材料和试剂

移液器吸头
24孔板（涂层）（Thermo Fisher Scientific，目录号：142475）
1毫升塑料管
NEB10-beta主管 E。大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C3019）
pX458（Addgene，目录号：48138）
pAAVEF1αDIOmCherry（Addgene，目录号：20299）
BbsI-HF（New England Biolabs，目录号：R3539）
MluI-HF（New England Biolabs，目录号：R3198）
DpnI（New England Biolabs，目录号：R0176）
碱性磷酸酶，小牛肠道（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290）
引导寡核苷酸（参见程序A）
快速结扎套件（New England Biolabs，目录号：M2200）
Gibson Assembly Master Mix（新英格兰Biolabs，目录号：E2611）
PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara，目录号：R010）
dNTP每种混合10 mM（10 mM dTTP，dCTP，dGTP和dATP的混合物）（GenScript，目录号：C01689）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）
Tris-EDTA，（1x溶液）（Fisher BioReagents，目录号：BP2473）
LB肉汤EZMix粉末（Sigma，目录号：L7658）
LB Agar（Fisher BioReagents，目录号：BP1425）
氨苄青霉素（Gemini Bio-Products，目录号：400-130P）
验证将sgRNA克隆到pX458中的引物：5'-gactatcatatgcttaccgt-3'
验证串联克隆sgRNA到pAAV的引物：5'-actgacgggcaccggagcca-3'
吉布森大会的入门书：
Primer S1：5'-taggggttcctgcggccgcacgcgtgagggcctatttc-3'
Primer AS1：5'-ataggccctctctagaaaaaaagcaccgactc-3'
Primer S2：5'-tttttctagagagggcctatttcccatg-3'
Primer AS2：5'-atccatctttgcaaagcttacgcgtaaaaaagcaccgac-3'

可选（参见程序C）
NIH3T3细胞（ATCC，目录号：CRL-1658）
AAV载体（pX458-sgRNA或pX458空作为阴性对照）
引物：您可以设计引物以通过CHOPCHOP扩增目标外显子（参见程序C）
PrimeSTAR HS DNA聚合酶
FuGENE6转染试剂（Promega，目录号：E2693）
DMEM（1x）（Gibco，目录号：11995-065）
胎儿牛血清（康宁，目录编号：35-015-CV）
青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15070-063）
PBS，pH 7.4（Gibco，目录号：10010-023）
TrypLE Select（1x）（Gibco，目录号：12563-011）
QuickExtract DNA Extraction Solution（Epicenter，目录号：QE0905T）
T7核酸内切酶I（New England Biolabs，目录号：M0302）

设备

移液器（Gilson，Pipetman经典P10，P20，P200）
离心机（Eppendorf，离心机5424）
孵化器（VWR，孵化5000IR轨道振动筛）
热循环仪（Applied Biosystems，GeneAmp PCR system 2700）
电泳室（Labnet，ENDURO GEL XL）
（可选）CO 2 培养箱（Binder，CB 170）
（可选）洁净工作台（Labconco，净化器II级生物安全柜）
（可选）离心（Thermo Scientific，Soryall legend XTR）

