材料和试剂

实验室手套
RNASEZAP？RNASE去污湿巾（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：AM9786）
15ml玻璃管
0.5毫升和1.5毫升不粘微量离心管（例如，vwr，目录号：20170-315和20170-650）
0.2毫升PCR管（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：e030124707）
显微镜载玻片和盖玻片（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550-A3和10-016-24）
刀片（例如Thermo Fisher Scientific，目录号：12-640）
过滤的无数据库提示（例如，，梅特勒-托莱多，雷宁，目录号：17007957，17002927，17014361）
无核酸酶水（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9937）
taqpcr聚合酶（新英格兰生物实验室，目录号：m0273s）
脱氧核苷酸（DNTPs）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10297117）
原位杂交探针的正向和反向引物（例如，，sigma-aldrich）
PCR纯化试剂盒（例如，zymo研究，目录号：D4033）
地高辛（DIG）DNA标记混合物（罗氏诊断，目录号：11277065910）
蛋白酶K 20 mg/ml（罗氏诊断，目录号：03115887001）
勃林格阻滞剂（罗氏诊断，目录号：11096176001）
抗地高辛AP Fab片段（罗氏诊断，目录号：11093274910）
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，4-甲苯胺盐BCIP（罗氏诊断，目录号：11383221001）
4-硝基蓝四氯化氮NBT（罗氏诊断，目录号：11383213001）
鲑鱼睾丸DNA钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：D1626）
来自面包酵母的trna（sigma-aldrich，目录号：r8759，x-sa型）
登哈特50X溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D2532）
干冰
蔗糖（例如，sigma aldrich，目录号：s0389）
琼脂糖（例如，，vwr，目录号：0710）
磷酸二氢钾（kh2po4）（e.g.，sigma aldrich，目录号：p9791）
磷酸二钠（Na2HPO4）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
柠檬酸钠（Na3C6H5O7）（Sigma Aldrich，目录号：1613859）
六水氯化镁（mgcl2·6h2o）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
0.5 M EDTA pH 8（Sigma-Aldrich，目录号：324504）
Tris Base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：65051）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
37%甲醛溶液（Sigma Aldrich，目录号：F15587）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：1614363）
去离子甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
透明指甲油（例如，纯冰）
苍白球绦虫–寄生前J2s（10000）或寄生期（>；100）
M9缓冲器（见配方）
固定缓冲液（见配方）
20倍SSC（见配方）
杂交缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液A（见配方）
洗涤缓冲液B（见配方）
马来酸缓冲液（见配方）
阻塞缓冲区（见配方）
检测缓冲区（参见配方）

注：EM＞原位< EM >杂交缓冲液可在本协议的结尾处找到。

设备

吸管（例如，rainin，型号：p2、p20、p200、p1000）
2.8 m m/500μm/250μm/90μm/25μm/20μm筛（例如，洪堡，目录号：7、35、60、170、500、635）
PCR热循环器（例如，Bio-Rad，型号：T100）
DNA电泳系统（例如，Bio-Rad）和成像系统（例如，Azure Biosystems，型号：C300）
NanoDrop（例如，，Thermo Fisher Scientific，型号：2000分光光度计）
离心15ml玻璃管（例如，eppendorf，型号：5804r）
实验室搅拌机（例如，waring，型号：WF22111214）
0.5毫升和1.5毫升试管的微量离心（例如，eppendorf，型号：5424）
管旋转器（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：88881001）
4°C冰箱
-20°C冷冻柜
杂交炉（例如，vwr，型号：230402v）
小型块状加热器（例如，vwr，型号：10153-318）
光倒置显微镜（徕卡，型号：DMI8）

软件

显微镜成像软件——LAS V4.12（徕卡，https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-application-suite/“target=”\u blank“>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-application-suite/）

