材料和试剂

1.7毫升Eppendorf管（VWR，目录号：87003-294）
0.65 ml Eppendorf管（VWR，目录号：87003-290）
20μlART TM 屏障低保留移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-707-432）
200μlART TM 屏障低保留移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：21-402-486）
Parafilm（VWR，目录号：52858-000）
Micro-Tube Cap Locks（国际研究产品，产品目录号：145063）
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织
手术切除（1.5-2.5 x 1.5-2.0 x 0.2-0.3 cm）的FFPE组织块和针芯活检标本（1.4-2.0 x 0.1-0.2 x 0.2-0.2 cm）切成石蜡卷（~2μm））在俄克拉荷马大学健康科学中心斯蒂芬森癌症中心组织病理学共享资源设施。每个Eppendorf管包含2-3个组织卷。石蜡卷应储存在-20°C。＆nbsp;
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）DNA分离试剂盒（Zymo Research，目录号：D3067）。
注意：混合后（-20°C）和重悬的RNase A（4°C），将所有试剂盒组分保存在室温下，蛋白酶K和储存缓冲液除外。
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（Zymo Research，目录号：D4007），室温下储存试剂盒
QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（QIAGEN，目录号：56404）（来自肝脏供体1-3的组织与QIAmp试剂盒一起用于分离DNA）＆nbsp;
100％乙醇（VWR，目录号：71001-630），在室温下储存
异丙醇（IBI Scientific，目录号：IB15735），在室温下储存
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC075301）
注意：在细胞培养罩中将水等分（每个Eppendorf管1ml）并储存在-20℃。每次使用新的等分试样以避免交叉污染。＆nbsp;
Phusion高保真DNA聚合酶（100单位）（Thermo Fisher Scientific，目录号：F530S），储存于-20°C
5x Phusion高保真缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：F-518），储存于-20°C
10mM dNTP Mix（Invitrogen，目录号：18427-013），储存在-20℃
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP160-100），在室温下储存
溴化乙锭（Thermo Fisher，目录号：15585011），储存于4°C
Tris Base（Thermo Fisher，目录号：BP152-5），在室温下储存
硼酸（Sigma，目录号：B0394），在室温下储存
100碱基对（bp）DNA梯（Promega，目录号：G210A），储存于-20°C
6x蓝色/橙色上色染料（Promega，目录号：G190A），储存在-20°C
正向和反向引物（Sigma）。以0.05μM合成规模合成引物，并在脱盐纯化的水中预稀释至100μM，储存于-20°C
前沿入门：AAATTACCCAGTCTCAGGTATG
反向引物：TGTCCTTCTTTAGCGAAATC
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma，目录号：EDS-100g），室温下储存
10x Tris-Borate EDTA（TBE）缓冲液（参见食谱）
0.5x Tris-Borate EDTA（TBE）缓冲液（见食谱）

设备

移液器：Research Plus ® 4-pack（0.1-2.5μl，2-20μl，20-200μl，100-1,000μl）（Eppendorf，制造商ID：2231300004）
加热块（55-94°C）（VWR，目录号：75838-318）
离心机（Eppendorf，型号：5424R）
Vortex（Vortex Genie 2,110V，VWR，目录号：100370-856）
热循环仪（Techne，Cole-Parmer科学专家，TC-312）
NanoDrop分光光度计（NanoDrop Technologies，ND-1000 UV / Vis）
用于测序的3730xl DNA分析仪（Applied Biosystems，3730xl）
BioRad Molecular XRS Imager（BioRad，Hercules，CA）

软件

Finch TV Software（Geospiz，Inc.， https://digitalworldbiology.com/FinchTV ）
Image Lab软件（BioRad，Hercules，CA）

程序

使用FFPE DNA分离试剂盒＃D3067（Zymo Research，Irvine，CA）从福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）肝组织中提取DNA
1. 缓冲剂的制备
  1. 根据制造商的说明准备缓冲液（ Quick-DNA TM FFPE Kit ）。
  2. 向试剂盒中包含的蛋白酶K中加入260μl蛋白酶K储存缓冲液，重构冻干的蛋白酶K至终浓度为20 mg / ml。涡旋溶液并储存在-20°C。
  3. 将48ml 100％乙醇加入12ml Genomic DNA Wash 2浓缩液中。
  4. 在300μlddH 2 O中悬浮冻干的RNase A至终浓度6.66mg / ml并储存在4℃。
2. 组织去石蜡化
  1. 在开始实验之前，将温热阻挡至55°C。
  2. 向每个含有组织的Eppendorf管中加入400μl脱蜡溶液。多次敲击管以确保组织完全溶解。
  3. 用脱石蜡溶液在55℃孵育组织1分钟。孵育1分钟后短暂涡旋管。＆nbsp;
  4. 离心Eppendorf管以在15,000 x g （1分钟，23℃）下将组织样品与脱石蜡溶液分离。小心地吸出溶液，确保不要去除任何组织。
3. 消化组织
  1. 准备主混合物。最终体积为100μl（表1）。主混合物的大量储备可以用于多种组织。
    
