ726 MIF开发人员（MicroChemicals，德国）。储存在阴凉（4-20°C）和黑暗的地方
丙酮（Sigma-Aldrich，丹麦）
TOPAS 5013L COC颗粒（Advanced Polymers，德国），在室温下储存
DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Germany），在室温下储存
Milli-Q水（丹麦Sigma-Aldrich），储存在2-8°C
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，Denmark），储存在2-8°C
Phusion Human Specimen Direct PCR Kit（Thermo Fisher Scientific，丹麦，目录号：F150BID），储存于-20°C
Saline Sodium Citrate Buffer，20x浓缩液（Sigma-Aldrich，丹麦，目录号：SRE0068），储存于2-8°C
Triton X-100（Sigma-Aldrich，Denmark，CAS号：9002-93-1），在室温下储存
Tween-20（Sigma-Aldrich，Denmark，CAS号：9005-64-5），在室温下储存
引物（表1）：购自DNA Technology（丹麦奥胡斯）
注意：所有引物均在Milli-Q水（Sigma-Aldrich，Denmark）中稀释至终浓度为100μM，并在-20°C下保存。

表1.引物序列

设备

孵化器（赛默飞世尔科技，目录号：50125590）
旋涂机（Karl Suss RCD8，Suss Microtec德国）
热板（Thermo Fisher Scientific，目录号：RC2235Q）
AXXIS-Co-Sputtering（英国Kurt J Lesker）
镍（Ni）电镀（Microform.200，Technotrans）
sciFLEXARRAYER S5（德国Scienion）
注塑商（ENGEL Victory 80/45 Tech）
定制的UV曝光旋转台（如下所示）（图2）

图2.自由角度光刻的旋转台
UV曝光后的Si晶圆开发系统（Gamma 2M Developer，Suss Micro-Tech，德国）
表面轮廓仪（Dektak XTA手写笔轮廓仪，丹麦布鲁克）
BioAnalyzer 4F / 4S扫描仪（LaVision Biotec GmbH，Bielefeld，Germany）
Nanodrop 1000（Thermo Scientific，USA）
ProFlex TM 2x平板PCR系统（Thermo Fisher Scientific，USA，目录号：4484078）＆nbsp;
扫描电子显微镜（SEM）（FEI Quanta 200，USA）

软件

Gwyddion 2.20分析软件（ http://gwyddion.net/download/2.20/ ）
ImageJ软件（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）

程序

芯片上三维微结构阵列的制作
1. 取光洁的Si晶片和用光刻胶聚合物旋涂（THB 151N，163.56×g [1200rpm]），得到约50μm厚的抗蚀剂层。＆nbsp;
2. 为了获得100和150μmSAF结构的更高厚度，重复旋涂步骤2-3次。
3. 旋涂后，在70°C下烘烤硅片3-5分钟。＆nbsp;
4. 选择光刻胶涂层的厚度以获得纵横比约为1的结构，这对于注射成型是理想的。
5. 执行边缘焊珠去除，以在4英寸晶圆区域内获得±2μm的厚度均匀性（图1A）。通过旋涂机的机械臂通过在边缘连续滴下丙酮溶液（以溶解光致抗蚀剂）并同时以1000rpm连续旋转来进行边缘珠粒去除。由于晶片旋转，溶液向外移动，因此不会影响硅晶片的其余部分。
6. 使用硬接触模式，使用直径范围为50至200μm的圆孔掩模图案执行FAPL工艺。
7. 将晶片装入倾斜阶段，以给定的倾斜角度固定，并以15 rpm的速度顺时针旋转，同时在整个紫外线照射下输送1500 mJ / cm 2的剂量。
  注意：光刻胶的折射率和最终SAF结构上60度倾斜的必要性导致固定的倾斜角θrot= 52.3度（图1B）。
8. 在UV暴露之后，使用自动化设备（Gamma Cluster System 2M，Suss MicroTech）通过将它们暴露于10个AZ726 MIF显影剂水坑60秒来开发晶片。之后，在最终干燥之前用去离子水冲洗晶片。
9. 溅射镍钒（Ni / V）= 80 nm或（铬（Cr）/金（Au）= 20/60 nm金属Cr / Au种子双层以及溅射1μm厚的铝（Al）牺牲层（Kurt J Lesker））（图1C）。
10. 通过3个步骤增加电流，分三步进行Ni电镀（Microform.200，Technotrans）。电流在前15分钟内从0到0.5 A线性上升，在接下来的15分钟内从0.5到1.5 A.一旦电流达到17 A，保持恒定6小时，然后以慢速将其降至0。电流密度不应突然下降，以最大限度地减少残余应力，并达到350μm的厚度。＆nbsp;
11. 电镀后，在80℃的KOH浴中蚀刻出Si。然后将剩余的Ni垫片切割成所需尺寸，以便安装在注塑机（ENGEL Victory 80/45 Tech）中。
12. 使用TOPAS 5013L COC颗粒进行聚合物芯片的注塑成型。聚合物在注塑机的料斗中干燥（气流在90℃下）并除去额外的水分。
13. 当聚合物离开料斗到喷嘴达到300℃时，注塑缸的温度从250℃逐渐升高。如视频1所示，熔融COC以21cm 3 / s的速度和600巴的压力注入模具中。
14. 当进行脱模时，模具温度可以从155℃（在注射时）到103℃变化（Variotherm工艺）。此外，施加注射成型的填充压力（600巴），注射成型6秒，以将结构制成微流体装置。最终的芯片尺寸为显微镜载玻片（76 mm x 25 mm x 1 mm）。
  
