图1. Bnl：HA 1 GFP 3 的示意图和预期的分散模式。 A.嵌合Bnl的示意图：HA 1 GFP 3 蛋白，其中HA和GFP标签分别位于弗林蛋白酶切割位点的上游和下游。 BnI在164 th 氨基酸处裂解，HA和GFP标签分别位于87 th 和432 nd 残基。 B.在BnI源中表达BnI：HA 1 GFP 3 （黄色：GFP +α-HA红色免疫染色）的翼盘的漫画。在没有弗林蛋白酶抑制剂（左翼盘）的离体培养条件下，BnI被切割，并且仅Bn1的GFP标记的片段被转运至ASP受体细胞。在包含弗林蛋白酶抑制剂的离体条件下，ASP中全长Bnl：HA 1 GFP 3 （黄色）斑点的量逐渐增加孵化时间较长（右翼圆盘）。

材料和试剂

Drosophila 饲养
1. Fly Vials（Genesee Scientific，目录号：32-117）
2. 样品瓶塞（Genesee Scientific，目录号：49-101）
3. 转基因 Drosophila 系： bnl：Gal4 / TM6 和 UAS-bnl：HA1GFP3 （Sohr et al。，2019 ）
4. Standard Fly Nutrient Medium（Genesee Scientific，目录号：66-114）
5. 丙酸（西格玛，目录号：402907）
晚期三龄幼虫解剖和洗涤
1. 小油漆刷（VWR，目录号：149-2130）
2. 移液器吸头（VWR，目录号：83007-376）
3. 无菌Eppendorf管（Genesee Scientific，目录号：24-282）
4. Pyrex点板（Fisher Scientific，目录号：13748B）
5. 35毫米塑料培养皿（Falcon，目录号：351008）
6. 过滤装置对WM1培养基进行灭菌（VWR，目录号：89220-694）
7. 100％乙醇（Pharmco，目录号：111000200）
8. 去离子水
9. 施耐德的媒介（西格玛，目录号：S0146）
10. 牛胰岛素溶液（Sigma，目录号：I0516）
11. 苍蝇提取物（DGRC，目录号：1645670）
12. 青霉素/链霉素溶液（Corning，目录号：30-002-CI）
13. 70％乙醇
14. WM1媒体（Zartman et al。，2013）（见食谱）
离体培养解剖的幼虫
1. 无内毒素的水（西格玛，目录号：210-7）
2. 弗林蛋白酶抑制剂I（默克密理博中国，目录号：344930）
3. 弗林蛋白酶抑制剂II（默克密理博中国，目录号：344931）
4. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Hardy Diagnostics，目录号：U137）
5. 弗林蛋白酶抑制剂鸡尾酒（见食谱）
幼虫尸体的抗体染色
1. 10毫升注射器（Becton Dickinson，目录号：301029）
2. 无菌注射器过滤器，0.2μm（VWR，目录号：28145-501）
3. 16％甲醛（Ted Pella，Inc。，目录号：18505）
4. Triton X-100（Sigma，目录号：T8787）
5. 普通山羊血清粉（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
6. α-HA抗体，3F10（Roche，目录号：11867423001）
7. α-Discs Large抗体，4F3（DSHB，目录号：AB_528203）
8. Alexa Fluor 647山羊抗大鼠IgG（Invitrogen，目录号：A21247）
9. Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（Invitrogen，目录号：A21422）
10. 4％甲醛（见食谱）
11. 0.1％PBS-T（见食谱）
12. PBS-T中5％正常山羊血清（见食谱）
安装和成像翼想象盘
1. 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-18）
2. 盖弗斯（康宁，目录号：2845-22）
3. Vectashield安装介质（矢量，目录号：H-1000）
4. 指甲油（电子显微镜科学，目录号：72180）

设备

Drosophila 饲养
1. 立体显微镜（例如，标准Olympus SZ61或尼康SMZ745）
2. 带有CO 2 垫的 Drosophila 工作站（Flowbuddy Complete; Genesee Scientific，目录号：59-122WC）
3. 孵化器（25°C，Peltier冷藏培养箱）
晚期三龄幼虫解剖和洗涤
1. Dumont镊子＃5（精细科学工具，目录号：11252-00）
2. 立体显微镜（如A部分所述）
3. 移液器（1,000μl）
4. 剪刀（VWR，目录号：89259-936）
离体培养解剖的幼虫
1. 无菌25°C培养箱（Thermo Scientific，型号：Heracell150i）
2. 用于细胞培养的无菌生物安全柜（Labconco，型号：302481101）
幼虫胴体抗体染色
Nutating混合器（VWR，型号：82007-002）
安装和成像翼想象盘
1. 钳子
2. 激光扫描共聚焦显微镜（例如，Leica SP5X）或旋转盘共聚焦显微镜（例如，尼康）

