材料和试剂

纸巾
注意：在适当的测试前几天，纸巾和乙醇用于在适应期后从排泄物中清除笼子。
手套
不干胶纸带
注意：磁带可用于在实验室中标记笼子和相机的位置。
实验室小鼠：可以测试模拟神经障碍的每种小鼠品系。可以考虑小鼠的不同生命阶段来评估触觉超敏反应：年轻（1-3个月大），成熟成人（3-6个月大），中年（10-14个月）和老年（18-24个月）。
注意：所有测试的小鼠应该具有相同或相似的年龄。由于雌性小鼠的气味会影响雄性小鼠的行为，因此应提前或在不同的日子单独测试雄性小鼠。
70％乙醇（v / v）
注意：在处理每只小鼠之前和之后用乙醇喷洒手。
无气味消毒剂
注意：每次测试后，用消毒剂喷洒所有工作表面。风干2-3分钟。

设备

透明标准鼠笼
注意：在我们的实验室中，我们使用标准的单个通风笼（Sealsafe Plus GM500，Tecniplast，意大利），其面积为501 cm 2 （W x D x H尺寸为391 x 199 x 160 mm ）。可以使用具有可比较措施的任何其他透明塑料笼。
摄像机（LifeCam Studio 1080p高清传感器/计算机，微软，加利福尼亚），可以使用其他公司的同等型号
注意：视频录制的质量应该足够高（理想情况下为1,080p HD），以便离线评估单一行为。摄像机应放置在离笼子20-30厘米的位置，以便记录整个笼子，最大限度地减少盲角和反射（参考参见图1）。如果存在记录光，请用纸带盖住。原始数据存储在计算机中以进行连续分析。

图1.表示实验者应如何定位相机和实验笼
在任何药店购买的木棍（长度：20厘米;直径：3毫米）
注意：钝头必须优先于尖头，以避免可能的身体伤害。
数字天文台（Thermo Fisher Scientific-US，Fisherbrand TM Traceable TM Jumbo-Digit秒表），等效天文台可以使用
注意：应避免使用计时器发出的哔哔声，因为这可能会导致老鼠焦虑和恐惧。

软件

Prism 8.0（GraphPad， https://www.graphpad.com/ ）或类似的软件来执行统计分析

程序

有关实验步骤的步骤，请参见图2。

图2.行为测试步骤的图形表示。行为测试包括习惯阶段，其中小鼠习惯于实验笼，新环境和实验者。然后进行习性，然后进行假刺激试验，其中将木棒引入笼中以避免与动物的触觉接触。这将提供动物焦虑行为的基线评分（对假性病症具有高度焦虑反应的动物应从WN测试中排除）。最后，实际测试阶段将包括双侧刺激小鼠面部触须。

注意：

每个实验小鼠必须在行为测试开始前至少1周在笼子中单独饲养。这些笼子被称为家庭笼子。＆nbsp;
行为实验必须在专门的房间进行。理想情况下，行为室应在实验区域周围设置黑色窗帘，以尽量减少对环境刺激的干扰。房间也必须没有同种和异种特性的气味，因为它们会影响鼠标的行为。
噪音也应降至最低或相当于房屋的水平。在适应期和实验阶段，实验者必须避免发出大声的噪音或突然的动作。＆nbsp;
光线应该减少或至少是间接的，但是应该注意视频录制的质量。
我们建议您始终进行试验性实验，以确定相机和笼子的位置，并在开始正确的实验之前标准化实验环境。
一旦实验条件标准化，实验者就可以进行行为测试。

实验笼的准备（第0天）
准备几个与您打算测试的小鼠数量相等的干净笼子，这些笼子被称为实验笼子。请务必正确标记所有笼子，因为每只鼠标都有自己的实验笼子。
将一把床上用品从家笼中转移到实验笼中，将其关闭并整夜放置。该步骤对于促进适应新环境是必要的。每次更换笼子时一定要用酒精清洁双手。
注意：在实验期间的任何时候，进行测试的刺激和评分的研究者必须对实验条件不知情。通过阻止实验者了解归属的小鼠组，这个过程很容易适用。
习惯阶段（第1-3天）
选择习惯阶段和行为测试的时间（即，早晨），然后在整个实验过程中保持一段时间。在测试时间参数方面保持一致非常重要。
1. 从实验笼中取出床上用品。
2. 将鼠标从其家笼转移至实验笼，无盖（图3）。
  注意：笼子应该每天放在同一个位置;用胶带跟踪正确的位置。
  