程序

sgRNA的设计
可以通过使用gRNA设计webtools设计具有高效率和特异性的单指导RNA（sgRNA）。我们建议使用CHOPCHOP（ http://chopchop.cbu.uib.no ），因为它方便用户使用界面（Labun et al。，2016）。另外，您可以在Feng Zhang实验室的网站上找到指南设计资源（ https://zlab.bio/指导设计资源）。 sgRNA应靶向早期外显子（转录起始位点附近）或基因功能的基本外显子。我们通常在没有起始密码子的早期外显子上选择4到6个靶位点，因为起始密码子附近的移码突变可导致其他框内ATG的翻译，导致功能蛋白的表达。如果靶序列是5'-CGCAGGACCAGACCCCATAATGG-3'[原型间隔区相邻基序（PAM）标记为蓝色]，则合成5'-caccgCGCAGGACCAGACCCCATAA-3'（有义）和5'-aaacTTATGGGGTCTGGTCCTGCGc-3'（反义）至将引导序列克隆到pX458（Ran 等人，，2013）sgRNA支架中（图3A）。第一寡核苷酸中的cacc（小写）和第二寡核苷酸中的aaac（小写）是pX458中克隆到BbsI位点的突出端。我们还在cacc和第一寡核苷酸中的靶序列之间添加“g”，因为人U6启动子在转录起始位点优选“g”用于强表达。此外，您可以使用CHOPCHOP设计引物以扩增靶位点，以使用T7核酸内切酶I测定进一步评估sgRNA（参见程序C）。
将sgRNA克隆到表达spCas9的质粒（pX458）中
1. 用BbsI消化pX458：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Xμl
  pX458（10μg）
  5μl
  10倍NEB削减智能
  1μl
  BbsI-HF
  24 - Xμl
  MilliQ水
  30μl
  总计
2. 在37°C孵育过夜。
3. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒凝胶纯化质粒。用50μl1xTris-EDTA缓冲液洗脱质粒。
4. 退火编码sgRNA的寡核苷酸： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>1μl
  寡核苷酸，有义（100μM）
  1μl
  寡核苷酸，反义（100μM）
  8μl
  1x Tris-EDTA缓冲液
  10μl
  总计
5. 在95°C孵育5分钟。然后关闭热循环仪（30分钟）冷却至室温。
6. 准备连接反应如下： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：700px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>1μl
  用1x Tris-EDTA缓冲液稀释（1：100）退火的寡核苷酸
  1μl
  BbsI消化的pX458（50 ng /μl）
  5μl
  2x结扎缓冲液
  1μl
  快速连接
  2μl
  MilliQ水
  10μl
  总计
7. 在室温下孵育10分钟。
8. 将5μl连接反应物加入50μlNEB10-β中。
9. 接下来放在冰上10分钟。
10. 在42°C下热冲击30秒。
11. 转移到冰上3分钟。
12. 将反应物在含有氨苄青霉素（50μg/ ml）的LB-琼脂平板上铺板。
13. 在37°C孵育过夜。
14. 从单个菌落接种含有氨苄青霉素（50μg/ ml）的2ml LB肉汤，并在37℃下搅拌过夜。
  注意：根据我们的经验，60-70％的菌落具有正确的插入。＆nbsp;
15. 使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒从1 ml过夜培养物中纯化质粒。
  用50μl缓冲液EB洗脱质粒并测定浓度
16. 通过引物（5'-gactatcatatgcttaccgt-3'）测序验证质粒。
（可选）通过T7核酸内切酶I测定评估sgRNA
1. 将密度为2.5×10 4 细胞（500μl/孔，DMEM / 10％FBS / 1％青霉素/ 1％链霉素）的NIH3T3细胞置于24孔板的孔中。 />
2. 在37°C CO 2 培养箱中孵育过夜。
3. 转染
  1. 将1.5μlFuGENE6试剂加入1ml塑料管中的50μl无血清DMEM中，并通过涡旋混合。
  2. 在室温下孵育混合物5分钟。
  3. 向混合物中加入0.5μgpX458-sgRNA或对照载体，并通过涡旋混合。
  4. 在室温下孵育混合物30分钟。
  5. 将混合物加入含有细胞的24孔板的每个孔中。
  6. 在37°C CO 2 培养箱中孵育24小时。
  7. 用新鲜培养基替换细胞培养基（DMEM / 10％FBS / 1％青霉素/ 1％链霉素）。
  8. 重复步骤C3d-C3e。
    注意：重复转染对于高表达Cas9和sgRNA以编辑NIH3T3细胞中的靶基因至关重要。
  9. 在37°C CO 2 培养箱中孵育48小时。
4. 通过移液移除细胞上清液，并用500μl1xPBS洗涤细胞。
5. 每孔加入100μlQuickExtract，将含有基因组DNA的裂解液收集到1 ml塑料管中。
6. 在65°C孵育15分钟，然后在98°C孵育10分钟。
7. 在20,000 x g 离心10分钟。
8. 收集60μl上清液（可以在-20°C下储存）。
9. PCR扩增CRISPR结合位点周围的200-300bp片段。引物可以通过CHOPCHOP设计。
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：800px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>6μl
  裂解物
  1.5μl
  dNTP（dTTP，dCTP，dGTP和dATP的混合物，各自的终浓度为10 mM）
  12μl
  5x缓冲区
  1.5μl
  引物S（10μM）
  1.5μl
  引物AS（10μM）
  1μl
  PrimeSTAR HS DNA聚合酶
  36.5μl
  MilliQ水
  60μl
  总计
10. 使用以下设置开始PCR：
  1. 在95℃变性2分钟。
  2. 的35个循环 95°C 10秒
    55°C，持续5秒
    72°C，45秒
  3. 在72℃下最终伸长2分钟。
  4. 储存在4°C。
11. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒凝胶纯化PCR产物。用50μl缓冲液EB洗脱PCR产物。
  1. PCR产物的变性和退火：
    5μlPCR产物（200 ng）
    2μl10xNEB缓冲液2
    12μlMilliQ水
    总共19μl
  2. 95°C，5分钟。＆nbsp;
  3. 关闭热循环仪（30分钟）冷却至室温。
12. 加入1μl稀释的（1：5）T7核酸内切酶I（2.5U /μl）。
  注意：T7核酸内切酶I的稀释是必需的，因为过量的酶会导致DNA的非特异性切割。
13. 在37°C孵育30分钟。
14. 在2％琼脂糖凝胶上运行并验证sgRNA转染孔中的条带与对照孔相比（图2）。
  