软件

成像软件：IQ3（Andor）＆nbsp;
ImageJ的/斐济
Adobe Photoshop，Adobe Illustrator
Microsoft Excel

程序

Drosophila 饲养/穿越
1. 使用CO 2 垫麻醉并收集~20只雌性原始 bnl-Gal4 果蝇以及~10只雄性 UAS-bnl：HA 1 < / sub> GFP 3 苍蝇。
2. 将苍蝇放在装有新鲜蝇食的小瓶中以设置十字架： bnl-Gal4 × UAS-bnl：HA 1 GFP 3 < /sub>.
3. 将交叉的苍蝇放在25°C的培养箱中，用于饲养 Drosophila 。
4. 每隔一天将交叉的果蝇转移到装有新鲜食物的新小瓶中，但保留所有较旧的小瓶，以便从中收集用于离体培养的幼虫。
5. 产卵后，中后期三龄幼虫将在5-6天后准备解剖。
用于解剖的晚期3 rd instar 果蝇幼虫的制备
1. 将油漆刷浸入去离子水中，并用它去除在飞行小瓶侧面游荡的晚期3 rd 幼虫幼虫。
2. 将~10只幼虫放入含有1x PBS的平板孔中。＆nbsp;
3. 用油漆刷轻轻旋转它们，以去除可能粘在幼虫表面的任何大的食物残渣。
4. 用镊子将这些幼虫轻轻转移到含有70％乙醇的单独的平板孔中。＆nbsp;
5. 轻轻旋转幼虫并确保它们被淹没。孵育1-2分钟，对其进行表面消毒。
6. 用镊子从乙醇中取出幼虫，将它们放入含有新鲜1x PBS（与步骤B2不同的孔）的平板孔中。＆nbsp;
7. 用1x PBS在单独的平板孔中冲洗幼虫两次，以完全除去乙醇。
3 rd Instar幼虫解剖
1. 从组中取出一只洗过的幼虫，放入装有WM1培养基的塑料培养皿中（见食谱）。幼虫应完全浸没在培养基中。
2. 使用镊子和解剖显微镜，取出并丢弃幼虫后部的底部1/3。前部将包含除生殖器椎间盘外的所有成像椎间盘（图2）。
3. 通过使用镊子推动幼虫的前部，将口钩（前半部的尖端）推向幼虫内部朝向后端，导致成像盘和其他内部组织被外化。
  注意：可在Youtube上找到显示初始幼虫解剖的视频 - Drosophila Melanogaster中的幼虫脑解剖（由WilliamsCollege出版）
4. 将肠道从其连接到口钩的位置完全移除，而不会干扰成像盘，以最大限度地减少离体培养期间的细菌污染。
5. 将去除了肠的这个倒置的前部放入含有1ml WM1培养基的无菌Eppendorf管中。
6. 重复步骤C1-C5直至解剖所有洗过的幼虫。为避免污染，每批洗涤和解剖10-15只幼虫。
7. 重复步骤B和C，直到获得足够的解剖幼虫用于所需的实验。
  注意：解剖的幼虫总数取决于所使用的时间点和治疗组的数量（见下面的步骤E6）。
  
