材料和试剂

30号针（BD，目录号：305128）
100毫米培养皿（Falcon，目录号：351029）
1.5 ml高压灭菌的无菌微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
SHARP精密屏障提示（Denville，产品目录号：P1120，P1121，P1122，P1126）
Twintec PCR 96孔PCR板，无色（Eppendorf，目录号：951020401）
Microseal B PCR板密封膜（Bio-Rad，目录号：MSB1001）
Qubit分析管（ThermoFisher，目录号：Q32856）
200μl移液器吸头（Fisherbrand，目录号：02-681-147或同等产品）
孕母血清促性腺激素（Biovendor，目录号：RP1782721000）
人绒毛膜促性腺激素（西格玛，目录号：CG10-10VL）
M2培养基（Millipore，目录号：MR-015P-5F）
透明质酸酶（Sigma，目录号：H4272）
Milrinone（Sigma，目录号：M4659）
RNase Away（Ambion，目录号：10328011）
β-巯基乙醇（西格玛，目录号：M6250）
RLT缓冲液（Qiagen，目录号：79216）
干冰
RNeasy Micro Kit（Qiagen，目录号：74004）
超纯水（AmericanBio，目录号：AB02128）
RNAClean XP珠子（Agencourt，目录号：A63987）
80％乙醇
10 mM dNTPs（Thermo Fisher，目录号：R1092）
RNase Inhibitor（Takara，目录号：2313A）
Maxima RNase H-minus RT 5x缓冲液（Thermo Fisher，目录号：EP0751）
Maxima RNase H-minus RT（Thermo Fisher，目录号：EP0751）
甜菜碱（Sigma，目录号：61962）
1 M MgCl 2 （Sigma，目录号：M1028）
Kapa HiFi HotStart ReadyMix（Kapa Biosystems，目录号：KK2601）
AMPure XP珠子（Agencourt，目录号：A63882）
70％乙醇
TE缓冲区（AmericanBio，目录号：AB14033）
Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher，目录号：Q32851）
高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦，产品目录号：5067-4626）
Illumina的Nextera XT套件
Oligos
1. 3'RT底漆
  5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3'（西格玛）
  注意：T30VN对应30 T，后跟“V”（A，C或G），后跟“N”（任何基数）。
2. 模板切换Oligo
  5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG + G-3'（Exiqon）
  注意：“rG”代表riboguanosine，而“+ G”表示最后一个脱氧鸟苷被修饰为锁定的核酸。
3. ISPCR
  5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（西格玛）
  注意：所有寡核苷酸应按脱盐顺序排序，并使用0.1x TE稀释至100μM，并在使用前储存于-20°C。
Master Mix 1（见食谱）
Master Mix 2（见食谱）
Master Mix 3（见食谱）

设备

解剖剪刀（精细科学工具，目录号：91460-11或同等学历）
弯曲尖端力（精细科学工具，目录号：11273-20或等效物）
钟表匠的钳子（精细科学工具，目录号：11251-20当量）
解剖显微镜（Laxco，LMS-S2103-LS200或同等产品）
1.0 ml移液器控制器（Hamilton，目录号：0010PC）
用于校准微毛细管移液器的吸气管组件（Sigma，目录号：A5177-5EA）
无灯丝毛细管（World Precision Instruments，目录号：1B100-6）
涡旋机（科学工业，目录号：00-SI-0236）
摆动式离心机（Eppendorf，型号：5810R）
96孔磁板（Alpaqua Magnum，型号：FLX A000400或同等产品）
96孔加热热循环仪（Bio-Rad，型号：S1000或同等产品）
Qubit荧光计（Invitrogen，型号：Q33226或同等产品）
Agilent 2100生物分析仪系统（Agilent，G2939BA，G2953CA）

程序

第一部分：卵母细胞分离

该方案应该产生~80-120个成熟卵母细胞和每个合并样品约200-300个未成熟卵母细胞（来自4只小鼠）。
注意：在开始该方案之前，如Xing（2010）所述，组装基于Hamilton移液管的微量移液管卵母细胞处理装置。有关输卵管切除和解剖的以下程序的详细信息可以在可视化实验期刊中找到（Duselis和Vrana，2007; Stein和Schindler，2011）。

