材料和试剂

动物
妊娠icr或c57bl/6j系小鼠胚胎日龄[e]~11.5个胚胎
注：我们通常每次实验用1-2只怀孕的老鼠。我们假设平均每个icr小鼠有6-12个胚胎，每个c57bl/6j小鼠有4-8个胚胎。对于妊娠期交配，阴道塞的日龄为E0.5，胚胎按EMAP分期（＜HREF＝http://www. eousiaTask.Org/EMAP/EMA/HOM.PHP）靶＝“空白”＞EM＞http://www. eoutheltas.org/EMAP/EMA/HOME.PHP EM>。在我们看来，在E11.0和E11.5之间的胚胎上，轴突生长在基质凝胶涂层的基底层上和易于处理方面取得了最好的结果，以制备dsc（-fp）和sc（+fp）外植体。至少，在e12.0之前使用胚胎要比后期好。为了使用基因敲除小鼠，我们从幼胚制备外植体，同时进行基因分型。图像采集和分析可以以盲的方式进行。对于体外电穿孔和闭卷式外植体培养，我们建议在E11.5之前使用ICR小鼠胚胎，关于轴突中线交叉前轴突示踪剂质粒/shrna在连合神经元中的高效导入及组织完整性的维护。
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手术器械和材料
1. 大剪刀
2. 中剪
3. 眼科剪刀（可选）（Natsume Seisakusho，目录号：MB-50-7）
4. 镊子（7）（Dumont，5号Inox）
  注：我们使用相对钝的镊子（总共5把；1把用于处理盖玻片，2把用于小鼠手术，2把用于脊髓解剖）和锐化的镊子用于精细解剖（2）。
5. 直金属铲，边缘抛光
6. 一次性手术刀（羽毛，11号）
7. 锐化钨针，直角弯曲（钨丝，直径：0.20 mm；Nilaco，目录号：W-461267）和针座（精细科学工具，目录号：26016-12）（见图1H）。
  注意：在顶端，直径应为约20μm。通过将电源的负极（低电压设置）放入浴缸和正极（鳄鱼夹）到针头的端部，针头可以在1 N NaOH浴中磨快。浸入/取出针尖，形成尖的锥形针尖。请参阅冷泉harb protoc（doi:10.1101/pdb.rec069468）中的配方“锐化钨针”。
8. 一次性转移移液管，3.5 ml（Sarstedt，目录号：86.1171.001）或等效物（长度约15 cm，内径2 mm）
  注意：处理整个脊髓时，使用开口约为4-5 mm的切割吸管。当处理切除的细小脊髓组织块时，我们通常使用未切割的移液管。
9. 经酸洗、消毒的圆形盖玻片（直径18 mm；Matsumi，厚度：1号；制备盖玻片，见配方1）
10. Black nitrocellulose（NC）膜过滤器（一个表面网格化，单包装和无菌）（萨特里厄斯，硝酸纤维素过滤器，目录号：13006—47—罐）
11. 玻璃载玻片（Matsumi，Superfrost，目录号：S2443）
12. 70%乙醇
  
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文化产品
1. 35mm无菌组织培养皿（康宁，猎鹰，目录号：353001）
2. 60mm无菌组织培养皿（康宁，猎鹰，目录号：353004）
3. 100毫米无菌组织培养皿（康宁，猎鹰，目录号：353003）
4. 15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-70C）
5. 50ml锥形离心管（Eppendorf，目录号：0030122178）
6. 1.5-ml安全锁微量离心管（Eppendorf，目录号：0030120086）
7. 金属砝码（不锈钢；由当地机械车间制造）
  注意：使用前，用蒸馏水（最好用超声波清洗5-10分钟）和100%乙醇清洗砝码至少三次，晾干，在180°C下烘烤3小时或用紫外线照射消毒（催干时）。虽然我们通常使用3 x 3 x 14 mm的金属砝码（见图1），但有许多不同尺寸的金属砝码是很方便的。使用后，用蒸馏水（并进行超声波处理）和100%乙醇洗涤三次，过夜。按照上述消毒程序进行下一轮使用。避免使用洗涤剂清洗，不要对它们进行高压灭菌。
8. matrigel matrix（康宁，目录号：354234）
  注：将一瓶基质凝胶在冰上解冻过夜。制作等份（每1.5毫升试管0.2毫升）并储存在-80°C下。
9. 刀豆蛋白A（ConA；IV型，冻干粉；Sigma-Aldrich，目录号：C2010-25mg）
10. 康纳原液（见配方2）
  