  图2.晚期3 rd instar Drosophila 幼虫的解剖方案。显示3个晚期 rd的3步解剖幼虫。首先，将幼虫的后三分之一切除并丢弃，仅留下所需的前部。接下来，使用镊子将胎体的前部倒置以将口钩推过前部的其余部分，导致包括翼形成盘的所有内部组织的外部化。最后，尽可能多的肠道被移除而不会干扰成像盘。
连续洗涤解剖的幼虫
注意：在无菌生物安全柜中执行以下操作。
1. 准备3个Eppendorf管，每个管中加入1 ml WM1培养基。
2. 用70％乙醇清洗剪刀片。
3. 切掉P-1000移液管尖端约1-2毫米。切割尖端开口的尺寸应足够大，以便解剖的幼虫可以装入移液管尖端。
4. 轻轻吸取并将解剖后的幼虫从含有WM1培养基的Eppendorf管底部吸入移液管尖端。＆nbsp;
5. 保持移液管上的压力，让切开的幼虫沉淀到移液管尖端的底部，然后将其分配到一个带有新鲜WM1培养基的Eppendorf管中。丢弃移液器吸头中剩余的WM1培养基。
6. 非常轻柔地将该管倒置3-5次，然后让解剖的幼虫沉淀到管的底部。
7. 使用新鲜的移液器吸头，切口与步骤D2相同，重复步骤D2-D6两次，其余两个含有新鲜WM1培养基的Eppendorf管清洗解剖的幼虫尸体（见注1）。
用弗林蛋白酶抑制剂进行离体培养
1. 准备两个塑料培养皿，一个用于对照组，一个用于治疗组，如下。
2. 在处理盘中，添加WM1培养基和10x弗林蛋白酶抑制剂鸡尾酒（参见食谱），使鸡尾酒的1x工作浓度为50μM（即，加入200μl10x抑制剂鸡尾酒至1.8毫升的WM1媒体）。好好混合。
  注意：总体积可能需要根据菜肴类型和屠体数量进行调整，因此使用的10x抑制剂混合物的体积应相应调整。我们在35毫米培养皿中使用总体积为2毫升。
3. 对于对照培养皿，使用不含内毒素的水代替弗林蛋白酶抑制剂混合物。好好混合。
4. 在对照和含有抑制剂的培养皿之间分开洗过的屠体。
5. 用盖子盖住每个培养皿，置于无菌的25°C培养箱中。＆nbsp;
6. 孵育胴体1小时，2.5小时和5小时（见注2）。对于每个时间点，使用带有切除尖端的移液管移除一些（至少5个）屠体，同时最小化移除的液体量。将这些尸体放入含有1毫升1x PBS的Eppendorf管中。
  注意：最初解剖的幼虫数量将取决于离体培养使用多少个时间点。我们建议每个对照组和治疗组每个时间点至少使用10只幼虫，但在一个培养皿中不要超过50只胴体。
离体培养的幼虫的抗体染色
1. 轻轻倒转含有幼虫尸体的Eppendorf管2-3次。
2. 让胴体沉淀到管底部，通过吸取尽可能多的液体，从管中取出PBS，不要用移液管尖端打扰屠体。＆nbsp;
3. 在胴体中加入1毫升新鲜的1x PBS。＆nbsp;
4. 重复步骤F1-F3两次以清洗屠体以尽可能多地去除WM1培养基和细菌。
5. 加入1毫升4％甲醛（见食谱）固定组织。
6. 将管子以45°角放置，使尸体单层沉淀，在室温下固定25分钟，无需搅拌。＆nbsp;
7. 如步骤F2中那样除去4％甲醛。
8. 用1ml 0.1％PBS-T洗涤3次（参见配方）。每次洗涤，在章动混合器中放置5分钟。
9. 在室温下，在1ml 5％普通山羊血清（参见食谱）中旋转1小时。
10. 在1 ml 5％正常山羊血清中加入α-HA（1：1,000）和α-Discs大（细胞标记，以显示翼盘和ASP细胞，1：100）一级抗体，各自稀释。＆nbsp;
11. 在章动混合器上于4℃孵育过夜。
12. 每次洗涤用1ml 0.1％PBS-T洗涤3次，每次5分钟。
13. 在1 ml 0.1％PBS-T中加入Alexa Fluor 555 Goat抗小鼠和Alexa Fluor 647山羊抗大鼠二抗（均为1：1,000）。＆nbsp;
14. 在章动混合器上在室温下孵育2小时。
15. 每次洗涤用1 ml 0.1％PBS-T洗涤3次，每次15分钟。
安装和成像机翼成像盘
1. 将来自一组的染色的胴体放入含有足够PBS-T的塑料培养皿中，使得胴体浸没。
2. 使用解剖显微镜和镊子，通过切断与椎间盘周围的角质层和气管的连接，从胴体中取出翼形成像盘。从胎体上取下翅片时，避免接触翅膀成像盘（参见[Purves and Brachmann，2007]的视频，显示从胎体中取出翼片的一个例子）。＆nbsp;
3. 通过用一个镊子抓住任何相关的气管分支来拾取翼盘，并将其转移到带有一滴Vectashield封固剂的载玻片上。
  注意：如果没有可用的相关气管来拾取翼盘，请抓住椎间盘的翼盘（椎间盘的上部圆形部分不含Bnl产生或接收细胞，不会成像）＆NBSP;
4. 将所有翼片放置在载玻片上的所有胎体上后，确保所有翼片朝向，相关的气管朝上（远离滑动件）。
5. 将盖玻片缓慢地从一侧向下放到另一侧，将盖玻片放在翼片顶部。＆nbsp;
6. 使用一层薄薄的指甲油将盖玻片的边缘密封到载玻片上。＆nbsp;
7. 对每个组和时间点分别重复步骤G1-G6。＆nbsp;
8. 使用共聚焦显微镜成像接收Bnl的ASP细胞和产生Bnl的翼盘源细胞，这些细胞位于ASP尖端的前方（图1）。获得488（GFP），647（α-HA）和561（α盘大）通道的z-堆栈（见注3）。一个例子如图3所示。
  