RLT缓冲液制备
1. 用RNase Away彻底清洁移液器和工作区，以避免RNase污染。
2. 使用PCR级过滤嘴，在1.5 ml Eppendorf试管中加入10μlβ-巯基乙醇至1 ml RLT缓冲液中，用移液管充分混匀。
  注意：每个RNA样本需要350μl含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液。按比例增加体积以获得所需的最终体积。含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液可在室温下储存长达1个月。
3. 将含有β-巯基乙醇的350μlRLT缓冲液转移到两个1.5 ml Eppendorf试管中。
小鼠超数排卵和组织收获
1. 成熟的卵母细胞生成和输卵管隔离
  1. 用5IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）腹膜内注射4只3周龄雌性小鼠以诱导卵母细胞生长。
  2. 48小时后，用5IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）腹膜内注射这些相同的小鼠以诱导卵母细胞排卵。
  3. hCG注射后14小时，通过颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
  4. 使用消毒的细镊子和细剪刀从每只小鼠（共8个）中取出附有子宫角的输卵管。将组织置于未经处理的100 mm培养皿上的预热室温M2培养基液滴中。
  5. 将一个输卵管 - 子宫角样品一次转移到新的未处理的100 mm培养皿上的300μl预热的M2培养基滴。
  6. 在解剖显微镜下，使用两对制表师的镊子撕开输卵管的壶腹，并将卵丘 - 卵母细胞复合物释放到周围的介质中。
  7. 向滴剂中加入300μl0.6mg/ ml透明质酸酶（终浓度0.3mg / ml）。
  注意：为了优化RNA质量，在从小鼠中分离未成熟卵母细胞之前，直接进入方法C（步骤B2）。
2. 未成熟的卵母细胞生成和卵巢隔离
  1. 用5IU怀孕母马血清促性腺激素腹膜内注射4只3周龄雌性小鼠以诱导超数排卵。
  2. PMSG注射后四十四小时，通过颈椎脱臼对小鼠进行安乐死。
  3. 使用消毒的细镊子和细剪刀去除每只小鼠的卵巢（共8个）。将组织置于未处理的100mm培养皿上的预热室温M2培养基的液滴中。
  4. 将一个卵巢一次转移到新的100毫米培养皿上的新的300μl预热的M2培养基滴加10μm米力农。米力农有助于确保卵母细胞的中期停滞（Stein和Schindler，2011）。
  5. 向滴剂中加入300μl0.6mg/ ml透明质酸酶（终浓度0.3mg / ml）。
卵母细胞分离
注意：在处理未成熟卵母细胞期间，使用补充了10μm米力农的M2培养基。
1. 在解剖显微镜下，穿刺并用两个30号针轻轻解离组织，以帮助卵母细胞释放到周围的培养基中。
2. 通过使用微量移液管轻轻地并重复地移液卵丘 - 卵母细胞复合物，从卵母细胞中分离粘附的卵丘细胞。
3. 一旦裸露的卵丘细胞裸露，通过使用微量移液管将卵母细胞转移到未处理的100mm培养皿上的预热的M2培养基的新液滴中，洗涤卵母细胞三次。
4. 计算卵母细胞被吸入微量移液管时的总数。吸入尽可能少量的培养基（小于6μl），因为大体积会稀释RLT缓冲液。
5. 将计数的未成熟或成熟卵母细胞转移到含有预先制备的RLT缓冲液的相应Eppendorf管中。
6. 将管涡旋高速旋转45秒以使样品均匀化。将管置于干冰上，直至可在-80°C下储存。