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文化媒介
1. 汉克斯平衡盐溶液，无钙，无镁（HCMF；Thermo Fisher Scientific，目录号：14170112）
2. Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），高糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：11965092）
3. L-谷氨酰胺，200mm溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
4. 胎牛血清（FBS）（TyrFisher科学，GiBCO，目录号：10270106或Hy克隆，目录号：SH3091003）
  注意：在本培养方案中，在56°C下对FBS进行30分钟的热灭活是不必要的。
5. 神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21103049）
6. B-27补充剂（50x），无血清（赛默飞世尔科学公司，目录号：17504044）
7. OPTI MEM I降低血清培养基（THE），目录号：31985062
8. Penicillin streptomycin，液体（指定笔/链子；用作100X溶液；每个10000单位/毫升）（THE），目录号：15140122）
9. HEPES（1米）（赛默飞世尔科学公司，目录号：15630080）
10. 纯化的重组人slit2（选项：在我们的实验中使用；在-80°C下储存小份）
  注：重组slit2蛋白是从稳定表达人slit2 myc的hek293细胞（li等，1999）的条件培养基中通过sp-sepharose快速流动（ge-healthcare）离子交换层析（guan等，2007）纯化的。以亲代hek293细胞为原料，采用与slit纯化相同的方法制备对照纯化制剂，并用于外植体分析。我们详细的狭缝净化方案可根据作者的要求提供。
11. 培养基1（见配方3）
12. 培养基2（见配方4）
13. 培养基3（见配方5）
  
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体外电穿孔与封闭式脊髓组织块培养材料的研究
1. 玻璃毛细血管（narishige，目录号：gd-1）
  注意：要准备注射吸管，请使用垂直拉拔器拔出玻璃毛细管，并用细镊子折断毛细管尖端；如果可能，请对角切割（尖端直径：约30μm）。
2. 垂直拉拔器（Narishige，当前型号：PC-100）
3. 吹口和吸管接头（用于电穿孔前的注射，我们使用日本Suisaku公司提供的设备（型号：细管），可以连接适当长度的硅管）
4. DPBS，不含钙，不含镁（赛默飞世尔科学公司，目录号：14190144）
5. 雷博维茨L-15（赛默飞世尔科学公司，目录号：11415064）
6. 热灭活马血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：26050070）
7. 轴突示踪剂（egfp/vyfp质粒）
  注：我们比较了pcag-egfp（可从nepa基因获得）、pcag-vyfp（venus）、pcag-gap43-egfp和pcag-gap43-vyfp对轴突的标记作用。在我们的研究中，pcag-vyfp在小鼠脊髓中表现最好。我们通常使用核键xtra midi-ef试剂盒（macherey-nagel）获得midi预备级dna。然后用常规的酚氯仿萃取和乙醇沉淀法对DNA进行净化，溶解在无菌条件下得到高纯度的DNA。浓度为8-10μg/μl的无内毒素te缓冲液。储存于-30°C（避免库存解冻/再冷冻循环次数过多）。
8. 合适的短发夹rna（shrnas；在本文中，我们使用shrna对抗prs-shrna载体中克隆的arf6[sharf6]；origene）和对照shrna（shcontrol）进行rnai介导的敲除（dna按上述方法纯化并在适当浓度下溶解；见Kinoshita Kawada等人，2019年）
9. 0.5-1%快速绿色（10倍）（Sigma-Aldrich，目录号：F7252）
  注：溶于dpbs后，过滤灭菌（0.22μm）。制作等份并将其储存在-30°C下。
10. 天然胶原酸性溶液I-AC（3 mg/ml，pH3.0）（Koken，目录号：IAC-30）
11. DMEM/F-12，粉末（Thermo Fisher Scientific，目录号：12500062）
12. 5x浓缩DMEM/F-12培养基（配方6）
13. 重组缓冲液（用于胶原蛋白的糊化；见配方7）
14. 培养基4（见配方8）
  