  图2.来自用sgRNA和Cas9转染的NIH3T3细胞的T7核酸内切酶I消化的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。将靶外显子进行PCR扩增并凝胶纯化。变性和退火后，用T7内切核酸酶I消化PCR产物，并在2％琼脂糖凝胶上电泳。星号表示切割的DNA片段。在这个实验中，我们发现只有一个较短的片段。但是，如果仔细设计引物，您可能会在切割后发现两种不同大小的条带。设计PCR引物可能是有用的，因为基因组编辑产生的插入缺失不在扩增子的中间，最终导致两个不同大小的切割条带。
  
  您可以根据T7核酸内切酶I检测结果量化基因修饰的效率。通过使用下面的等式，可以将凝胶上的切割百分比转换为基因修饰的百分比。
  
  ％基因修饰= 100 x（1 - （1 - 分裂切割） 1/2 ）（Guschin et al。，2010）
  此外，您可以通过名为Synthego的ICE（ https://ice.synthego.com）的webtool评估基因编辑的效率。 /＃/ ）。来自编辑或未编辑（对照）细胞的靶外显子进行PCR扩增和Sanger测序。您可以将测序结果提交给webtool，ICE会比较这些序列迹线，以便对基因编辑进行详细分析。
将两个sgRNA串联克隆到pAAVEF1αDIOmCherry中在程序A中，您克隆了几个靶向相同基因的sgRNA。为了有效的基因破坏，使用Gibson组装方法将由独立的人U6启动子驱动的两种不同的sgRNA串联克隆到AAV载体中（图3B和3C）。