    表1. Master Mix Reagents
  2. 向含有脱蜡组织的每个Eppendorf管中加入100μlMasterMix，并在55℃下孵育至少3小时或过夜以进行组织消化。主混合物中脱石蜡组织的孵育时间对于组织的大小是主观的。对于较大的组织，最好在Master Mix中过夜，以确保完全消化组织。
  3. 在孵育结束时，将含有样品的Eppendorf管短暂离心（约1分钟）以收集盖子上孵育的任何冷凝蒸气。
  4. 将加热块温度设置为94°C，并在加热块的每个孔中加水，以平衡加热块的温度。＆nbsp;
  5. 在每个Eppendorf管上添加微管帽锁，以防止管意外膨胀，并在94°C下孵育样品20分钟。
  6. 让样品冷却至室温（约5分钟）并短暂离心。
  7. 将5μl重构的RNase直接加入溶液中（RNase终浓度为0.32mg / ml）。在样品之间更换移液器吸头以防止任何DNA污染。
  8. 短暂地（约10秒）涡旋样品管以确保溶液充分混合并在室温下孵育5分钟。
4. DNA的纯化
  1. 向每个管中加入350μl基因组裂解缓冲液（350μl）并短暂涡旋（约10秒）。
  2. 涡旋后，将样品管旋转1分钟。
  3. 每管加入135μl异丙醇。通过反转管多次彻底混合DNA溶液和异丙醇。
  4. 以12,000 x g （1分钟）离心异丙醇和DNA混合物，以旋转Eppendorf管中的任何不溶性碎片。
  5. 将含有DNA的上清液转移到与收集管连接的Zymo-Spin柱上，并以10,000 x g （1分钟）离心柱和收集管。
  6. 将旋转柱转移至新的收集管，并将400μl基因组DNA洗涤1缓冲液加入柱中，并以10,000 x g （1分钟）向下离心柱和收集管。
  7. 将旋转柱转移到新的收集管。将700μlGenomicDNA wash 2缓冲液加入旋转柱中，并以12,000 x g （1分钟）离心旋转柱和收集管。
  8. 从步骤A4g中倒出流出物并向旋转柱中加入200μlGenomicDNA wash 2缓冲液，并以12,000 x g （1分钟）离心旋转柱和收集管。离心后，将含有DNA的旋转柱转移到新的Eppendorf管中。＆nbsp;
  9. 为了从柱中洗脱DNA，将50μlDNA洗脱缓冲液加入旋转柱中，在室温下孵育5分钟。
  10. 离心含有DNA洗脱缓冲液的旋转柱，在21,130 x g 下离心30秒。
  11. 通过NanoDrop（ND-1000）测量DNA浓度。将DNA保存在-20°C的螺旋盖管或用封口膜密封的试管中。基因组DNA的预期产量应分别来自组织块和活检组织约15和2μg（图1）。
    
    图1.使用组织块和活组织检查样本比较DNA的产量和纯度。：一种。在肝组织块（n = 44）和肝活组织检查样品（n = 38）中测量DNA的产量（μg）。数据代表平均值±平均值的标准误差。通过NanoDrop测量DNA浓度。 *表示 P - 值＆lt; 0.05由学生 t - 测试。 B.肝组织块（n = 44）和肝活检样品（n = 38）之间260/280比率的比较。数据代表平均值±平均值的标准误差。在NanoDrop上测量DNA浓度的同时测定260/280比率。
使用来自FFPE组织的DNA进行PCR
1. 使用PCR扩增DNA＆nbsp;
  1. 将从FFPE组织中提取的DNA稀释至无核酸酶水中浓度为50 ng /μl的DNA。
  2. 每个PCR反应将使用20μl体积。组成正向和反向引物，Phusion Buffer，Phusion DNA聚合酶，dNTP和无核酸酶水的新的大量PCR库存。最后应将DNA聚合酶添加到该批量PCR混合物中。向0.65ml空Eppendorf管中，向每个管中加入19μl本体PCR混合物。向Eppendorf管中加入1μl50ng /μl（总共50 ng）模板DNA（表2）。
    