  视频1.注塑机的示意图，介绍成型过程
15. 通过sciFLEXARRAYER S5（SCIENION，德国）对阵列中的每个SAF结构执行精确定位。取一个玻璃尖（类型1）并在每次更换样品之前和之后将其用于洗涤步骤以便在软件程序中进行定位。该过程由SCIENION开发的软件自动控制。
固相PCR
1. DNA制备
  1. 肺炎链球菌来自丹麦技术大学国家食品研究所（DTU-Food）的培养物保藏中心。＆nbsp;
  2. 隔离 S.使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，德国）按照供应商的指示进行肺炎基因组DNA。＆nbsp;
  3. 用Nanodrop 1000（Thermo Scientific，USA）测定DNA浓度。以ng /μl和质量分数（260/280和260/230）记录DNA浓度。＆nbsp;
  4. 将DNA保存在-20°C以备后用。
  5. 报告您用于高质量DNA的截止值。 260/280比率小于1.7可能表明DNA质量差。大多数研究的截止值为260/280和260/230。
2. 引物
  为了建立模型以确认SPAP PCR对FAPL产生的SAF结构进行病原体检测的性能，我们选择了一对正向和Cyanine-3（Cy3）标记的反向引物（表1）来扩增肺炎球菌溶血素基因为 S的目标序列。在液相中检测肺炎（Greiner et al。，2001）。来自国家生物技术信息中心（NCBI）的引物-BLAST用于设计嵌套探针作为基于用于SP-PCR的肺炎球菌溶血素基因序列的表面引物。来自 S的随机序列。化脓性基因组用作非靶扩增的表面引物。
3. 固定表面引物
  1. 制备100μl含有50μM聚（T）聚（C）标记的表面引物的表面引物溶液，所述表面引物含有5x SSC和0.004％Triton X-100，终浓度。
  2. 通过sciFLEXARRAYER在20℃，65％湿度下在聚合物芯片（COC）的室内的SAF结构（ф50nm）前面点1滴（220μl）表面底漆溶液。
  3. 在室温下干燥微芯片。
  4. 用波长为254nm的紫外线照射处理微芯片，功率为3mW / cm 2 <2> 10分钟（Stratalinker 2400，Stragtagene，CA，USA）直接固定聚（T）聚（C）标记的DNA寡核苷酸在塑料表面上没有任何表面修饰（Sun et al。，2012）。
  5. 将微芯片放入含有0.1x SSC的板中5分钟，然后用Milli-Q水冲洗，并在37°C的培养箱中干燥。
  6. 用BSA 2.5 mg / ml处理芯片30分钟，然后用Milli-Q水冲洗并在培养箱中干燥。
4. 固相PCR
  1. 用基因框架（Thermo Fisher Scientific）粘合并固定微芯片，在固体支持底漆固定的SAF阵列周围形成25μl反应室。＆nbsp;
  2. 使用带移液管吸头的移液器将25μlPCR主混合物加载到基因框架中，然后用盖玻片密封。 PCR主混合物包含：
    2 ng DNA模板
    1x Phusion ®人体标本PCR缓冲液（Thermo Fisher Scientific）
    150 nM正向和1,500 nM反向引物
    0.05 U /μlPhusion人标本DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific）
  3. 在ProFlex TM 2x平板PCR系统（Thermo Fisher Scientific）中进行固相PCR，热循环如下：94°C 3分钟，然后30个循环94°C 20秒，60°C，20秒，72°C，20秒。
  4. 完成PCR后，用4x SSC洗涤室5分钟，用含1％Tween-20的0.1x SSC洗涤5分钟，然后用去离子水冲洗并在室温下干燥。
  5. 使用具有200毫秒快门时间的BioAnalyzer 4F / 4S扫描仪（LaVisionBioTec GmbH，Bielefeld，Germany）扫描芯片进行数据分析（图3）。
  图3. SP-PCR技术的示意图

