材料和试剂

注射器
过滤器（Tisch Scientific，Millex，注射器驱动过滤装置，0.22微米）
石蜡切片
玻璃染色瓶（IMEB，SKU:SD-09）
检测小鼠组织上主要抗体的M.O.M试剂盒（Vector Laboratories，Inc.，目录号：PK-2200）
注：本试剂盒包括一级和二级抗体稀释用的封闭液和稀释液（保存在4°C下）。
生物素化山羊抗鼠igg抗体（载体实验室，目录号：BA-9200，4℃保存）
Vectastain Elite ABC HRP试剂盒（Vector Laboratories，目录号：PK-6101，储存温度4°C）
请在程序部分或食谱部分提及Vectastain Elite ABC HRP工具包。
生物素化山羊抗鼠IgG抗体（载体实验室，目录号：BA-9400，4°C保存）
大鼠抗鼠cd8α抗体[abd-serotec（现为bio-rad实验室），目录号：mca2694，储存于-20°C]
正常山羊血清[ Sigma Aldrich（现Millipore，Sigma），目录号：G9023-10ML，存储在-20°C]
甲苯胺蓝O（Sigma-Aldrich，目录号：T3260-5G）
0.1 m磷酸盐缓冲液（Albochemicals，SKU:b0787mv4w2）
二甲苯
乙醇
甲醇
h2o2
美国公共广播电视公司
永久计数（Fisher Scientific，目录号：SP15-100）
三羟甲基丙氨酸
封闭溶液（见配方）
备用溶液（见配方）
复染工作液（见配方）
DAB溶液（见配方）

设备

烧杯（Nalgene，目录号：1542106）
轨道振动筛（标签，目录号：3520）
常规光学显微镜（Wetzlar，Leitz Orthoplan）
烤箱

程序

注：在本方案中，染色不需要抗原检索。

选择石蜡切片
1. 如果可能的话，选择合适的载玻片（包括完整的组织切片），载玻片的日期（实验）和编号（块和载玻片）。
2. 用染色日期、抗体和稀释液、寄主物种用铅笔标记载玻片。
3. 将玻片放入玻璃染色罐中，小心不要刮伤其他玻片/组织。
  注意：一定要将玻片日期、编号、抗体、稀释度信息和开始时间记录在染色簿上，并用小表格填写。
幻灯片的预处理
1. 脱烷烃：在二甲苯中浸泡玻片：2 x 15分钟。
2. 100%乙醇（ETOH）：3 x 10分钟。
3. 新制备的100%甲醇，0.3%h2o2：20分钟去除内源性过氧化物酶（200毫升100%甲醇+2毫升30%h2o2）。
4. 再水化：以95%、90%、80%、70%、60%、50%和30%乙醇浸泡玻片1分钟。
5. PBS:3 x 10分钟。
阻止非特异性反应
1. 从玻璃容器中取出玻片，用纸巾擦去玻片上多余的PBS，小心不要干扰组织。
2. 每片加入500μl封闭液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 将载玻片放入底部有ddh2o的载玻片室中，在室温下放置1-2小时。
原代抗体
1. 从培养箱中取出玻片，丢弃封闭溶液，用纸巾擦拭吸收残留溶液，小心不要让组织干燥。
2. 每片加入500μl一级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 将载玻片放入同一载玻片室，底部为ddh2o，盖上载玻片室，在4℃下孵育过夜。
次级抗体
1. 将3个烧杯和染色罐装满PBS。
2. 一级抗体溶液倾析，如果不回收。依次冲洗3个烧杯，然后放入染色罐。
3. 将染色瓶置于室温下，至少更换5次PBS，间隔10分钟。最好将染色瓶放置在轨道振动筛上，该振动筛设置为慢速运动（60转/分）。
4. 每片加入500μl二级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
5. 将载玻片放入室温下的载玻片室中1小时。
三级抗体
1. 重复步骤5a-5c。
2. 加入500μl三级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 在室温下将滑梯放入滑梯室45分钟。
4. 重复步骤5a-5c。
DAB反应
1. 从染色罐中倒出PBS。
2. 轻轻地将DAB溶液倒入染色罐中10分钟。
3. 将DAB溶液倒入指定的废物容器中。在水容器中加入少量漂白剂，使DAB溶液失去活性。
4. 立即用h2o清洗玻片两次，以停止显色。
5. DAB反应产物为棕色。
反固定
1. 从染色罐中倒出h2o。
2. 把甲苯胺蓝工作液倒进罐子里。当组织既有蓝色也有棕色时，将复染液倒入容器中以停止复染。需要5-10分钟。
3. 用h2o:3 x 1分钟清洗载玻片。
4. 甲苯胺蓝染色细胞核呈蓝色。
脱水二甲苯渗透量
1. 脱水载玻片，30秒间隔，30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%。重复100%ETOH。
2. 二甲苯浸泡2次。
3. 攀登。
4. 将玻片放在平坦的表面上，并放在40°C的烤箱中，直到玻片干燥。
用显微镜检查玻片并记录结果。