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注视
1. PBS（磷酸盐缓冲盐水）片（Takara，目录号：T900）
  注：虽然也可以使用上述DPB，但不需要无菌。
2. PBS+0.025%NaN3
3. 多聚甲醛（pfa）（富士薄膜/和谷，目录号：162-16065）
4. 添加10%蔗糖的pbs中4%pfa（~0.3m蔗糖；walter等，1987a；用于固定无电穿孔培养的外植体）
  注：在PBS中制备浓度为4%pfa的储备液，制成小份（每50毫升试管约30毫升）并储存在-30°C下。用于固定，在PBS中解冻4%pfa并添加蔗糖至约10%。
5. pbs中4%pfa（用于固定电穿孔脊髓的培养外植体）
  
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免疫染色及观察

24 x 60 mm 1号微盖玻璃（Matsanmi，目录号：C024601）
注：此盖玻片用于安装经电穿孔和培养的脊髓外植体。
Sylgard涂层解剖盘（准备见Banker and Goslin，1998年第275页）
0.2%Triton X-100，在PBS中
注：我们在免疫染色当天新鲜稀释Triton X-100（Sigma Aldrich，目录号：T8787）。
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma Aldrich，目录号：A2153）
山羊血清（Sigma奥德里奇，目录号：G67 67）
脱脂牛奶（bd/difco，目录号：232100）
感兴趣的兔源性抗体（在我们的研究中，我们使用抗机器人抗体）
抗l1cam（小鼠单克隆igg1；克隆2c2；abcam，目录号：ab24345）
抗-tag-1（小鼠单克隆igm；克隆4d7；杂交瘤库发育研究）
alexa fluor 647小鼠抗β-微管蛋白，Ⅲ类（克隆tuj1；bd，目录号：560394）
山羊抗鼠IgG（H+L）高交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32727）
山羊抗鼠IgM（重链）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 555（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21426）
山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11034）
Permafluor水性安装介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：TA-030-FM）

设备

CO2油箱
CO2培养箱（ASTEC，水套式）
co2单级流量计调节器
解剖显微镜（卡尔蔡司，型号：STEMI 2000-C；当前型号：STEMI 305/508）
冷光源（FOSTEC，型号：DCRII）
相衬显微镜（Olympus，型号：CKx31；当前型号：CKx53）
微孔-milli-q超纯水体系
层流罩
4°C冰箱
-30°C冷冻柜
-80°C冷冻柜
电穿孔剂（nepa基因，型号：nepa21）
注：NEPA21是一种多用途电穿孔器，具有高度可编程性和可重复性，可控制和测量多种变量。
钳式电极（电穿孔小鼠脊髓，首选CuY665P9-6-2-5，尖端直径2.5mm，nepa基因）
注：电极尖端的形状显著影响基因导入脊髓的效率和模式。
共焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，型号：LSM780或LSM880）或一体化荧光显微镜（Keyence，型号：BZ-X700）
注：如有可能，使用具有图像平铺功能的共焦显微镜（见图3A）。虽然费力，蒙太奇图像也可以手动组装。在我们最初的研究中，我们使用了一台宽视野BX61I显微镜（Olympus），配备了Coolsnap HQ或ES CCD摄像机（Roper Industries）。我们用Autoquant x3反褶积软件（Media CyberMetrics；见图3c）手工组装图像。