图3.双重sgRNA病毒载体的构建策略。 A.引导寡核苷酸的克隆。将具有20-nt指导序列和用于克隆到pX458中的BbsI位点的突出端的寡核苷酸退火并克隆到BbsI消化的pX458中。 B.克隆U6启动子驱动的sgRNA。通过使用具有用于Gibson组装的突出端的引物，分别PCR扩增U6启动子，接着是sgRNA1或sgRNA2。 C. Gibson装配双重sgRNA病毒载体。使用Gibson Assembly将U6-gRNA1和U6-gRNA2克隆到MluI消化的pAAVEF1DIOmCherry中。
1. 用MluI消化，去磷酸化和纯化pAAVEF1αDIOmCherry。
  1. 消化： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Xμl
    pAAVEF1αDIOmCherry（10μg）
    5μl
    10倍NEB削减智能
    1μl
    MluI-HF
    24 - Xμl
    MilliQ水
    30μl
    总计
  2. 在37°C孵育过夜。
  3. 加入1μlCIP，然后在37°C孵育60分钟。
  4. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒凝胶纯化质粒。＆nbsp;
  5. 用50μl缓冲液EB洗脱质粒。
2. 扩增U6启动子加上sgRNA＃1或sgRNA＃2。
  1. PCR反应＃1（预期大小为393 bp）： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：650px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>3μl
    pX458-sgRNA＃1（10 ng /μl）
    1.5μl
    dNTP，每种10 mM
    12μl
    5x缓冲区
    1.5μl
    引物S1（10μM）; 5'-taggggttcctgcggccgcacgcgtgagggcctatttc -3'
    1.5μl
    引物AS1（10μM）; 5'- ataggccctctctagaaaaaaagcaccgactc -3'
    1μl
    PrimeSTAR HS DNA聚合酶
    39.5μl
    MilliQ水
    60μl
    总计
  2. PCR反应＃2（预期大小为388 bp）： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：650px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>3μl
    pX458-sgRNA＃2（10 ng /μl）
    1.5μl
    dNTP，10 mM
    12μl
    5x缓冲区
    1.5μl
    引物S2（10μM）; 5'-tttttctagagagggcctatttcccatg -3'
    1.5μl
    引物AS2（10μM）; 5'- atccatctttgcaaagcttacgcgtaaaaaagcaccgac -3'
    1μl
    PrimeSTAR HS DNA聚合酶
    39.5μl
    MilliQ水
    60μl
    总计
3. 使用以下设置启动PCR。
  1. 在95℃变性2分钟。
  2. 的35个循环 95°C 10秒
    62°C，持续5秒
    72°C，45秒
  3. 最后在72℃下伸长2分钟。
  4. 储存在4°C。
4. 用2％琼脂糖凝胶电泳。
5. 使用QIAquick凝胶提取试剂盒凝胶纯化PCR产物。用50μlMilliQ水洗脱PCR产物。
6. 消化残留的模板质粒：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：350px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>45μl
  PCR扩增子＃1或＃2
  5μl
  10倍NEB削减智能
  1μl
  DpnI
  51μl
  总计
7. 在37°C孵育30分钟，在80°C孵育30分钟。
8. 吉布森大会： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：650px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>1μl
  经CIP处理的MluI消化的pAAVEF1αDIOmCherry（100 ng /μl）
  3μl
  PCR扩增子＃1
  3μl
  PCR扩增子＃2
  3μl
  MilliQ水
  10μl
  吉布森大会组合
  20μl
  总计
9. 在50°C孵育15分钟。
10. 向50μlNEB10-β中加入2μl连接反应物。
11. 按照步骤B9-B15。
12. 通过用引物（例如，5'-actgacgggcaccggagcca-3'）测序验证质粒。
13. 继续进行病毒包装。
  注意：我们通常从斯坦福神经科学基因载体和病毒核心。
14. 将病毒储存在-80°C。
  注意：此策略可以以特定于细胞类型的方式破坏基因。您不仅可以将病毒用于成年小鼠大脑，还可以用于其他器官。

食谱

所有材料和试剂均可商购。

致谢

H.Y.得到了上原纪念基金研究奖学金的支持。 L.d.L得到国立卫生研究院资助AG047671，MH087592，MH102638的支持。该协议改编自Yamaguchi et al。（2018），并包括我们实验室方法的最新改进。

利益争夺

竞争利益作者宣称没有竞争性的经济利益。

参考

Labun，K.，Montague，T.G。，Gagnon，J.A.，Thyme，S.B。和Valen，E。（2016）。 CHOPCHOP v2：下一代CRISPR基因组工程的网络工具。核酸Res 44（W1）：W272-276。
Platt，RJ，Chen，S.，Zhou，Y.，Yim，MJ，Swiech，L.，Kempton，HR，Dahlman，JE，Parnas，O.，Eisenhaure，TM，Jovanovic，M.，Graham，DB，Jhunjhunwala ，S.，Heidenreich，M.，Xavier，RJ，Langer，R.，Anderson，DG，Hacohen，N.，Regev，A.，Feng，G.，Sharp，PA和Zhang，F。（2014）。 CRISPR-Cas9敲入小鼠进行基因组编辑和癌症建模。细胞 159（2）：440-455。
Ran，F.A.，Hsu，P。D.，Wright，J.，Agarwala，V.，Scott，D。A.和Zhang。 F.（2013）。使用CRISPR-Cas9系统的基因组工程。 Nat Protoc 8（11）：2281-2308。
Swiech，L.，Heidenreich，M.，Banerjee，A.，Habib，N.，Li，Y.，Trombetta，J.，Sur，M。和Zhang，F。（2015）。使用CRISPR-Cas9 体内在哺乳动物大脑中查询基因功能。 Nat Biotechnol 33（1）：102-106。
Yamaguchi，H.，Hopf，F.W.，Li，S.B。和de Lecea，L。（2018）。体内细胞类型特异性CRISPR敲低多巴胺β羟化酶可减少基因座coeruleus唤起了觉醒。 Nat Commun 9（1）：5211。
Guschin，D.Y.，Waite，A.J.，Katibah，G.E.，Miller，J.C.，Holmes，M.C。和Rebar，E.J。（2010）。监测内源基因修饰的快速通用检测方法。方法Mol Biol 649：247-256。