材料和试剂

培养管（Falcon 50毫升锥形离心立方体，Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
微型离心管，1.5毫升（Sigma-Aldrich，目录号：Z606340）
反应杯（Fisher Scientific，目录号：11547692）
微升注射器（Hamilton？：10微升和25微升注射器，Sigma-Aldrich，目录号：28615U，20735）
YPD中白色念珠菌的夜间培养
三乙基溴化锡（TET）（Sigma-Aldrich，目录号：288047）
FCCP（羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）
氰化钾（KCN）（Sigma-Aldrich，目录号：60178）
水杨酸羟肟酸（sham）（Sigma-Aldrich，目录号：S607）
Bacto蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：S71604）
酵母抽提物（Fisher Scientific，目录号：B11929）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：ALS7653）
KCL（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
NA2HPO4（Sigma Aldrich，目录号：S7907）
kh2po4（sigma aldrich，目录号：p9791）
HCl（Sigma-Aldrich，产品目录号：H1758）
抗生素A
硝普钠
酵母提取物蛋白胨培养基，2%葡萄糖（YPD）（见配方）
磷酸盐缓冲盐（PBS）（见配方）
注：50 mm tet、2 mm fccp、2 mm antimycin a和200 mm sham原料在无水乙醇中制备。在水中制备1 m KCN储备。等分试样应在-20℃下制备和储存。呼吸抑制剂有毒，在制备、处理和储存过程中应采取适当的安全措施。>

设备

氧气计-2K呼吸计（O2K芯）（奥地利奥罗博罗斯仪器公司）
孵化器（例如，>，新不伦瑞克TMInnova？44，Eppendorf，目录号：M1282-0002）
分光光度计（e.g.>，JenwayTM6305紫外/可见分光光度计，Fisher Scientific，目录号：11400539）
微型离心机（例如>，离心机5418，eppendorf，目录号：5418000017）
血细胞仪（Sigma-Aldrich，BR718605）
光学显微镜（例如，Cole Parmer，目录号：UY-48922-70）
高压灭菌器（e.g.>，astell scientifictm台式高压灭菌器，fisher scientific，目录号：12735375）

软件

Datlab 6（或更新版本）软件（Oroboros Instruments Corp）

程序

白色念珠菌>菌株通常保存在ypd琼脂平板上，并在ypd中在30°c的振荡培养箱（100转/分）中培养，这使酵母保持芽接状态，易于计数。替代增长媒体和/或条件可作为适当的实验使用。
在30°C（或希望在温度下）至少1小时内校准硼氧，或在氧通量读出之前，每室2.5毫升PBS稳定。在校准过程中，应将空气空间作为制造商的指令引入每个室内。
Add cells from an overnight culture to 3 ml fresh ypd（or other growth media as desired）to an od600of 0.1 and grow to an od600of 0.5，this represents a dividing population. 注释：白色念珠菌细胞在生长的稳定阶段不呼吸评价（图1，红酒吧）。
/ 图1白血病患者的呼吸率在2小时后恢复到最大限度，在30℃的新鲜媒介。呼吸率（>i.e.>，氧流每百万细胞，测量为o2flow per cells pmol/（s*mill））静态相细胞中的declines。我们发现，在新鲜介质抑制呼吸的水平上，两小时的生长。因此，建议将细胞从过夜培养物（O/N）转移到2小时前的新鲜介质，以测试呼吸抑制剂的有效性。通过ATP合成酶抑制质子转位的漏气呼吸（呼吸状态）被确定为与Tet Addition（160微米）和Uncoupled（最大）呼吸跟随FCCP Addition（10微米）。KCN被添加到1毫米的浓度，以抑制经典电子传输链（等）的活性。数据代表四个独立实验的平均±标准偏差。
收集1毫升在1.5毫升微型离心机管和离心机6000x g>1分钟。Discard媒体和Resuspend细胞骨盆在1毫升1x pbs。注：重要的是，你不在媒体上重新悬挂细胞，使它能够进一步生长，以免在呼吸器内获得稳定的读数。
计数细胞使用血小板计数和稀释在PBS中，以每呼吸器室3毫升总体积给出最终的细胞浓度为1×106细胞/毫升。呼吸计有两个室，用于比较实验或技术重复。一个或两个房间可能都取决于实验的需要。一个细胞悬浮液样本应稀释1:100，以计数。Add approximately 10微升of cells substration to one chamber of the hemocytometer（with coverslip in place）.View the cells using the 10X or 20X objectives as needed.在中央格里德广场计数所有细胞这使细胞X×104/ml的数量进一步稀释在PBS中，作为给予最终细胞浓度1×106细胞/ml的适当方法。
Add.2.5毫升细胞悬浮液，浓度为1×106细胞/ml，每呼吸器室1×10细胞/ml，并压缩止器以接触空气密封。
当氧气消耗速率稳定在一个恒定速率后，应测定呼吸速率（O2通量，PMOL/per second/million cells）。这可以作为稳定的氧通量阅读并作为例行的参考。呼吸速率。
当达到稳定的常规呼吸时，可使用插入每个腔塞注射口的10或25微升汉密尔顿微升注射器引入呼吸调节药物（图2a）。注射量应在2-25微升之间；应适当制备药物储备溶液。
注：给定呼吸抑制剂的最佳浓度可通过滴定实验确定，在滴定实验中，通过额外注射来增加抑制剂的浓度。应进一步注射每种药物，直到呼吸速率不再发生变化，表明已饱和。我们发现以下浓度适用于大多数念珠菌种类（表1）。>