软件

变形（7.7和7.10版；分子器件）
Photoshop CS5扩展（Adobe）
插画CS5（Adobe）
Excel（微软）
棱镜6（graphpad）

程序

盖玻片和黑色NC过滤器的涂层
注意：
1. 实验前准备。
2. 应在层流罩内执行以下步骤。
1. 用2毫升HCMF（最后，1:10稀释）稀释200μL基质凝胶（使用前，在冰上缓慢解冻含有已校准基质凝胶的试管）。在我们的经验中，稀释的溶液可以储存在4°C一个星期，但我们通常使用新鲜稀释的股票。避免在稀释溶液中形成基质凝胶聚集体是很重要的。首先，将2毫升HCMF倒入放在冰上的15毫升试管中，等待一段时间。其次，将大约900μl HCMF转移到200μl基质凝胶管中，立即通过移液管混合，并将混合物返回最初放置在冰上的15ml管中。再次混合均匀。
2. 使用上述基质胶溶液涂抹18 mm圆形无菌盖玻片。首先，将120μl的基质凝胶溶液转移到35 mm的皿上，然后用盖玻片盖住溶液（图1i）。我们用镊子处理盖玻片（盖玻片的尖端应浸入70%乙醇中，使用前风干）。将盖玻片在37°C下在CO2培养箱中培养3-5小时（或更长时间）。
3. 在黑色NC过滤器上涂上Cona。将0.5毫升的cona（使用前，在冰上缓慢解冻含有经校准的cona的试管；2毫克/毫升）稀释至8毫升的hcmf中，置于60毫米的皿中（所得工作浓度为0.125毫克/毫升）。慢慢地将NC过滤器的一侧放在另一个盘中的5毫升HCMF（不含CONA）上。当过滤器的整个表面变湿时，将其完全浸没，并将过滤器转移到含有HCMF的CONA中（图1I）。在37°C的CO2培养箱中培养3-5小时（或更长时间）。
4. 盖玻片涂膜后，用2毫升DMEM或3号培养基冲洗一次（残留的基质凝胶不影响轴突生长）。将盖玻片朝上放置在含有2毫升培养基3的新碟子中。使用前，请将其保存在co2培养箱中。任何时候都不要让它们干。
5. 涂上NC过滤器后，用8毫升HCMF清洗五次（再次注意，Cona有毒）。在HCMF浸泡条件下，用紫外线照射层流罩（5-10分钟/侧，两次）对NC过滤器两侧进行消毒（最好使用紫外线消毒箱）。在使用前，将其保存在37°C的HCMF中的CO2培养箱中。任何时候都不要让它变干。
  注意：太长的紫外线暴露会破坏NC过滤器上的ConA。
6. 对于外植体铺展，用一次性手术刀切割涂有涂层的黑色NC过滤器，以获得窄条（过滤器上约0.5-1刻度的宽度，4-5刻度的长度）（图1J）。
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从小鼠胚胎中分离脊髓并将脊髓外植体安装到NC过滤器上
1. 解剖准备
  在冰上冷却解剖培养基HCMF。用70%乙醇消毒解剖器械。下面的程序可以在层流罩外面执行。然而，为了防止外植体培养物被真菌、细菌或酵母菌污染，使用无菌溶液、无菌解剖工具和无菌技术。操作时，应经常用70%乙醇对解剖器械进行消毒。此外，还应注意避免将毛皮包含在盘子中，这可能是培养物中的主要污染源。
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  图1。脊髓外植体培养程序。a.脊髓后连合神经元典型轴突轨迹。RP：顶板；FP：底板；R：喙；C：尾。连合轴突轨迹的背视图。C-G.程序示意图：C.E11.5胚胎图。采用颈段至腰椎段脊髓（sc）进行组织块培养。d.在rp.e.切割线处切断脊髓，制备缺少背髓的fp[d sc（-fp）]和含有fp的脊髓[sc（+fp）]外植体。f.脊髓外植体在黑色NC滤过器上的扩散和固定。D：背侧；V：腹侧。g.在涂有基质凝胶的盖玻片上安装和培养脊髓外植体。削尖的钨针，用于切割外植体。i.盖玻片（左）的matrigel（mg）涂层和NC过滤器（右）的cona涂层。j.带Cona涂层的NC过滤器。从脊髓剥下脑膜的例子。I：在RP处切断脊髓，准备开卷准备。二：从开本脊髓头端至尾端剥离脑膜。三：脑膜已经完全切除。iv：脊髓准备好切除dsc（-fp）和sc（+fp）组织块。l.用镊子将外植体扩散和钉入NC过滤器的例子（I）。固定在滤器上的脊髓外植体准备好安装（ii）。m.用两个金属砝码在盖玻片上设置和安装两个外植体。
