材料和试剂

注意：

所有试剂都可以是其他品牌的。
树脂既可用于AKTA设备，也可用于人工净化，这取决于处理样品的体积。例如，当样品超过100毫升时，使用AKTA比手动净化节省了手动港。

< >

接种回路
2 L锥形烧瓶
250毫升离心瓶
微量加样器
200μl PCR管
1.5毫升Eppendorf试管
0.22μm过滤器
吸管尖头
大肠杆菌菌株DH5α（上海维迪生物技术，目录号：DL1001）
大肠杆菌菌株BL21（DE3）（上海维迪生物技术，目录号：EC1002）
bglii（浓度：10单位/μl）（neb，目录号：r0144s），储存于-20°C
无损检测i（浓度：20单位/μl）（NEB，目录号：R0111S），储存于-20°C
T4 DNA连接酶（浓度：350单位/μL）（Takara，目录号：2011a），储存于-20°C
氯化钠（国药化学试剂，目录号：10019318）
胰蛋白胨（类氧化合物，目录号：2336957）
酵母（Oxoid，目录号：210408）
琼脂（oxoid，目录号：lp0011b）
卡那霉素（国药化学试剂，目录号：XW253899403）
管道（Sigma-Aldrich，目录号：p1851-100g）
（NH4）2SO4（国药化学试剂，目录号：10002917）
mgso4（国药化学试剂，目录号：20025117）
D（+）-葡萄糖（国药化学试剂，目录号：63005518）
三羟甲基氨基甲烷（Amresco，目录号：252859-100g）
甲醇（国药化学试剂，目录号：1001418）
异丙醇（国药化学试剂，目录号：80109218）
无水乙醇（国药化学试剂，目录号：10009218）
增强型bca蛋白检测试剂盒（beyotime，目录号：p0009）
nah2po4（国药化学试剂，目录号：20040818）
Na2HPO4（国药化学试剂，目录号：20040617）
K2HPO4（国药化学试剂，目录号：20032117）
kh2po4（国药化学试剂，目录号：10017618）
NaOH（国药化学试剂，目录号：10019762）
甘油（国药化学试剂，目录号：10010618）
柠檬酸（BBI，目录号：A610055-0500）
B-PER（赛默飞世尔，目录号：78243）
Millipore ECL（Millipore，目录号：WBKLS0010），2-8°C保存
Capto L树脂（GE Healthcare）
Kappaselect预包装柱1 ml（GE，目录号：17545811）
预处理2x FastTaq PCR Supermix（Miozyme，目录号：AX111），储存于-20°C
Primestar Max DNA聚合酶（Takara，目录号：R045A），储存于-20°C
AXYPREPTMPCR清洗试剂盒（AXYGEN，目录号：AP-PCR-250G）
axypreptm质粒微制备试剂盒（axygen，目录号：ap-mn-p-250g）
AXYPREP TM DNA凝胶提取试剂盒（AXYGEN，目录号：AP-GX-250G）
PLM培养基（见食谱）
缓冲区A（见配方）
缓冲区B（见配方）
TAE缓冲液（见配方）

设备

BS 210S电子天平（Sartorius）
电子分析天平（梅特勒-托莱多）
垂直蛋白质电泳槽（Bio-Rad）
GIS凝胶成像分析系统（Ⅱ）
贝克曼库尔特-阿凡提J-E离心机（贝克曼库尔特）
离心机（Eppendorf，型号：离心机5418R）
lrh-70f生化培养箱（tensuc）
ts-200b台式恒温振荡培养瓶（tensuc）
HH-4恒温水浴（友联）
sw-cj-ifd型超净工作台（苏静）
海尔hycd-205冰箱
-80°C冷冻箱（海尔）
台式pH计FE20K（梅特勒-托莱多）
SS325高压灭菌器（tomy）
TS-2型漂白摇床（齐林贝尔）
Milli-Q Advantage A10超纯水表（微孔）
电鼓风干燥炉（一恒）
PCR用热循环器（Bio-Rad）
多功能微型读板器Infinite M200 Pro（帝肯）
Akta Avant 150（通用电气）