程序

产生感觉和反感觉cdna探针
1. 在感兴趣基因的cdna序列中确定一个独特的200-250bp区域，该区域将由原位探针检测，并为该dna片段设计标准pcr引物。
2. 获得线虫RNA并合成所述cDNA（Casavant等，2017年）。
3. 按照dna聚合酶的标准pcr程序（e.g.，taq聚合酶）从线虫cdna中扩增所需的基因片段。在1% DNA琼脂糖凝胶上运行少量的PCR产物，用市售的PCR纯化试剂盒对其进行纯化。
4. 用dig-dna标记混合物（1 mm-datp，1 mm-dctp，1 mm-dgtp，0.65 mm-dttp，0.35 mm-dig-dutp）建立两个独立的不对称pcr反应，分别合成正义（阴性对照）和反义cdna探针如下：
  来自A3（20 ng）的X微升PCR模板
  4微升5xtaqbuffer
  2微升dig dna标记混合物
  4微升10微米正向底漆（感测探头）或反向底漆（反感测探头）
  1微升taq聚合酶
  x微升ddh2o
  总体积20微升
  < > 在PCR循环程序中运行以下程序：
  1. 95°C–30秒
  2. 95°C–15秒
  3. 60°C–30 s（温度可根据底漆调整）
  4. 68°C–90秒（重复B-C 35次）
  5. 68°C–5分钟
  < >
5. 检查您的挖掘标记PCR步骤，通过少量的标记探针在1% DNA琼脂糖凝胶位点通过与原始PCR模板的位点。与未标记的DNA相比，标记的探针应显示出分子质量的增加，这是由于结合了DIG（图1）。
  < >
  图1。DNA 1%琼脂糖凝胶检查PCR标记PCR步骤。Lane 1–PCR模板，Lane 2–用正向引物合成的DIG标记的感测阴性探针，Lane 3–用反向引物合成的DIG标记的反感测探针。由于dig的加入，两种dig标记的探针都增加了分子质量。
  < >
6. 用商用PCR纯化试剂盒纯化地高辛标记的探针，并将其储存在-20°C直至需要。
  
  < >
固定-第1天
1. 收集线虫幼体
  1. 对于寄生前的幼体
    1. 如前所述孵化的J2S线虫（Casavant等人，2017年）。
    2. 用15ml玻璃管（150x g离心5min，4°c）将刚孵出的j2s线虫旋下，去除上清液。
  2. 寄生幼体
    1. 如前所述，用g.pallida囊（约10个囊/6英寸盆）感染马铃薯植株（Dandurand和Knudsen，2016）。
    2. 在所需的感染阶段，轻轻地从土壤中拔出受感染的根系，并用水冲洗，以去除较大的土壤颗粒。
    3. 将根切成2厘米长的段，放入搅拌机中，盖上水，在较低的温度下搅拌5次，持续2秒。
    4. 将混合的根线虫悬浮液通过一系列筛子（2.8 m m、500μm、250μm、90μm、20μm）从根碎片中分离线虫幼体。将在最后20μm筛上收集线虫。
      注意：如果需要，请重新混合较大的根并重复此步骤。
    5. 采用蔗糖梯度离心法对线虫进行纯化，去除土壤和根中的微量残留。
      
      1）
      
      制备50%w/v蔗糖溶液并在4°C下冷却。
      注：蔗糖溶液可提前一天，在4℃下保存过夜
      
      2）
      
      在15毫升的玻璃管中加入5毫升50%的冷蔗糖，然后用5毫升收集的线虫溶液轻轻地将其覆盖。
      
      3）
      
      在1250x g温度为4°C时（加速和断开设置为“0”）下旋转试管10分钟。线虫会在水-蔗糖溶液边界聚集，而小的土壤颗粒和根残留物会在试管底部形成颗粒（图2）。
      
      4）
      
      用p1000吸管采集线虫层，用水在25μm筛上冲洗5次，除去蔗糖。< > < >
      图2。蔗糖梯度离心纯化寄生线虫
2. 将线虫（10000个寄生前J2s或100个寄生蠕虫）转移到1.5毫升不粘的微型离心管中。
3. 将线虫重新放入1毫升水中洗涤两次，然后在6000x g下离心2分钟。
4. 尽可能多地去除水分，并在1毫升固定缓冲液中重新培养线虫。
5. 在4°C下，用平卧管固定线虫18小时，然后将样品移到室温下，再孵育4小时。
  
