材料和试剂

5号镊子（杜蒙特，目录号：21974-1）
安全镊子（WIHA，目录号：44518）
Vitrobot镊子（Ted Pella，目录号：47000-500）
微量移液管20、100和1000（Eppendorf，型号：研究）
薄膜过滤器，白色，单独包装。0.45μm，直径47 mm，无菌（Me 25 St，Whatman？，目录号：10401670）
一次性过滤装置，0.22μm，带聚丙烯外壳的无菌和非热原性聚醚砜膜（Puradisc 25 AS，Whatman？，目录号：6780-2502）
250毫升离心聚丙烯瓶（贝克曼库尔特，目录号：356011）
50毫升离心聚丙烯管（Nalgene，目录号3139-0050）
500毫升和1000毫升螺旋颈玻璃瓶（Duran？）
真空过滤装置（Duran？，目录号：XT09.1）
巧克力琼脂板（Beckton Dickinson，目录号：PA-254035.05）
蕾丝碳300网格（Ted Pella，目录号：01895-F）
Quantifoil®R 2/2 CU 200网格（Quantifoil Micro Tools GmbH，目录号：Q23209）
多孔碳300目网格（琼脂，目录号：AGS147-3）
Vitrobot滤纸（Ted Pella，目录号：47000-100）
仅限Cryo网格盒底座（Ted Pella，目录号：160-41）
Cryo格栅箱操纵杆（Ted Pella目录号：160-46）
氯丁橡胶手套（SETON，目录号：10STA002）
副膜（Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
培养皿（Fisher Scientific，目录号：11812532）
黄色吸管头（Sigma-Aldrich，目录号：EP4925000111）
蓝移液管尖端（Sigma-Aldrich，目录号：EP312400011）
淋病奈瑟菌（ATCC 43069）
铜绿假单胞菌pao1（自产）
鲍曼不动杆菌AB41（临床分离株）
振铃器1/4（Sigma-Aldrich，目录号：96724-100Tab），按照制造商的说明制备溶液（参考1）
胰蛋白酶大豆肉汤（oxoid，目录号：cm129），按照制造商的说明制备溶液（参考文献10）
Mueller Hinton肉汤（Oxoid，目录号：CM0405），按照制造商的说明制备溶液（参考文献11）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：7365-45-9），按照制造商的说明制备溶液（参考文献18）
改良Lowry蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23240）
乙醇96%（Sigma-Aldrich，目录号：16368）
乙烷（液化空气）
液氮（液化空气）

设备

通风柜（Flores Valles，型号：190级）
辉光放电装置（BALTEC，型号：CTA105）
迷你客栈（IKA？，型号MS2）
玻璃化机器人（FEI，型号：VitrobotTMMark III）
冷冻柜和冷冻转运站（GATAN，型号：626）
低温电子显微镜（FEI，型号：Tecnai F20 200千伏）配有CCD摄像机（FEI，型号：Eagle 4Kx4K）
轨道振动筛（Innova？44，孵化器振动筛系列，新不伦瑞克科学）
离心机（贝克曼库尔特，型号：Avanti J-20 XP）
离心机（贝克曼库尔特，型号：Allegra 25R）