表1。白念珠菌电子传递链复合物抑制剂的建议浓度
为了描述“泄漏”呼吸状态，在这种状态下，通过atp合酶的质子转移被抑制，将tet添加到160μm的最终浓度。呼吸速率将在5分钟内降低，然后趋于平稳，此后进一步添加tet将不会产生影响。泄漏呼吸速率应在tet添加后的最大抑制点测量，并表示呼吸水平与atp合酶上的质子移位无关。常规呼吸水平和泄漏呼吸水平之间的比率表明电子传输与atp产生的联系有多大，或者说呼吸是如何“耦合”的。这个比率也称为呼吸控制比率。
此后，为了测量最大电子传输链容量（非耦合呼吸），将fccp添加到最终浓度10μm。呼吸速率将增加，然后在5分钟内趋于平稳，此后进一步添加fccp将不会产生任何影响。此时，可以记录未耦合的呼吸水平。可采用常规呼吸与非耦合呼吸之比（非耦合控制比）并估算电子传输系统的储备容量，比值为1表示电子传输发生在最大值。
可添加经典呼吸抑制剂以检查AOX的诱导和平行呼吸途径的使用。氰化钾（kcn）、抗霉素a或硝普钠（一氧化氮供体）可分别添加至2 m m、2μm或1 mm的浓度。需要更高浓度的KCN（10 mm）来抑制平行通路（图2B）。
浓度为1mm的sham可抑制aox的产生。
注：经典呼吸抑制剂，如抗霉素A、KCN和一氧化氮，可在大约20分钟内诱导白念珠菌的交替氧化酶（AOX）活性（Duvenage等人，2019）。因此，sham可以在长时间滴定实验开始时应用，以防止aox活性，从而更准确地读取后续药物的抑制作用。以我们的经验来看，单靠假动作并不能明显地影响日常生活。呼吸作用，因为在酵母生长过程中不使用替代途径。>
数据可根据指示使用制造商的Datlab软件从呼吸测量记录道导出。呼吸速率表示为o2每个细胞的流量pmol/（s*mill）。如有必要，可在datlab中随时修改实验参数，如细胞浓度或添加到每个室的细胞体积。可以使用Oroboros Oxygraph提供的Datlab软件为任何给定时间段的呼吸速率选择数据点（自动计算平均呼吸速率），并导出到Microsoft Excel等电子表格程序中进行进一步分析。每种条件下应进行3～4个独立的生物复制，以复制生长条件、培养时间和接种od。

图2。将药物添加到氧合室以及由Datlab软件生成的呼吸测量跟踪数据示例。a.使用微升注射器演示药物添加到氧合室。b.用datlab软件实时绘制呼吸图的实例数据。添加一氧化氮供体、硝普钠（snp）和选择性氧化酶抑制剂水杨酸（sham），在指示的位置分别产生1-和2 mm的最终浓度。将氰化钾（kcn）添加到最终浓度为2 mm。

食谱

含2%葡萄糖（YPD）的酵母提取物蛋白胨肉汤（参考文献9）
1. 在高压灭菌烧瓶中，加入：Bacto蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，蒸馏水950 ml
2. 高压灭菌混合物（121°C，20分钟）
3. 添加50毫升无菌40%w/v葡萄糖（40%w/v葡萄糖储备分别高压灭菌）
磷酸盐缓冲盐（PBS）10x储备（参考文献6）
1. 将NaCl 80 g，KCl 2 g，Na2HPO414.4 g，KH2Po42.4 g，蒸馏水800 ml加入高压灭菌烧瓶；
2. 用盐酸将ph值调整到7.4
3. 加入蒸馏水至1L
4. 高压灭菌混合物（121°C，20分钟）

致谢

这项工作得到了威康信托医学真菌学和真菌免疫学战略奖097377/Z/11/Z的支持。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

Duvenage，L.，Walker，L.A.，Bojarczuk，A.，Johnston，S.A.，MacCallum，D.M.，Munro，C.A.和Gourlay，C.W.（2019年）。白念珠菌经典和替代呼吸模式的抑制导致细胞壁重塑和巨噬细胞识别增强。mbio>10（1）。
Grahl，N.，Demers，例如Lindsay，A.K.，Harty，C.E.，Willger，S.D.，Piispanen，A.E.和Hogan，D.A.（2015年）。线粒体活性和cyr1是白念珠菌毒性途径ras1激活的关键调控因子。plos pathog>11（8）：e1005133。
Helmerhorst，E.J.，Murphy，M.P.，Troxler，R.F.和Oppenheim，F.G.（2002）。白念珠菌线粒体呼吸途径特征>生物化学-生物物理-acta>1556（1）：73-80。
嗯，W.K.和Kang，S.O.（2001）。白念珠菌中编码选择性氧化酶基因家族的特征biochem j>356（pt 2）：595-604。
Hütter，E.，Unterluggauer，H.，Garedew，A.，Jansen-Dürr，P.和Gnaiger，E.（2006年）。高分辨率呼吸测定法——老龄化研究的现代工具。exp gerontol>41（1）：103-109。
磷酸盐缓冲盐（PBS）。（2006年）。冷泉harb protoc:doi:10.1101/pdb.rec8247。

Silao，F.G.S.，Ward，M.，Ryman，K.，Wallstrom，A.，Brindefalk，B.，Udekwu，K.和Ljungdahl，P.O.（2019年）。线粒体脯氨酸分解代谢激活白念珠菌中ras1/camp/pka诱导的丝状体plos genet>15（2）：e1007976。

Vincent，B.M.，Langlois，J.B.，Srinivas，R.，Lancaster，A.K.，Scherz Shouval，R.，Whitesell，L.，Tidor，B.，Buchwald，S.L.和Lindquist，S.（2016年）。真菌选择性细胞色素bc1抑制剂损害毒性并阻止耐药性的演变。细胞化学生物学>23（8）：978-991。

YPD媒体。（2010年）。冷泉harb protoc:doi:10.1101/pdb.rec12315.