  < >
线虫切割、渗透和杂交-第2天
1. 用核糖核酸酶抹布擦去所有东西以保护核糖核酸酶。
2. 离心线虫（6000x g2min），取上清液，用200μl 10倍稀释（m9缓冲液）固定缓冲液将线虫颗粒再悬浮。
3. 将约70μl的线虫悬浮液涂在玻片上，并用平刀片切割，直到约80%的线虫被切割（显微镜下检查）（图3）。
  < >
  图3。切割固定线虫。a.切割站。切割前的线虫。切割后的线虫。比例尺=100μm。
  < >
4. 用10倍稀释的固定缓冲液轻轻冲洗玻璃片，将切下的线虫收集到1.5毫升不粘微量离心管中，重复步骤C3，直到所有线虫都被切下。
5. 将线虫（6000x g旋转2分钟）并去除上清液。
6. 在500μl m9缓冲液中再次洗涤线虫两次，然后在6000x g下离心2分钟。
7. 加入500μl蛋白酶k溶液（m9缓冲液中0.5mg/ml），室温下在旋转器上渗透30min。寄生期线虫的渗透时间应增加到45～60min。
8. 将样品旋下，用500μl m9缓冲液（6000x g2分钟）洗涤线虫颗粒两次。第二次清洗后，尽可能多地去除M9缓冲液。
9. 将线虫颗粒冻在干冰上15分钟。
10. 将线虫重新悬浮在1毫升冷甲醇（储存在-20°C）中，并在干冰上培养线虫颗粒30秒。
11. 在21000x g下旋转线虫30s（室温）并除去甲醇。
12. 将线虫重新悬浮于1毫升冷丙酮（储存于-20°C）中，并将线虫颗粒在干冰上培养1分钟。
13. 在21000x g下旋转线虫30s，除去100μl丙酮。
14. 慢慢地，一滴一滴地，通过添加100μl H2O来重新水化样品。
15. 在50℃下预热杂交缓冲液。
16. 将样品旋下，用500μl杂交缓冲液（6000x g在室温下冲洗2分钟）清洗线虫颗粒。丢弃上清液。
17. 加入300μl预热的杂交缓冲液，并将150μl的小份转移到两个0.5 ml的不粘微量离心管（用于感测和反感测样品）中。
18. 在50℃的杂交箱中，对样品进行15分钟的杂交前处理。
19. 同时：将探头在100℃下变性10分钟，并立即放在冰上，以防再次退火。
20. 在两个线虫样品中分别加入感测和反感测探针。
21. 在50°C的杂交箱中旋转过夜进行杂交。
  注：杂交温度可根据长度和探针特异性进行调整。
  
  < >
洗涤和染色-第3天
1. 将线虫（6000x g在室温下旋转2分钟）并去除上清液。
2. 用100μl洗涤缓冲液1在50℃的杂交箱中旋转15分钟，然后在6000x g下离心2分钟，每次洗涤样品3次。
3. 用100μl洗涤缓冲液2在50℃的杂交箱中旋转20 min，然后在6000x g下离心2 min（室温）洗涤样品3次。
4. 在100μl马来酸缓冲液中再次洗涤样品，然后在6000x g下离心2分钟。
5. 加入100μl封闭缓冲液，旋转培养30分钟。
6. 将样品（6000x g旋转2分钟），将线虫颗粒重新悬浮在含有抗-dig-ap的100μl封闭缓冲液（1μl抗-dig-ap/1000μl封闭缓冲液）中，并在室温下旋转2小时孵化。
7. 用100μl马来酸缓冲液洗涤样品3次，每次旋转15分钟，然后在6000x g下离心2分钟。
8. 用100μl检测缓冲液（6000x g清洗样品2分钟）。
9. 加入150μl新制备的AP基质溶液（1000μl检测缓冲液中的3.5μl BCIP和3.4μl NBT），在4°C下不搅拌培养过夜。
  
  < >
成像-第4天
1. 用100μl 0.01%吐温-20洗涤线虫两次，时间为1分钟（6000x g2分钟），并去除上清液。
2. 用50μl 0.01%吐温-20复溶线虫颗粒，10μl/片。
3. 盖上盖玻片并用指甲油密封边缘。
4. 显微镜下检查染色线虫切片。

数据分析

在徕卡显微镜下分析染色线虫切片，并用LAS V4.12成像软件拍摄图像。代表性结果在苍白球绦虫效应子rha1b的背侧glad特异性表达示例中描述（kud等人，2019年）（图4）。寄生细胞j2的原位杂交信号呈暗紫色/棕色（图4a）。相反，在寄生前的J2中没有检测到同一基因的信号（图4b），表明寄生/发育阶段依赖的基因表达直接影响原位杂交结果。阳性结果通常伴有阴性对照，感测探针孵育样品，未检测到信号（图4c和4d），以确认信号特异性。染色效率可能因实验而异，因此，该试验应重复多次，结果相似。每个分析至少应检查20条染色线虫，以确保一致性。
< >
图4。具有代表性的结果显示，原位杂交的结果显示，g.pallida-rha1b效应器的背腺表达。a.用rha1b反义探针在一个第j2段-强信号中证实了在这个寄生阶段的glad特异性表达。b.在前J2S中使用RH1B反义探针的样本-由于非常低的表达或RH1B在这个阶段没有检测到信号。C.在寄生的J2中使用RH1B感测探针进行阴性对照（第J2段）。D.在预寄生J2中使用RH1B感测探针进行阴性对照。比例尺=50μm.s–针和dg–背腺。这一数字是根据Kud等人（2019年）修改的。