软件

Vitrobot v1.05b051（FEI）
Tecnai版本4.3（FEI）
透射电镜成像与分析版本4.4（FEI）

程序

MVS隔离
1. 培养细菌株。
  1. 将0.1毫升的109细胞/ml悬浮液用无菌玻璃撒布器涂在巧克力琼脂平板表面并旋转平板，将淋病奈瑟菌ATCC 43069培养至融合。将培养板在37℃的5%co2培养箱中培养65小时。接种10到20个培养皿应提供足够的MVS。
  2. 将铜绿假单胞菌pao1培养在2 L烧瓶中，在37°C下用500毫升胰蛋白酶大豆肉汤培养5小时，将鲍曼不动杆菌ab41培养在2 L烧瓶中，在30°C下用500毫升米勒-辛顿肉汤培养15小时。将两种液体培养物以100转/分的速度在眼眶摇瓶中培养。
  该方案可应用于任何革兰氏阴性菌产生的MVS，因此，第一步是建立所研究菌株的生长条件。应确定研究MV产生的生长温度、大气、培养基组成、培养时间和搅拌。通常，液体培养基用于应变生长和mv恢复，但也可以使用固体培养基。该方案描述了在致病菌株中检测到新o-imv的生长条件。
2. 从液体培养基中分离铜绿假单胞菌pao1和鲍曼不动杆菌ab41的mvs。
  1. 在对数晚期（od1.8）恢复鲍曼a.baumaniab41和p.aeruginosa的肉汤培养。
  2. 将培养物放入250毫升无菌聚丙烯离心瓶中。
  3. 在10000x g下，在4°C下离心15分钟，使细胞颗粒化（Allegra 25R，Beckman Coulter）。
  4. 丢弃细胞并将上清液放入无菌螺旋颈玻璃瓶中。
  5. 使用真空过滤装置，通过0.45μm孔径的膜过滤器过滤上清液，去除剩余的细菌细胞。
  6. 将过滤后的上清液放入50毫升无菌聚丙烯离心管中，并在45000x g下在4°C下离心1小时（Avanti J-20离心机，Beckman Coulter）。
  7. 小心地丢弃上清液并保存颗粒（通常会得到非常小的颗粒）。< >
  8. 在50毫升50毫米的Hepes pH6.8中重新过滤颗粒，并使用注射器通过0.22μm孔径的一次性过滤装置进行过滤，并将过滤液保存在另一个50毫升的无菌聚丙烯离心管中。
  9. 在45000x g下在4°C下再次使囊泡颗粒化1h，并在500微升的h2o中重新使颗粒化。
  10. 用lowry法测定mvs浓度。为了通过低温透射电镜正确显示mvs，最终浓度为0.1-1 mg/ml的蛋白质是合适的。
  11. 根据每个特定菌株获得的mvs的产量，可调整用于再悬浮mv颗粒的最终体积。20-50微升应足以为低温透射电镜观测准备网格。
3. 从融合固体培养物中分离纯化淋病奈瑟菌的mvs。
  1. 通过在每个琼脂板中加入15毫升Ringer 1/4并使用细胞刮刀，从每个琼脂板中重新培养细胞和MVS。把所有的卷放在一个螺旋颈玻璃瓶里。
  2. 将再悬浮细胞放入250毫升无菌聚丙烯离心瓶中。
  3. 按照前面描述的步骤从A2C到A2K。
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玻璃化
1. 通过后面的拨动开关打开Vitrobot（图3A和视频1）。
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  视频1。细菌外膜囊泡的低温透射电镜 < >
2. 将加湿器装满蒸馏水。
  用60毫升蒸馏水注满注射器，并通过底部的塑料管注射（图3A和视频1）。
3. 使用Vitrobot用户界面的“控制台”页面打开舱灯。
4. 更换吸墨纸。
  手动拉出Vitrobot腔室的前门，从吸墨纸垫上取下塑料环，将新的滤纸贴在塑料环上，并将其夹在吸墨纸垫上（视频1）。
5. 使用Vitrobot用户界面设置条件。
  1. 在“控制台”页面上，将试验箱的条件设置为25°C和100%湿度（图3b和视频1）。
  2. 进入“选项”页面，设置吸墨纸和冷冻条件如下：吸墨纸偏移量0，吸墨纸总数1，吸墨纸时间2.5，等待时间120秒，插入时间0和排水时间0（图3c和视频1）。
  3. 还可以设置其他用户详细信息：勾选“使用踏板”和“关闭半自动栅格”（图3c和视频1）。
  注：每种样品均需调整吸液和冷冻条件。这里描述的条件证明适合于不同菌株的细菌mvs。
6. 准备工具。