第二部分：卵母细胞RNA文库制备

RNA分离
1. 在冰上解冻RLT样品。
2. 根据制造商的说明，使用RNeasy Micro Kit从解冻的样品中分离RNA。
3. 在14μl超纯水中洗脱RNA并储存在-80°C，直到准备好进行文库制备。
cDNA的产生
注意：对于所有热循环仪程序，加热盖应设置为105°C。在运行每个程序之前预热PCR机器。
1. 在步骤B4中使用之前，使RNAClean XP珠粒平衡至室温30分钟。
2. 准备Master Mix 1并放在冰上直到准备使用。
3. 将10μl每种RNA样品转移到96孔裙边PCR板的相应孔中。
4. 向每个样品中加入22μl（2.2x）RNAClean XP珠粒，轻轻吸取混合液。在室温下孵育10分钟。 RNA现在与珠子结合。
5. 将含有珠子和RNA的96孔板置于96孔磁板上并孵育5分钟。磁珠将沿着孔的侧壁聚集。
6. 使用多通道移液器小心去除上清液，不要打扰珠子。
7. 通过在珠子上轻轻移取100μl80％乙醇来洗涤珠子。静置1分钟，然后除去上清液，不要打扰珠子。
8. 重复步骤B7，总共进行两次乙醇洗涤。
9. 让珠子在磁铁上风干5分钟。
10. 从磁铁支架上取下96孔板，将每个干燥珠孔重悬于8μlMasterMix 1中。
11. 用Microseal B薄膜密封平板，在摇摆式离心机中快速旋转平板以从侧壁除去液体，并在72℃下孵育平板3分钟。这一步使RNA变性。
12. 立即将密封的96孔板置于冰上1分钟。该步骤使RNA二级结构形成最小化。
13. 准备Master Mix 2并放在冰上直到准备使用。
14. 每孔加入14μlMasterMix 2，总体积为22μl，轻轻移液混匀。
15. 用Microseal B薄膜密封平板并在摇摆式离心机中快速旋转平板以从侧壁除去液体。将板置于预热的热循环仪中，加热盖设置为105°C，并运行PCR程序1以执行RNA的逆转录。
  PCR计划1：
  50°C，90分钟
  85°C，5分钟
16. 准备Master Mix 3并放在冰上直到准备使用。
17. 逆转录后，在摇摆式离心机中快速旋转平板，从侧壁除去液体，除去粘合剂密封。
18. 每孔加入28μlMasterMix 3，总体积为50μl，轻轻吸取混合液。
19. 用Microseal B薄膜密封平板并在摇摆式离心机中快速旋转平板以从侧壁除去液体。将平板置于预热的热循环仪中，加热盖设置为105°C，并运行PCR程序2以扩增cDNA。
  注意：由于难以大量分离卵母细胞，加上文库制备和测序的高成本，我们在步骤B19中根据我们在步骤B31中使用等效输入数字获得的Qubit结果选择PCR扩增循环数。脾细胞理想地，PCR扩增循环数将使用相同细胞类型的测试样品和测序的输入细胞数凭经验确定。理想的cDNA终浓度为~0.5ng /μl，这允许进一步将cDNA样品稀释至0.2ng /μl。
  PCR计划2：
  98°C，3分钟
  然后是12个周期：
  98°C，15秒
  67°C，持续20秒
  72°C，6分钟
  其次是：
  72°C，5分钟
20. 在步骤B22中使用之前，使AMPure XP珠粒平衡至室温30分钟。
21. 在摇摆式离心机中快速旋转平板，从侧壁除去液体，取下粘合剂密封。
22. 向每个样品中加入35μl（0.7x）AMPure XP珠粒，轻轻移液以混合。在室温下孵育5分钟。 cDNA现在与珠子结合。
23. 将96孔板置于96孔磁板上并孵育6分钟。
24. 使用多通道移液器小心去除上清液，不要打扰珠子。
25. 通过在珠子上轻轻移取100μl70％乙醇来洗涤珠子。静置1分钟，然后除去上清液，不要打扰珠子。
26. 重复步骤B25，总共进行两次乙醇洗涤。
27. 让珠子在磁铁上风干5分钟。
28. 从磁铁支架上取下96孔板，将每孔干燥的珠子重新悬浮在40μl的1x TE缓冲液中，从珠子中洗脱cDNA 5分钟。
29. 将96孔板置于96孔磁板上并孵育5分钟。磁珠将沿着孔的侧壁聚集。 cDNA包含在上清液中。
30. 使用多通道移液器小心地将36μl来自每个孔的上清液转移到相同96孔板的新孔中（每个合并的样品一个孔）。
31. 根据制造商的说明，使用Qubit dsDNA HS试剂盒定量每个样品的cDNA浓度。
32. 根据制造商的说明，使用具有高灵敏度DNA试剂盒的2100生物分析仪可以分析cDNA质量。 PCR扩增的cDNA文库的平均大小应该是1.5-2kb，如代表性生物分析仪痕迹所述（Picelli 等人，，2014）。
33. 使用1x TE缓冲液将每个孔的cDNA浓度标准化至0.2ng /μl。
34. 使用Illumina的Nextera XT试剂盒以1 ng cDNA作为输入，继续生成RNA-seq文库。