数据分析

三维微结构的表征
1. 在高真空条件下使用3-10 KV束线进行扫描电子显微镜（SEM）以表征3D微结构，如图4所示。
  
  图4.使用FAPL工艺使用光学显微镜和SEM表征制造的SAF阵列。（A，E，I）是SAF结构阵列的光学图像。通过注射成型转移SAF结构后聚合物芯片上的SEM图像，50μm尺寸（B，C，D），100μm（F，G，H）和150μm（J，K，L）。 br />
2. 使用表面轮廓仪（Dektak XTA测针分析仪，Bruker）和Gwyddion 2.20分析软件分析侧壁表面的表面粗糙度。图5显示了具有极低表面粗糙度（Ra：0.5±0.1μm）的SAF结构。
  
  图5. SAF的表面特征。注塑后聚合物芯片上SAF结构的SEM图像（A，B）FAPL制备的SAF（L-SAF）表面轮廓和L-SAF的平均表面粗糙度（C）。
3. 使用具有200-ms快门时间的BioAnalyzer 4F / 4S扫描仪（LaVisionBioTec GmbH，Bielefeld，Germany）在点样DNA探针或固相PCR后扫描微芯片。使用ImageJ软件分析荧光强度（Schneider 等人，2012）（图3,6和7）。将圆调整为SAF的大小，并计算荧光点内的像素的灰度级的平均值。围绕圆绘制正方形，并将平均信号作为背景1.为了确定信噪比（SNR），使用阴性对照（NC）荧光斑（缺少探针目标的样品）的平均值作为背景2（b2）。该研究中的SNR定义为从平均背景2（ave b2）中减去的特征（ave SI）的平均信号强度除以背景2的变化（stdev b2）。这是等式：SNR =（AVE（SI）-AVE（b2））/ [STDEV（b2）]。检测限为SNR≥3。
  
  图6.荧光效率，L-SAF与M-SAF的比较。 A.来自L-SAF和M-SAF的背景信号的比较。 B.减去背景后用不同数量的荧光分子点样的L-SAF和M-SAF的荧光信号的平均值的图。对于相同尺寸的L-SAF和M-SAF，点样体积为220pl，曝光时间为400ms。生成y轴的误差条，作为至少三次重复的平均值的标准偏差。
  
  图7. L-SAF结构的荧光图像，用220μlCy3标记的DNA探针点样，范围从1 pM（1.32 x 102分子/ SAF结构）到1μM（1.32 x 108分子/ SAF结构）。 / strong>图像取自（A），正面（不使用SAF光学结构）和（B），背面（使用SAF光学结构）。在（B）中，光环对应于在L-SAF结构的侧壁处反射的发射。下面两张图：使用Bio-Analyzer 4F / 4S扫描仪在恒定曝光时间（400毫秒）扫描50,100和150μmL-SAF阵列的信噪比，每个SAF结构具有不同数量的荧光分子。左图：从正面扫描（不使用SAF光学结构），右图：从背面扫描（使用SAF光学结构）。生成y轴的误差条，作为至少三次重复的平均值的标准偏差。
评价SP-PCR
为了评估3D SAF结构对于进一步生物医学应用的适用性，在嵌入微芯片中的L-SAF结构的前面进行SP-PCR（图3），其中表面通过引物固定，如图8A所示。来自肺炎链球菌的DNA靶基因（肺炎球菌溶血素基因）在芯片上的L-SAF前面用SP-PCR特异性扩增。如图8B所示，高荧光信号并且没有观察到含有非特异性引物的荧光信号。

图8. L-SAF阵列上的SP-PCR。 A.微阵列布局。用于特异性扩增来自肺炎链球菌和 Streptococcus spp。的DNA靶基因的表面引物。将作为阳性DNA探针的Cy3标记的聚T（10）C（10）固定在L-SAF的前面，进行SP-PCR反应。 B. SPPCR后L-SAF阵列的荧光扫描图像。

致谢

这项工作得到了欧盟“地平线2020”研究与创新计划，第687697号赠款协议的资金支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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