  将一些乙醇和氮气以7巴的压力涂抹在镊子的尖端。同时在与液氮接触的金属和塑料零件上施加氮气，以尽量减少粉尘污染。金属部件包括液态乙烷容器、格架盒支架和主轴；塑料部件包括格架盒和格架盒容器（在我们的例子中，是改进的猎鹰管）（图3d和视频1）。
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  图3。玻璃化。a.玻璃化机器人Vitrobot Mark III Fei。黑色箭头指向气候室，白色箭头指向加湿器，白色箭头指向样品注入窗口。b.“控制台页面”中的Vitrobot设置。c.“选项页”中的Vitrobot设置。d.Vitrobot配件：1、改良Falcon管；2、防沾污环；3、冷却剂容器；4、Cryo格栅箱操纵杆；5、Cryo格栅箱底座；6、格栅箱支架；7、主轴；8、乙烷容器；9、Vitrobot镊子。e.固定在中心轴连接槽上的Vitrobot镊子。黑色箭头指向网格，白色箭头指向连接槽。f.气候室内的vitrobot镊子。黑色箭头指向吸墨纸。g.液体乙烷中的冷冻固定网格。白色箭头指向乙烷容器，黑色箭头指向低温栅格盒底座。
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7. 冷却冷却液容器。
  将乙烷容器、格架箱支架、格架箱、主轴和防污染环安装在冷却液容器中，并用液氮填充容器的外圈，直到所有部件冷却。当液氮停止沸腾时，所有部件都已冷却（视频1）。
8. 冷凝乙烷。
  将乙烷气瓶的出口端放在乙烷容器内，打开气瓶主阀，缓慢液化乙烷。当液体乙烷表面的气泡到达主轴底部边缘时，关闭乙烷气缸主阀并拆下主轴（视频1）。
9. 准备网格。
  将用于实验的网格放置在固定在培养皿板内的一块副膜上，并将网格带到辉光放电单元（图4a）。
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  图4。辉光放电。a.辉光放电装置BALTEC CTA 005。黑色箭头指示腔室中栅格的位置。b.辉光放电设置。
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10. 辉光放电栅极。
  1. 取下培养皿盖，确保所有网格的碳面朝上。
  2. 手动拉起辉光放电装置的腔室门，将打开的包含网格的培养皿板放在里面，然后拉下门（视频1）。
  3. 将定时器设置为30秒，电流值在2至6毫安之间（图4b）。
  4. 按下后面的拨动开关，等待真空室达到大约10-1毫巴（指示面板上压力的红色LED将变为黄色），然后按“开始”打开紫外线灯（视频1）。< >
  5. 等待设定时间，紫外线灯将自动关闭（视频1）。
11. 从辉光放电单元上拆下格栅。
  1. 关闭开关，等待腔室通风（声音将停止）（视频1）。
  2. 手动拉起试验室的门，取出包含网格的培养皿板，关闭试验室的门，并将网格转移到Vitrobot（视频1）。< > 辉光放电后，液体样品更容易在网格表面扩散。充电后一小时内使用电网，否则需要重新充电。
12. 踩下脚踏板或在Vitrobot界面中选择“放置新网格”。
13. 在Vitrobot镊子上安装一个网格（视频1）。< > 将Vitrobot镊子的滑块放在上部位置，小心地用边缘连接一个网格，并将滑块锁定在最近的镊子槽上。
14. 将镊子固定在中心轴的连接槽上。
  样品必须沉积在网格的碳侧。当固定Vitrobot镊子时，网格的碳侧应朝向左侧或右侧，这取决于操作员使用哪侧入口来存放样本（图3e和视频1）。
15. 把镊子搬进气候室。踩下踏板或选择“开始过程”（图3f和视频1）。
16. 将冷却液容器放在平台环上（视频1）。
17. 朝气候室方向升起冷却液容器。< > 踩下踏板或选择“Continue”（继续）（视频1）。
18. 将Vitrobot镊子降到样本应用位置。< > 踩下踏板或选择“Continue”（继续）（视频1）。
19. 将样本应用到网格。
  打开气候室的侧端口，用微量吸管（视频1）涂抹3μl。
20. 启动吸吮和冷冻。< > 踩下踏板或选择“Continue”（继续）并等待冷却液容器和镊子降下（视频1）。
21. 小心地从Vitrobot中心轴的凹槽中取出镊子。
  将冷却液容器和镊子转移到工作台上（视频1）。在此步骤中，请小心将网格保持在液态乙烷表面以下。