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2. 子宫切除术
  1. 用co2吸入对孕鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位。将小鼠背部放在纸巾上，用70%乙醇彻底擦拭腹部。
  2. 用钝镊抓住生殖器上方的皮肤，用大剪刀切开皮肤和肌肉，打开整个腹腔。
  3. 取下子宫，用镊子和中型剪刀，将它们转移到一个装有冷冻HCMF的100毫米盘子中。注意不要让子宫接触到老鼠的体表。
  4. 为了减少污染的可能性，至少清洗子宫一次，如果可能的话，两次，把它们转移到含有100毫米培养皿的HCMF中。
3. 从子宫中取出胚胎
  注：以下程序可在层流罩外执行。
  1. 在解剖显微镜下放置一个装有子宫的盘子（我们在解剖显微镜下进行了所有后续操作）。用两把钝的5号产钳，小心地撕开每个子宫的子宫角，将胚胎从胎盘和羊膜中分离出来。为了避免胚胎受损，我们在隔离期间不分离子宫（保持豌豆在豆荚中的状态）。用抹刀将胚胎转移到新的含hcmf的培养皿中。注意不要损伤胚胎，特别是脊髓。经常用70%乙醇擦拭镊子和其他工具。这些程序，从隔离胚胎到安装外植体培养前，可以在层流罩外进行，但保持环境和工具清洁。有关从子宫中分离E11.5小鼠胚胎的信息，另见Elhendawi和Davies，2018年。
  2. 检查汇集的胚胎，丢弃那些看起来受损、畸形、异常或太小太大的胚胎。用上述emap系统对胚胎进行分期，选择e11.5或早期胚胎。
4. 脊髓分离
  1. 应尽快进行解剖，并将含有剩余胚胎的培养皿放在冰上保存。每60毫米含HCMF的培养皿移植3-4个胚胎。首先，用两把钝的5号inox镊子从胚胎体内取出几乎所有的腹侧器官。在这一步，我们不使用剪刀。我们得到大脑和脊髓以及周围的组织。接下来，用钝镊在后脑吻侧脊髓区切开。将后脑和脊髓区域从椎骨上，在头端到尾端分离出来。不要剥去脑膜，背根神经节也可能附着。使用切下的移液管（切开移液管尖端，开口约为4-5 mm），将脊髓（带脑膜）转移到新的含HCMF的培养皿中。最好是迅速进行的步骤，安装脊髓到康纳涂层黑色数控过滤器。在我们的经验中，从解剖脊髓到将其安装到NC过滤器之间的较短时间会导致更好的轴突生长。
  2. 使用两对锐化的5号INOX镊子（或眼用剪刀），撕裂（或切断）脊髓背中线（顶板[RP]），脊髓背中线仍被脑膜覆盖（图1d）。把整个脊髓像一本书一样打开（我们通常用镊子抓住相邻的脑膜而不是脊髓本身来撕裂RP）（见图1K）。接下来，用镊子在脊髓外表面和脑膜之间，从脊髓头端到尾端剥离脑膜。如图1c所示，此时，我们获得从颈椎到腰椎的脊髓（通过用镊子切断开放的脊髓）。
5. 脊髓组织块培养的制备
  1. 对于dsc（-fp）外植体：立即用钨针（图1h）解剖脊髓后半部（见图1e所示的切割线）。
  2. 对于SC（+FP）外植体：立即用钨针切断FP（图1e）相对边缘的脊髓。
    注意：不要将开放式脊髓或dsc（-fp）/sc（+fp）外植体汇集在一起。如果合并，它们将变得卷曲，并且很难安装到NC过滤器上。当一个外植体准备好后，开始步骤b5c。
  3. 我们通常通过斜切标记外植体的背尾角（图1f）。使用湿移液管（应注意外植体可容易粘附于干燥表面并被损坏），立即将DSC（-FP）或SC（+FP）外植体转移到盖玻片和培养基中含3个皿中。将外植体铺在涂有Cona的黑色NC过滤器上（图1F、1J和1L）。为了固定外植体的位置，用钝镊将外植体钉在NC过滤器上，不用真正的“钉子”，软脑膜侧朝下（图1L（i））。对于dsc（-fp）外植体，应特别注意不要将任何fp组织放入培养皿中。我们强烈建议一个接一个地安装脊髓，并在脑膜剥离后立即安装。