    表2.由一个PCR反应组成
  3. 使用以下条件在热循环仪中进行PCR：
    1. 初始变性：94℃，5分钟
    2. 40个周期：
      变性：94°C，30 s
      退火：54°C，2分钟
      延伸：72°C，1分钟
      最终延伸：72°C，10分钟
  4. 将PCR产物保存在-20°C或继续进行下一步。
  5. 在0.5x Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）缓冲液中浇铸含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶。浇铸凝胶后，在使用足够的聚合反应之前，让凝胶在室温下静置至少60分钟。
  6. 将4μl6x蓝色/橙色上样染料加入20μlPCR反应中（最终浓度1x）。在用溴化乙锭染色的0.5x Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）缓冲液中在2％琼脂糖凝胶上显现PCR产物。
  7. 用无菌剃刀刀片切除每个FFPE组织样品（图2）的感兴趣的DNA条带（即，我们的实验为339bp），并将条带置于空的Eppendorf管中。确保在每次PCR之间更换刀片以避免样品交叉污染。
    
    图2.优化PCR的模板DNA量。在PCR中使用来自两个不同手术切除肝组织的一系列DNA模板浓度（10-200ng）。 PCR产物和100碱基对（bp）DNA梯度在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳，并用BioRad Molecular XRS Imager显色。白色框表示我们感兴趣的339 bp DNA条带。
2. 使用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit＃D4007（Zymo Research，Irvine，CA）回收PCR产物
  1. 将三个体积（350μl）的ADB缓冲液加入含有DNA琼脂糖带的Eppendorf管中，并在55℃下孵育20-30分钟以完全溶解琼脂糖。
  2. 将溶解的琼脂糖DNA转移到与收集管连接的Zymo-Spin柱上，并在23℃下以13,000 x g离心1分钟。
  3. 丢弃来自收集管的流出物并用DNA洗涤缓冲液（200μl）（95％乙醇）洗涤旋转柱两次。每次洗涤在23℃下以13,000 x g 离心30秒。每次洗涤后可以丢弃收集管中的流出物。
  4. 为了洗脱纯化的DNA，将6μlDNA洗脱缓冲液直接添加到柱上，连接Eppendorf管并在23,000℃下以13,000 x g离心1分钟。流出物包含连接到柱上的Eppendorf管中的纯化DNA。 DNA可以在-20°C下储存。
3. 序列纯化的DNA产物
  1. 要测量纯化的PCR产物的浓度，请使用NanoDrop（图1）。
  2. 在0.65ml Eppendorf管中向40ng PCR产物中加入1μl2.3pmol/μl反向引物。添加额外的无核酸酶水，使最终体积为4μl。在封口膜中包裹PCR样品。这些条件由OUHSC分子生物学和细胞计数研究实验室DNA测序核心实验室使用。
  3. 使用Finch TV软件（Geospiza，Inc。）查看测序结果。对于c.521 T> C单核苷酸多态性，可以在图3中看到测序结果的实例。
    
    图3. OATP1B1的测序c。 521 T> C多态性。对339bp的扩增进行Sanger测序。阴影区域表示c的位置。 521 T> C.显示了C. 521 TT（A），TC（B）和CC（C）的代表性测序结果。

数据分析

学生的 t - 测试用于确定图1和4B中的统计显着性。双面 P - 值＆lt; 0.05表示统计显着性。

图4.使用两种不同试剂盒提取DNA的比较。 A.通过QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（肝脏1-3）或FFPE DNA分离试剂盒（提取物）提取三种相似大小的FFPE肝脏组织（ Zymo Research）（肝脏27-29）。通过NanoDrop测量DNA浓度。来自每个肝组织的DNA（100ng）在含有溴化乙锭的150％的2％琼脂糖凝胶上电泳。使用BioRad Molecular XRS Imager（BioRad，Hercules，CA）对琼脂糖凝胶成像。 B.使用Image Lab软件（BioRad，Hercules，CA）进行DNA≥400bp的密度测定，并表示为相对于Zymo Kit的倍数变化。 *， p ＆lt; 0.05由学生 t - 测试。数据代表平均值±标准偏差。