因为即使是少量的RNase也能破坏RNA的完整性，因此建议戴手套，只使用不含RNase的塑料和玻璃器皿，并且经常用市售的去污试剂（如RNaseZAP擦拭布）擦拭实验室表面，以确保RNase和无DNA酶的环境。
大多数杂交缓冲液可以作为预处理的原料溶液购买。
确保始终使用新鲜去离子甲酰胺作为固定缓冲液。
探针长度是灵敏度和穿透性之间的折衷，较短的探针进入线虫组织，但较长的探针可以更好地检测/杂交受试转录本。
如果观察到强的背景信号，可以应用一些故障排除步骤。1）设计一个跨越两个外显子的探针将降低其与DNA的亲和力。2）在我们手中，50℃的杂交温度是一个很好的起点。根据长度和探针的特异性，理想的杂交温度可以在实验上进行优化（范围为45°C到55°C）。3）虽然洗涤温度通常与杂交温度匹配，但稍微增加温度和/或SSC盐浓度可以降低背景信号。
为了进一步验证原位杂交结果，可以使用第二原位探针，与感兴趣的转录区的不同区域进行对准。

食谱

m9缓冲液（pH7）
22毫米kh2po4
42毫米Na2HPO4
86毫米氯化钠
高压灭菌
固定缓冲区
2%甲醛
M9缓冲液
20倍ssc（ph 7）
3m氯化钠
0.3m柠檬酸钠
高压灭菌
杂交缓冲液
50%去离子甲酰胺
4xSSC＜BR/> 1%封闭剂
2% SDS
1x Denhardt溶液
1毫米edta，ph值8
鲑鱼睾丸dna钠盐200μg/ml
3.125 u/ml酵母trna
洗涤缓冲液a
4xSSC
洗涤缓冲液b
0.1倍ssc
0.1% SDS
马来酸缓冲液（pH7.5）
0.1 M马来酸
0.15 m氯化钠
高压灭菌
阻塞缓冲区
1%勃林格阻滞剂
马来酸缓冲液
高压灭菌
检测缓冲液（pH 9.5）
0.1 m三氯化氢
0.1 m氯化钠
50毫米mgcl2·6h2o

致谢

这项工作得到了美国农业和食品研究倡议竞争奖（2015-69004-24634，2017—67014-26197；2017—67014-26591）USDA国家食品与农业研究所，USDA - NIFA农场法案，西北马铃薯联盟，和ISDA特种作物。 &本文所述的原位杂交方案是根据De Boer等（1998）改编的。我们要感谢john jones博士和james hutton研究所vivian block博士的实验室为优化这种方法提供了有用的提示。

相互竞争的利益

作者声明没有金融和非金融竞争利益。

工具书类

布罗迪，B.B.（1989）。在美国对金线虫的控制。annu。牧师。植物病原醇27:443-461。
Casavant，N.C.，Kuhl，J.C.，Xiao，F.，Caplan，A.B.和Dandurand，L.M.（2017年）。从茄根中提取的rna的评估。
Dandurand，L.-M.和Knudsen，G.R.（2016年）。陷阱作物和两种生防真菌对马铃薯胞囊线虫繁殖的影响，苍球藻应用生物学年鉴169（2）：180-189。
De Boer，J.M.，Yan，Y.，Smant，G.，Davis，E.L.和Baum，T.J.（1998）。原位杂交到异胞甘氨酸中的信使rna线虫j30（3）：309-312。
Jones，J.，Blok，V.和Smant，G.（2002年）。sxp/ral-2蛋白：马铃薯胞囊线虫的分泌蛋白。线虫学2（8）：887-893；

Kud，J.，Wang，W.，Gross，R.，Fan，Y.，Huang，L.，Yuan，Y.，Gray，A.，Duarte，A.，Kuhl，J.C.，Caplan，A.，Goverse，A.，Liu，Y.，Dandurand，L.M.和Xiao，F.（2019年）。马铃薯胞囊线虫效应器rha1b是一种泛素连接酶，利用两种不同的机制抑制植物免疫信号传导。plos pathog15（4）：e1007720。