软件

引物5

程序

抗vegf-fab表达质粒的构建及其对大肠杆菌的转化注意：
1. 根据引物和聚合酶的TM，设置合适的PCR反应条件，根据质粒的限制性位点选择合适的限制性内切酶。
2. E.> DNA序列可以从模板中扩增出来，也可以由通用生物系统公司（滁州、安徽、中国）等公司合成。
3. <> EM质粒pPHOA可通过插入双PoA启动子和STII信号肽而从PRSF二元等商业质粒中获得。
4. 转换方法适用于本协议中提到的所有转换。
1. 根据图1所示的过程，根据公布的序列合成编码抗vegf fab表达盒vl-cl、phoa启动子、stii肽和vh-ch1的整个dna片段。
2. 分析骨干载体和fab片段序列，确定双酶切和连接位点。< > E.>注释：如果不存在受欢迎位点，则可以使用重组酶介导的同源灌注方法。
3. 用primer 5.0软件设计具有所选限制性内切酶的引物。为了简化fab片段插入载体的过程，最好由一家公司（例如中国安徽滁州通用生物系统公司）合成stii-vl-cl-phoa-stii-vh-ch1。
  注：为了将目标片段插入到骨干载体中，我们首先确定了产生成对粘端的限制性内切酶。我们选择了ndei，它将翻译起始密码子atg作为上游位点。对于下游站点，可以选择列在向量的多个克隆站点中的任何一个。在我们的研究中，我们选择了bgli i，载体可以被ndei和 bglii得到线性主干。然而，靶片段相当长（约2kb），并且还有另外两个bglii位点，使得用bglii无法消化靶片段。因此，我们使用bsaⅠ酶，设计了与bgl相同的粘端。然后我们设计了具有ndei位点的正向引物和具有bsa i位点的反向引物，以扩增合成模板的片段。最后，< < NE> < Bsa >酶消化片段与<< E/E> E> < NDE I和 Bgl EM> II酶消化主干，构建表达VEGF-Fab的重组质粒。
4. 提取主干向量。
5. 制备stii-vl-cl-phoa-stii-vh-ch1的靶片段。
  1. 用上述设计的引物（表1）扩增stii-vl-cl-phoa-stii-vh-ch1片段。
    1. 将反应试剂加入200μl PCR管中，如表2所示。
      < > 表1。用于PCR或测序的引物序列
      *引物m1和m2分别具有ndei和bsai消化位点。
      < > 表2。扩增stii-vl-cl-phoa-stii-vh-ch1片段的pcr反应配方
      < >
    2. 将PCR程序设置为：98℃变性10s，55℃退火5s（根据Primestar Max手册，当计算得到的tm值在60℃左右时，退火温度可以设定在55℃，72℃延长30s（延长时间取决于聚合酶和靶片段的长度，这里靶片段约为2kb），循环35个周期。
  2. 用ndei和bsai消化stii-vl-cl-phoa-stii-vh-ch1 pcr产物，用双酶bglii和ndei消化骨干载体，得到所需的粘端。
    1. 将反应试剂加入1.5mL的Eppendorf试管中，如表3所示。
      < > 表3。双酶消化反应配方
      < >
    2. 将混合物在37°C水浴中培养1h。
  3. 用1%琼脂糖凝胶电泳分离消化的pcr片段或主链。
  4. 用AXYPREP TM DNA凝胶提取试剂盒从凝胶中回收靶条带。
6. 将片段连接到主干载体上，然后将其转化为大肠杆菌。
  1. 如表4所示，将反应试剂加入200μl PCR管中。
    < > 表4。结扎反应配方
    < >
  2. 将混合物在16°C的热循环器中培养30分钟。
  3. 按照以下步骤用结扎混合物转化大肠杆菌dh5α株。
  4. 将大肠杆菌活性细胞放在-80°C的冰上解冻。
  5. 将10μl结扎产物加入溶化的大肠杆菌活性细胞中，在冰上孵育20分钟。
  6. 在预热的42°C水浴中加热混合物80秒，然后在冰上再培养2分钟。
  7. 在干净的工作台上向试管中加入600μl新鲜lb肉汤。
  8. 将细菌在37°C、220转/分的恒温摇瓶中培养40分钟。
  9. 以2150x g离心管5分钟，丢弃大部分上清液，保留约200μl液体，并将细菌重新悬浮在干净的工作台上。
  10. 然后将其涂在预先准备好的lb板上（包括100μg/ml卡那霉素）。
  11. 在37°C培养箱中将板倒置过夜（放置倒置的板可以防止凝结物滴到培养基上，避免污染，促进生长、重复性和菌落计数），然后验证克隆的正确插入。
    1. 用表1所列的引物，在5μl灭菌ddh2o中挑选一个克隆进行菌落pcr验证。
    2. 将反应体系加入200μl PCR管中，如表5所示。
      < > 表5。菌落PCR反应配方
      < >
    3. 将PCR程序设置为：95℃变性10s，54℃退火5s，72℃延长30s，共35个周期。引物列于表1。
    4. 采用1% DNA琼脂糖凝胶电泳（TAE缓冲液）（配方4）对PCR产物进行验证。
    5. 其余pcr阳性克隆进一步在lb培养基中培养，以确定所需fab序列的正确插入。< >
      < >
  12. 通过测序确认stii vl cl phoa stii-vh-ch1片段的正确插入，得到重组pphoa fab质粒，如图1所示。< > < >
    图1。pOPHA Fab质粒的构建过程，合成了 NDE I和 Bgl II的骨架载体连接，获得重组质粒pOPHA Fab。< >
  13. 用axypreptm质粒miniprep试剂盒培养测序正确插入的dh5α克隆，以提取重组质粒pphoa fab，如图1所示。
  14. 利用构建的pphoa-fab，采用相同的热休克程序（步骤a6e至a6l）进一步转化bl21（de3），成功转化的克隆作为抗vegf-fab表达的表达宿主菌株。
  15. 将转化菌dh5α和bl21（de3）等分，加入甘油至最终浓度20%，并在-80℃下保存以备将来使用。
    