22. 等到乙烷云散开，慢慢地将网格提升到乙烷表面。< > 一旦电网完全断开，快速将其插入含有液氮的外圈，并将电网转移到电网盒的位置（图3g和视频1）。
23. 重复步骤b16-b26，直到所有样品都被冷冻固定。
  必要时，用另一个空容器覆盖乙烷容器几秒钟，使液体乙烷解冻。
24. 存储网格。
  1. 当所有冻结网格都在网格框内时，冷却操纵杆并将其拧到网格框的中心（视频1）。
  2. 将网格盒转移到液氮下的预冷网格盒容器中并将其关闭（视频1）。
  注意：如果不打算在同一天观察到样品，则将格子盒容器存放在装有液氮的杜瓦瓶中。
25. 关闭Vitrobot。
  将冷却液容器放在通风柜中，用于液氮和液态乙烷的蒸发，并在Vitrobot用户界面中选择“退出”。当灯关闭时，中轴处于停车位置且界面已关闭，请关闭设备背面的拨动开关。
  < >
低温透射电镜观察
1. 准备冷冻显微镜。< > 将装有液氮的杜瓦中的网格转移到冷冻显微镜室，并将显微镜的防污染装置冷却至少1h（视频1）。
2. 确保阀门关闭。
  转到“设置”选项卡。如果“Col.valves closed”（列阀关闭）按钮不是黄色，请单击它（视频1）。
3. 按“turbo on”（视频1）。
4. 准备所有附件（图5a），并用冷绝缘材料（软木板、气泡膜……）盖住显微镜的桌面。
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  图5。将格栅安装到冷冻架上。a.附件：1、盖子；2、漏斗；3、冷冻转运站；4、平台；5、卡环工具。b.低温转运站中低温保持器GATAN656的俯视图。黑色箭头指向冷冻转运站，白色箭头指向冷冻架。c.低温转运站详情。1，冷冻架尖端；2，冷冻网格盒底座。黑色箭头指向低温保持架顶端网格的位置。< > < >
5. 冷却冷冻柜。< > 将冷冻柜放入转运站，将液氮注入冷冻柜杜瓦和冷冻柜站进行冷却。将控制站的电缆连接到低温保持架，等待温度低于-165°C（视频1）。
6. 准备冷冻架尖端。
  1. 将格栅箱转移到其在转运站平台上的位置，并小心地拧松并拆下杆（图5B和5C以及视频1）。
  2. 通过向后滑动低温保持架中心轴末端（杜瓦瓶正后方）的圆形件打开低温屏蔽，用工具移除卡环并将其置于液氮下（视频1）。< > 注意：卡环工具的尖端有两个凸耳，通过转动手柄的两个轮子可以将其相对或连续放置。要从低温保持架尖端拆卸卡环，将两个卡舌放在一起，将它们放在卡环周围的凹槽中，移动车轮使卡舌相对放置并向上拉。
7. 将格栅安装在低温保持架尖端。
  冷却镊子尖端，将其中一个网格转移到冷冻架尖端的槽中，用卡环工具将其固定，并关闭样品上的冷冻屏蔽，以防止冰污染（图5c和视频1）。要用卡环固定网格，请将卡环放在网格上，按下卡环工具，转动手柄的轮子，直到卡舌相邻，然后拆下工具。
8. 断开控制站电缆与低温保持架的连接（视频1）。
9. 在ComputeStage下准备一个聚苯乙烯盒子（视频1）。
10. 按“预泵气锁”（视频1）。
11. 从低温转运站快速取出低温保持架，并小心地将低温保持架的尖端穿过显微镜的孔尽可能远地引入（视频1）。
12. 向右旋转低温保持架，直到其枢轴与Compustage凹槽匹配。将低温保持架轻按在显微镜上，等待“真空概述”（视频1）中的倒计时结束。向右旋转低温保持架时要小心，以免液氮落到步骤c9中制备的聚苯乙烯盒上。
13. 选择“冷冻架”作为样本架。
14. 在“真空概述”中的倒计时结束后，将低温保持架尽量向左转动，并将其完全引入显微镜中（图6a和视频1）。
15. 迅速用液氮重新注入低温保持器的杜瓦瓶（视频1）。
16. 将控制站的电缆连接到低温保持架上，检查温度是否不超过-170°C（视频1）。
17. 单击“Col.Valves Closed”（Col.Valves关闭）并转到“LowDose”（低剂量）选项卡（视频1）。
18. 在低剂量条件下记录图像，光斑尺寸为5。
  X7800和0.10E-/_2S的搜索模式，X29000和0.80E-/_2S的聚焦模式，X29000和1.00E-/_2S的曝光模式（图6B和视频1）。
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  图6。低温透射电镜观察。a.低温电子显微镜tecnai f20-fei.黑色箭头表示低温保持器的位置。b.低剂量观察。