软件

imagej（https://imagej.net/downloads“target=”\u blank“>https://imagej.net/downloads）

数据分析

免疫染色阳性细胞可用游离图像J定量。根据这个方案，cd8α阳性细胞主要存在于肾间质。潜在的背景和没有特定的绑定是最小的。enos-/-db/db小鼠在8周龄时自发发展为糖尿病肾病。这些小鼠在8至20周龄时用厄洛替尼（一种表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂）或载体（水）治疗。每只小鼠取6张照片，取平均值作为一只小鼠cd8α阳性细胞密度。从经载体处理的eNOS-/-db/db小鼠和经厄洛替尼处理的eNOS-/-db/db小鼠（图1）中，对4只小鼠肾脏中CD8A阳性细胞的数量进行了定量分析。 < >
图1。erlotinib抑制egfr活性可降低enos-/-db/db小鼠肾脏cd8α淋巴细胞的浸润。a.载体或erlotinib处理的enos-/-db/db小鼠肾脏cd8a染色的代表性图像。b.定量数据（n=4，p<；0.001）。该值以平均值±标准差表示。采用studentt检验进行统计分析。

食谱

封闭溶液
如果主要抗体是在小鼠（mab）中产生的，则使用m.o.mtm试剂盒（vector laboratories，inc，burlingame，ca）的封闭溶液。对于在非鼠宿主中产生的主要抗体，用来自次要抗体宿主的10%正常血清（在pbs中）阻断载玻片。例如，如果一级抗体是在兔子体内产生的，而二级抗体是在山羊体内产生的，则用10%的正常山羊血清（在PBS中稀释）堵住玻片。
1. 用M.O.MTM试剂盒中的稀释剂稀释单克隆抗体
2. 二级抗体宿主pbs中1%正常血清中非mab原代抗体的稀释
3. 用m.o.mtm试剂盒中的稀释液稀释生物素化山羊抗鼠igg（h+l）（1:200稀释）。用PBS稀释所有其他生物素化二级IgG（1:200稀释，载体实验室）
4. 使用前至少30分钟制备三级抗体并室温保存。向2毫升PBS中加入16μL试剂A，混合，然后加入16μL试剂B并混合。根据幻灯片的数量，准备适当体积的溶液
DAB解决方案
1. 将60 mg DAB（校准并储存在冰箱中）溶于200 ml 50 mm Tris HCl中，pH值7.4
2. 然后加入80μl的30%h2o2
3. 避光
将储备溶液埋入容器
1. 将100 mg甲苯胺蓝加入200 ml 0.1 m磷酸盐缓冲液中，pH7.2
2. 在黑暗中搅拌直到完全溶解。可能需要1-3天
3. 室温避光储存
埋入工作溶液
1. 使用10毫升注射器和0.2微米过滤器（Tisch Scientific，Millex，注射器驱动过滤装置，0.22微米）将30毫升储备溶液过滤到烧杯中
2. 加入170毫升0.1米磷酸盐缓冲液，pH值7.2
3. 室温下避光储存
  注意：工作溶液可以使用两次。

致谢

作者要感谢范德比尔特大学医学院（退休）的詹姆斯·麦卡纳博士对该方案的巨大贡献。这项工作得到了NIH拨款，DK51265，DK95785和DK62794（RCH，MZZ），DK103067（RCH）和范德比尔特奥布莱恩中心（P30DK114809）（RCH，MZZ），弗吉尼亚州功勋奖00507969（RCH）和范德比尔特肾病中心的支持。本研究方案来源于1997年在JHC发表的先前研究论文（McKanna和Zhang，1997）和许多其他出版物（例如，Zhang等人，1997年；Zhang等人，2018年）。

相互竞争的利益

相应的作者声明不存在利益冲突。

工具书类

Li，Z.，Li，Y.，Overstreet，J.M.，Chung，S.，Niu，A.，Fan，X.，Wang，S.，Wang，Y.，Zhang，M.Z.和Harris，R.C.（2018年）。抑制表皮生长因子受体激活与改善2型糖尿病肾病和胰岛素抵抗相关。糖尿病67（9）：1847-1857。

McKanna，J.A.和Zhang，M.Z.（1997）。大鼠脑内脂皮质素1的免疫组化定位对ph、冷冻和脱水敏感。j组织化学-细胞化学45（4）：527-538。

Zhang，M.Z.，Wang，J.L.，Cheng，H.F.，Harris，R.C.和McKanna，J.A.（1997）。大鼠肾单位发育中的环氧化酶-2。

Zhang，M.Z.，Wang，S.，Wang，Y.，Zhang，Y.，Ming Hao，C.和Harris，R.C.（2018年）。肾髓质间质cox-2（环氧合酶-2）在预防盐敏感性高血压和维持肾内髓质/乳头结构完整性方面至关重要。高血压72（5）：1172-1179。