数据分析

如上述方案中所述，从未成熟和成熟C57LB / 6J卵母细胞分离的总RNA产生cDNA。然后使用Illumina的Nextera XT试剂盒标记构建测序文库，并在NextSeq500上对配对末端75bp读数进行测序。使用RepEnrich（Criscione et al。，2014）比对策略将测序读数定位至680个LTR家族，并绘制在下面。先前已经公布了用于数据分析的详细方法（Treger 等人，，2019）。

我们观察到，与未成熟卵母细胞相比，成熟卵母细胞中680个LTR家族中197个的表达显着增加或减少超过两倍（图1）。这些197个LTR家族中的191个在成熟卵母细胞中被下调，并且仅6个LTR家族的表达 - 所有这些对应于病毒样30（VL30）元件或VL30相关LTR-在成熟卵母细胞中增加（图1）。 VL30元件是类似原病毒的逆转录元件，缺少包膜编码区，不编码完整的开放阅读框（Markopoulos et al。，2016）。 VL30表达由表皮生长因子和类固醇激素如雌二醇和黄体酮体外诱导（Courtney et al。，1982; Tzavaras et al。，2003）。 VL30型LTR的转录可以由生长因子和/或激素直接诱导，因为生发泡卵母细胞在中期II成熟并停滞。或者，这些LTR元件可以通过在卵母细胞成熟过程中激活的附近细胞基因的转录激活来协调调节。

图1.虽然VL30 LTR家族成员上调，但其他LTR成分的表达在成熟卵母细胞中全局减少。来自mRNA测序的显着差异表达的长末端重复序列（LTR）家族的火山图比较未成熟和成熟的卵母细胞。表达式中的log 2 倍数变化与DESeq2计算出的调整后的P值的负log 10 相对应（Love et al。，2014）。阳性倍数变化值表明在成熟卵母细胞中表达增加的LTR家族，而负倍数变化值表明在成熟卵母细胞中表达降低的LTR家族。使用本文提出的改进的基于Smart-seq2的方案产生mRNA测序文库。

食谱

Master Mix 1
2.5μM3'RT底漆，
2.5 mM dNTPs，
1单位/μlRNase抑制剂
制作8μl（每孔）Master Mix 1：
0.2μl100μM3'RT底漆
2μl10mM dNTP
0.2μl40U /μlRNase抑制剂
5.6μl超纯水
Master Mix 2
（1.4x Maxima RNase H-minus RT Buffer，
1.4M甜菜碱，12.9mM MgCl 2 ，
1.4μM模板切换Oligo，
1.4单位/μlRNA酶抑制剂，
2.9单位/μlMaximaRNase H-minus RT）
制作14μl（每孔）Master Mix 2：
4μl5xMaxima RNase H-minus RT缓冲液
4μl5M甜菜碱
0.18μl1MMgCl 2
0.2μl100μM模板切换Oligo
0.5μl40U /μlRNase抑制剂
0.2μl200U /μlMaximaRNase H-minus RT
4.92μl超纯水
Master Mix 3
0.4μMISPCR引物，
1.8x Kapa HiFi HotStart ReadyMix
制作28μl（每孔）Master Mix 2：
25μl2xKapa HiFi HotStart ReadyMix
0.1μl100μMISPCR引物
2.9μl超纯水

致谢

这项工作部分由霍华德休斯医学研究所（至A.I.）和NIH奖项R01 AI054359和R01 AI127429（至A.I.）提供支持。 R.T.得到NIH培训补助金（5-T32-GM00720540）和F30（5-F30-AI129265-02）的支持。该方案的缩写版本最初发表于“狼疮易感性基因座 Sgp3 编码内源性逆转录病毒表达SNERV的抑制因子”（Treger 等人，，2019）。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

将小鼠圈养在SPF条件下，并根据耶鲁大学IACUC指南（方案＃10365）提供护理。

参考

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