  图3. 离体培养和弗林蛋白酶抑制剂测定表达Bnl：HA 1 GFP 3 的翼盘。在 bnl-Gal4 下表达Bnl：HA 1 GFP 3 的α-HA染色（红色）翼盘离体 3 衍生物;箭头，未切割的Bnl：HA 1 GFP 3 ;蓝色，α-Discs大到标记细胞轮廓;合并（A，B，显示CE）和分裂绿色，红色（A'-B“）或仅红色（C'-E'）通道。（F）比较在存在和不存在的情况下培养的ASP中共定位HA和GFP的平均水平的图表。弗林蛋白酶抑制剂;在连续培养的不同时间点收获样品; N = 11（0小时），11小时（1小时），10小时（2.5小时），9小时（对照5小时），12小时（5小时试验）; em> P - 值（ANOVA后跟Tukey HSD）： P = 0.0001 f或0小时与0小时对照，5小时对照，1小时或2.5小时。比例尺，30μm。

数据分析

在ImageJ / Fiji中导入并打开一个图像文件。
创建一个扁平的Z-stack，其中包含管状ASP受体细胞的整个深度。
注意：请确保不要在展平的Z-stack中包含ASP下方的部分，因为强度定量会受到位于ASP下的Bnl表达翼盘单元的影响。＆nbsp;
使用多边形或徒手选择工具在包含Bnl：GFP信号的ASP单元周围绘制感兴趣区域（ROI）。
注意：请确保不要在ROI中包含位于ASP顶端前方的Bnl表达翼光盘单元。＆nbsp;
在此ROI内测量α-HA通道和GFP通道的强度，并在Excel中记录这些强度。
将多边形移动到翼盘的没有GFP或HA信号的区域。＆nbsp;
再次测量两个通道中的强度，以获得背景信号的测量值，并在Excel中记录背景强度。
从两个通道的ASP强度值中减去背景强度值。
通过将背景校正的HA通道强度除以背景校正的GFP通道强度，获得ASP中的HA：GFP比率。
重复步骤1-8，直到分析所有组中的所有图像。
进行适当的统计检验，以确定ASP中的HA：GFP比率在对照组和治疗组之间是否有显着差异。

笔记

我们建议在进行抑制剂和染色的完整实验之前仅尝试解剖和培养步骤，以确保方案的培养部分正常工作。如果大部分解剖的幼虫尸体在任何时候在培养期间完全变黑，则组织即将死亡，并且该方案的一个或多个方面可能存在问题。这可能是由于解剖技术，解剖前和/或之后幼虫的洗涤不充分，或受污染的材料/设备。在此过程中保持尽可能无菌的环境对于实验的成功至关重要，因为细菌感染可以容易地发生。许多细菌可能来自幼虫的解剖肠道，因此在新鲜的WM1中去除肠道和清洗解剖的幼虫尸体以消除尽可能多的细菌的重要性。＆nbsp;
用于培养的WM1培养基应足以淹没幼虫尸体。我们评估了表达Bn1：HA 1 GFP 3 的翼盘，培养至16小时。从翼盘到生长的ASP的截短的Bnl：GFP 3 部分的器官间转移表明即使在离体条件16小时后，正常的信号传导活性仍然存在。然而，由于浸没的培养条件，组织中缺氧诱导的变化增加，如在培养8和16小时之间表达异位Bnl的细胞的出现所清楚地看到的那样。＆nbsp;
至关重要的是，每个图像和组的所有成像参数（即，激光强度，曝光时间，增益，等）保持不变。这确保了荧光强度的定量在不同组之间是可比较的。

食谱

WM1媒体（Zartman et al 。，2013）
施奈德的媒介
5％苍蝇精华
40μg/ ml牛胰岛素
1％青霉素/链霉素
1. 在Schneider的培养基中将成分混合到适当的浓度（我们通常总共250毫升）
2. 将介质通过250毫升过滤装置过滤灭菌
3. 分装到15毫升管中
10x弗林蛋白酶抑制剂鸡尾酒
1. 将单独的弗林蛋白酶抑制剂（I和II）分别溶于无内毒素的水中至浓度为1mM
2. 将等体积的弗林蛋白酶抑制剂I和弗林蛋白酶抑制剂II（每种1mM）组合以产生10x抑制剂混合物，每种抑制剂的终浓度为500μM。混合物的工作浓度为50μM
4％甲醛
在Eppendorf管中向750μlPBS中加入250μl16％甲醛
含有0.1％Triton X-100（PBS-T）的PBS
1. 将100μlTritonX-100加入100ml PBS中
2. 大力摇晃混合
PBS-T中5％正常山羊血清
1. 将10ml PBS加入含有脱水NGS的正常山羊血清（NGS）小瓶中
2. 重悬NGS粉末
3. 使用10 ml注射器取出NGS溶液
4. 当NGS溶液在注射器中时，将0.2μm无菌注射器过滤器连接到注射器的末端
5. 将NGS溶液通过过滤器等分到Eppendorf管中
6. 通过向950μlPBS-T中加入50μl过滤的NGS制备5％NGS

致谢

该项目由美国国立卫生研究院资助：向S. Roy提供K99 / R00HL114867和R35GM124878。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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