    < >
抗vegf-fab的细胞外表达
1. 从-80°C取一小瓶含有pphoa fab的bl21（de3），放在冰上5分钟。
2. 用接种环将解冻的bl21（de3）转移到lb琼脂板（含100μg/ml卡那霉素）中，在37℃下培养过夜。
3. 从lb板上取一个克隆，接种到含有5ml lb肉汤（含100μg/ml卡那霉素）的试管中。< > 注：
  1. 预培养大约需要12-14小时，因此最好在晚上执行此步骤，以确保使用新鲜大肠杆菌进行接种。
  2. 不同品牌的LB培养基成分是一致的，因此可以使用任何合格的LB培养基。
4. 细菌在37°C，220转/分的振荡培养箱中培养12-14小时，不超过16小时。
5. 将5ml培养液接种于含卡那霉素100μg/ml的新鲜lb肉汤800ml中。< > 注意：使用2L锥形烧瓶。磅中等体积不应占容器总容量的40%以上。
6. 在37°C，220转/分的温度下培养细菌，直到od600达到0.8-1.0。
7. 将细菌转移到一个已消毒的250毫升离心瓶中，在室温下以4000x g离心10分钟使细菌颗粒化。
  注意：此步骤应在干净的工作台上执行。
8. 弃培养上清液，用800 ml灭菌PLM培养基再悬浮细菌颗粒。< > 注：PLM培养基经化学改性，不含磷酸盐。此步骤应在干净的工作台上执行。这里取1毫升培养基进行分析，标记为“pre”。
9. 在PLM培养基中培养细菌，温度为20°C，振荡速度为200转/分钟，约12-14h。PLM培养基中磷酸的缺乏促进了蛋白质的诱导。
10. 诱导后，在水浴中迅速将孵育温度提高到59℃，孵育1h以提高fab产率。< > 注意：这一步可以在一定程度上提高细胞外产量，跳过也可以。
11. 然后，在水浴中迅速将培养物冷却至室温，并在3500x g下离心10分钟，分离培养基和细菌颗粒，表达的抗vegf fab大部分应留在培养基中。
12. 收集培养基并在12000 x g下进一步离心10分钟，以进一步去除污染物。
  注意：离心前，取2份培养液进行分析，每份1毫升，标记为“ind”。
  < >
抗vegf fab的纯化注：
1. Capto L与人IgG的I、III和IV型Kappa轻链结合，但不与II型结合。
2. kappaselect树脂可用于纯化具有ii型igg-kappa轻链的蛋白质。纯化过程与capto l相似，但以ph 7.4的pbs缓冲液为缓冲液a，ph 2.7的0.1m甘氨酸缓冲液为缓冲液b。
1. 通过0.22μm过滤器过滤表达培养基，以进行随后的柱层析纯化步骤。
2. 用20%乙醇以2毫升/分钟的速度清洗A、B泵和试管，直到UV280达到基线，制备AKTA Avant 150。
3. 以0.5ml/min的流速将预先包装好的Capto L柱组装成1ml的柱体积（Cv），并继续以2ml/min的速度用20%乙醇清洗系统，直到紫外线280 nm和条件基线稳定。
4. 然后，用相同的程序用ddh2o重复洗涤，直到uv 280 nm和cond基线稳定。
5. 将B1管头放入缓冲器B中，并用缓冲器B填充管。
6. 将a1管头置于缓冲液a中，并使系统和柱平衡10-20 cv，直到uv 280 nm和cond达到基线。
7. 收集流经的样品时，以0.5毫升/分钟的流速将样品装载到柱上。< > 注意：收集1毫升流动液进行分析，标记为“FL”。
8. 加载后，用缓冲液A清洗色谱柱，直到紫外280 nm达到基线。
9. 设b泵液比为100%，用缓冲液b以1.0ml/min的流速洗脱目标蛋白，当有uv280峰时收集目标蛋白。
10. 立即用1 M Tris缓冲液（pH 9.0）调节采集样品的pH值，以防止蛋白质失活。< > 注：取洗脱蛋白样品进行分析，标记为“E”。
11. 在洗脱基线稳定后，用10至20 cv ddh2o冲洗管子，直到紫外线和cond基线稳定。
12. 然后，用15 mm NaOH冲洗管和柱，以清洁柱。在uv280基线稳定后，依次用ddh2o和20%乙醇清洗系统、色谱柱和试管。
13. 最后，用20%乙醇填充管道并拆卸预包装的塔，该塔也应保存在20%乙醇中。
14. 用SDS-PAGE和western blot（WB）对收集的蛋白质进行检测。
  < >
  图2。fab生产的表达和纯化工艺方案（Luo等，2019a）