笔记

从最近的出版物中，从FFPE组织本身提取的DNA可以抑制实时PCR效率（Dietrich et al。，2013）。来自PCR中使用的FFPE的模板DNA的量对于PCR的成功是至关重要的。 “越多越好”由于过量DNA可能抑制PCR反应而不是更好。我们优化了在PCR中用作模板的提取的FFPE DNA的量。在含有dNTP（各0.5mM），引物对（每种0.5μM），1x Phusion缓冲液和2单位Phusion DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA）的20μl反应体积中，比较反应之间的PCR效率含有10,50,100或200ng的不同量的模板DNA。如图2所示，对于肝脏FFPE组织（＃4和＃5），与10ng模板DNA相比，每20μl反应50和100ng模板DNA产生比预期的339bp条带高得多的扩增量。我们的研究结果表明，对于使用FFPE组织和当前Phusion DNA聚合酶的成功PCR，模板DNA在20μl反应体积中不应超过100 ng。重要的是使用来自FFPE组织的优化量的模板DNA以确保有效PCR的成功，这是测序的先决条件。＆nbsp;
比较来自手术切除组织（1.5-2.5×1.5-2.0×0.2-0.3cm）和针芯活检标本（1.4-2.0×0.1-0.2×0.1-0.2cm）的FFPE组织的DNA提取效率。正如预期的那样，前者具有比后者更大的尺寸，切除组织的DNA产量显着高于活检组织（图1A）。来自两种类型组织的DNA的OD 260/280 值相当，均为1.6-1.9，表明DNA纯度很高（Desjardins和Conklin，2010）（图1B）。 OD值260和280的比率用于评估DNA和RNA的纯度，其中~1.8和~2的比率分别被认为是纯DNA和RNA。类似于图2所示，使用来自20μl体积的活组织检查FFPE组织的DNA（50ng）也成功扩增了339bp PCR产物（数据未显示）。来自不同组织的预期339bp PCR产物的测序能够区分所有三种基因型，c。 521 TT，TC和CC（图3以及原始出版物[Crowe et al。，2019]中所示）。来自手术切除和活检标本的FFPE组织都适合使用当前方法进行基因分型。该方法成功率高。提取DNA，通过PCR扩增，测序并使用该优化方法对100％的FFPE组织（组织块n = 47，活检标本n = 24）进行基因分型。
市场上有多种FFPE基因组DNA提取试剂盒。我们尝试了来自Qiagen的另一种试剂盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit），如图4A和4B所示。当比较相似大小的FFPE肝组织时，显然，与Zymo试剂盒相比，使用Qiagen试剂盒提取的DNA≥400bp较少。使用34ng模板DNA在20μl反应中，从Qiagen试剂盒中提取的DNA的PCR扩增是不成功的，类似于上述。我们相信Zymo FFPE DNA分离试剂盒（Zymo Research，＃D3067）是我们协议的最佳试剂。＆nbsp;
目前的协议报道Zymo DNA提取试剂盒（D3067）适用于从FFPE组织中提取DNA。尽管该方案仅用于FFPE肝组织，但我们预期该方案适用于其他FFPE组织并且不是肝特异性的。此外，该方法优化了适合PCR的FFPE组织中的模板DNA的量。该方案是可重复的，并且需要少量组织，甚至来自活检标本，以产生足够的PCR产物用于基于Sanger测序的OATP1B1基因分型。 521 T> C.该方法也已成功用于OATP1B1 c的另一种多态性的基因分型。 388 A＆gt; G（Crowe et al。，2019）。

食谱

10x Tris-Borate EDTA（TBE）缓冲液
1. 将108g Tris-碱和55g硼酸溶于900ml去离子水中
2. 向溶液中加入9.3g 0.5M EDTA，用去离子水将体积调节至1L
3. 缓冲液可以在室温下储存
0.5x Tris-Borate EDTA（TBE）缓冲液
100毫升10倍TBE缓冲液和1,900毫升去离子水

致谢

这项研究得到NIH R01 GM094268 [W. Y]和美国药学教育基金会博士前奖[A. C。]。该出版物中报告的研究部分得到了俄克拉荷马大学斯蒂芬森大学癌症中心授予的国家癌症研究所癌症中心支持基金P30CA225520的支持，并使用了分子生物学共享资源。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。 Alexandra Crowe是美国药学教育基金会的博士前研究员。我们要感谢Allison Gillaspy博士设计PCR引物。我们感谢OUHSC的分子生物学和细胞计数研究实验室使用提供DNA测序服务的核心设施。我们感谢Drs。 Wei Zheng，Kar-Ming Fung，Feng Yin和Erin Rubin为本研究提供FFPE组织。
＆NBSP;发布此方法的初始出版物是Crowe et al。，2019。

利益争夺

本研究没有竞争性的经济利益。

伦理

79例福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）存档的人肝脏（42例来自手术切除，37例来自肝活检）和正常肾组织块获自OUHSC Stephenson癌症中心生物样本采集核心和病理学部银行俄克拉荷马大学健康科学中心。俄克拉荷马大学健康科学中心的机构审查委员会批准使用人体组织（IRB编号：6347）。

参考

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