  图3.在适应阶段的实验笼中的小鼠
3. 将动物放在实验笼中30分钟。在那里，动物也应该适应你的存在。
  注意：习惯的第一天是最棘手的，动物可能会害怕并跳出笼子，注意并耐心等待。
4. 在适应阶段结束时，将小鼠从实验笼转移到其家笼。
5. 从实验笼中取出所有尿液和粪便，并用70％乙醇清洗。
6. 将一把床上用品从家笼放到实验笼中，关闭它并整夜待在一起。
7. 在第2天重复步骤B1至B6。
8. 在第3天重复步骤B1至B6。
  注意：适应期应至少进行3天，较少的天数可能会对行为评估产生负面影响。成功的习惯是当动物由于新环境和实验者的存在而没有表现出恐惧，压力和/或焦虑（例如，冷冻，躲避，过度梳理）的迹象时。
实验阶段（第4天）
实验阶段包括假刺激和三次双边晶须刺激试验。假相和刺激阶段持续5分钟，试验间隔1分钟。
1. 从实验笼中取出床上用品。
2. 将鼠标从其笼子转移到实验笼，关闭盖子并将笼子放在摄像机前面。
3. 将动物放在实验笼中30分钟。
4. 打开笼盖，开始录音
5. 开始假刺激5分钟（视频1）。
  注意：在假刺激中，动物会出现木棍。假装刺激鼠标的胡须而不触碰它们。
  
  视频1.假刺激的例子
6. 从试验1开始，持续刺激胡须5分钟（视频2）。
  注意。使用有节奏的动作弯曲胡须的中间，并为鼠标的每一侧交替胡须刺激（持续时间约为3秒）。
  
  视频2.胡须刺激示例
7. 等一下。
8. 另外重复步骤C6和C7两次。
9. 停止录制，将视频保存在计算机上，然后继续使用其他鼠标。

数据分析

行为评估基于单一行为的手动视频评分。行为评估如表1所示。对五个不同的类别进行评分;分析的行为反应是恐惧行为（冷冻，视频3），姿势（视频4），呼吸（过度换气，视频5），对棒状表现的积极响应（视频6）和回避性（视频7）0-2点定性比例（0，缺席; 1，在观察期间几乎不存在; 2，在大多数观察期内出现）。

视频3.冻结示例

视频4.立场示例

视频5.过度换气的例子

视频6.对棒状演示的积极响应示例

视频7.回避的例子

对刺激的正常行为反应被指定为零值，相反，有意义的异常行为反应（即，在大多数观察期内）被赋值为2.最大得分为10.这10点scale表示McNamara等人对WN评分量表的修改版本。（2010年）。高分（8-10）表示对刺激的异常反应，其中小鼠冻结，变得激动或具有攻击性。低分（0-3）表示正常反应，其中小鼠对刺激好奇或无动于衷。

表1.该表显示了WN测试中行为反应的量化。在测试期间监测五个不同的参数（恐惧行为，站立，呼吸，对棒的反应，逃避）（假和试验1） -3）。总分表示三种主要的行为反应类型（0至3，好奇/宁静; 4至7，烦恼/烦恼; 8至10，害怕/担心）。

评分应至少由两名训练有素的独立操作员执行，以确保可靠的评分一致性。统计分析可以使用GraphPad Prism 6.0或任何其他统计程序进行，并且应优先使用方差分析（ANOVA）进行，然后进行适当的事后检验，显着性水平设置为 P ＆lt; 0.05。我们建议每个基因型/组使用至少8-10只小鼠，以达到统计学显着性，同时尽量减少个体间差异的影响，但可能需要更多。
我们最近提供了对缺乏ASD相关基因Engrailed-2（En2 - / - ）小鼠（Chelini 等。，2019）。 En2 - / - 鼠标显示明显更高与WT对照相比，在3个试验中得分。当我们分析WT和En2的行为反应 - / - 用于计算WN得分的五个类别中的每一个的小鼠，En2 - / - 小鼠在冷冻和呼吸中显示出显着更高的分数，表明En2突变体响应于重复的晶须刺激的主要可怕行为。读者可以参考我们原始出版物的图5（Chelini et al。，2019）了解详情。

致谢

该行为方案已经改编自先前的研究（McNamara 等人，2010），其成功地鉴定了弥漫性脑损伤后大鼠的晶须刺激的感觉超敏反应。我们感谢CIMeC和CIBIO的技术和管理人员提供的出色帮助。 G.P.和Y.B.目前由特伦托大学2018-2020战略项目“Trentino Autism Initiative-TRAIN”提供支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

该方案中描述的所有动物程序均由特伦托大学动物护理委员会和意大利卫生部批准（方案949/2015-PR）。

参考

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