数据分析

从采集的样品“ind”中取一份，在3500x g下离心10分钟，分离培养基（标记为“medi”），并使用b-per在室温下培养15分钟，以释放细胞内可溶性蛋白质。
在12000x g下离心30分钟，在4°C下分离细胞内可溶性（标记为“sup”）和不可溶性（标记为“ib”）部分。
为了研究抗血管内皮生长因子Fab表达的分布，通过SDS-PAGE（图3A）和WB（图3B）分析所有样本Pre、Ind、Medi、Sup和IB。以羊抗人kappa轻链抗体作为捕获抗体，兔抗羊igg抗体与hrp结合作为第二抗体。
纯化过程（图4a）可以通过SDS-PAGE分析，FL，E和E（图4B）。
为确定Fab抗体的纯度，可在AgLunter 1260 HPLC系统中用TSK G2000 SWXL柱（5μm，0.78×300 mm）进行大小排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）测定。每个Fab的纯度可以计算为检测到对应峰的面积百分比。
用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）可以精确地测量FAB的分子量。
Fab和特定抗原之间的亲和性可以使用FurtBioOcTeTeRe96e系统进行测试。< > < >
图3。抗vegf fab在大肠杆菌中的表达。a.sds-page；b.western blot。大部分抗VEGF-Fab分泌到培养基中。lane pre：诱导前细菌；ind：诱导后细菌；medi：培养基；sup：细胞内可溶性部分；ib：包涵体。< > < > 在相同体积中充电，所有样品均为非还原性。星号（★）表示fab在40kda左右的预测大小（luo等人，2019b）。 < >
图4。capto l亲和层析纯化抗vegf-fab。a.洗脱色谱光谱。红色曲线：280nm处的紫外吸收；蓝色曲线：电导率。B.SDS-PAGE。Lane Medi：预载样品（介质）；FL：流经；E（NR）：非还原洗脱剂；E（R）：还原洗脱剂。星号（★）表示非还原fab，菱形（◆）表示lc（？？）和hc（？？）的导出碎片（luo等，2009年b）。

食谱

PLM培养基
7.5毫米（nh4）2so4
0.4毫米mgso4
11毫米葡萄糖
111 mm管道
调节至pH 7.0
注：PLM培养基应在灭菌后立即灭菌或过滤灭菌。
缓冲区a
50毫米柠檬酸
50毫米柠檬酸钠
调节至pH 6.5
注意：缓冲液应通过0.22μm过滤器过滤，并在一周内使用。
缓冲区b
50毫米柠檬酸
50毫米柠檬酸钠
调节至pH 2.3
注意：缓冲液应通过0.22μm过滤器过滤，并在一周内使用。
tae缓冲区
40毫米醋酸三钠，pH值8.5
1毫米EDTA

致谢

这项工作是与杰乔实验室合作，并共同申请了美国专利（卡格里罗、塞德里克、伯内特、安得烈、谢、乐清、JIANG、华、朱、Jianwei、鲁、Huili、罗、Manyu）。从细菌和含有重组蛋白的成分中制备重组蛋白的方法。美国专利申请，日期：2018年12月31日，申请号：16/237265）。这项工作也得到了国家自然科学基金（Zhu J. 81773621号）、上海市科学技术委员会（17431904500号和17ZR1413700对Lu H.）的支持。我们感谢我们原始研究文章的所有作者（Luo等人，2019aAppl Microbiol Biotechnol）。

相互竞争的利益

作者声明与本文内容没有利益冲突。

工具书类

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