    注意：
    1. 使用未切割的移液管转移切除的脊髓组织块，准备安装。非切割吸管，而不是切割吸管，适用于处理小块神经组织。
    2. 为了制备视网膜外植体，研究人员通常会将散布在NC滤纸上的视网膜组织“吸干”，然后将其进一步“吸干”，使视网膜牢固地附着在NC滤纸上（例如，见Bonhoeffer和Huf，1982）。然而，我们发现这种方法不能改善脊髓外植体轴突的生长，甚至可能损害组织的完整性。因此，我们不进行印迹程序来制备脊髓外植体。
  4. 在NC过滤器上安装两根脊髓。使用镊子，将它们平行放置在基质凝胶涂层盖玻片上，该盖玻片位于3号培养皿（含35 mm培养皿）中。翻转脊髓外植体安装的滤条，用一对不锈钢砝码（从右上方，轻轻放置砝码以稳定两个NC条）（图1g和1m）。现在脊髓的心室侧与盖玻片的基质凝胶涂层表面接触。将培养皿在5%co2下37℃培养48小时。在我们的实验中，用狭缝配体处理培养物（见材料和试剂D.10.）。通常，在进行配体刺激和固定之前，我们在48小时培养期间不替换培养基。
    注：
    1. 在翻转过程中，不要将外植体放在培养基上。
    2. 尽管netrin-1被用于dsc（-fp）外植体中促进轴突生长（e.g.，zouet al.，2000），但我们不使用netrin-1，无论dsc（-fp）和sc（+fp）外植体培养。因此，我们研究了slit单独对robo1受体表达的影响（kawada kinoshita等，2019年）。
  5. 在相差显微镜下观察外植体培养中轴突的生长。更多的轴突应该从外植体的腹侧延伸。在所采用的条件下，培养48h后，轴突前端应与外植体保持500μm以上的距离。
  6. 对于配体刺激，我们通常去除培养基的半体积（1毫升）并添加1毫升含配体的新鲜培养基。配体刺激后，在pbs中加入4%pfa和10%蔗糖，在室温下固定外植体培养1h。在固定之前，立即小心地移除金属重物。固定外植体用pbs洗涤3次，每次30-60min，最后加入pbs+0.025%nan3保存。外植体可以进行免疫染色。在固定、清洗和免疫染色过程中，小心操作，不要将外植体从盖玻片上分离。
6. 免疫染色
  我们通常在固定后1天或更晚的时间对培养的外植体进行免疫染色，这样对Robo受体和L1的免疫染色效果更好。
  1. 用0.2%triton x-100在pbs中培养外植体在室温下渗透2min。
  2. 用PBS清洗三次，每次5分钟。
  3. 用含有3%牛血清白蛋白、0.1%脱脂乳和0.05%Triton X-100的封闭缓冲液1在PBS中在室温下封闭样品30分钟。
  4. 在4°C的封闭缓冲液1中稀释原代抗体培养外植体过夜（大约18-20小时）。在我们的实验中，我们通常使用抗robo兔多克隆抗体和抗l1（2c2）或抗tag-1（4d7）。
  5. 用PBS清洗三次（每次30-60分钟）。
  6. 将含有3%牛血清白蛋白、3%山羊血清、0.1%脱脂乳和0.05% Triton X-100的封闭缓冲液2的样品在室温下用PBS封闭10分钟。
  7. 在室温下用二级抗体培养外植体，二级抗体在封闭缓冲液2中稀释2小时。在我们的实验中，我们使用alexa488结合抗兔二级抗体和alexa555结合抗鼠igg（或igm）二级抗体。
  8. 用PBS清洗三次（每次30-60分钟）。
  9. 用alexa647结合的抗β-微管蛋白，三级抗体（tuj1）在封闭缓冲液2中室温稀释培养外植体2小时。
  10. 用PBS清洗三次（每次30-60分钟）。
  11. 通常在观察当天，用Permafluor将样品固定在玻片上。安装好的样品在很长一段时间内没有得到很好的维护。他们很快就会被拍下来。
    
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体外电穿孔与脊髓组织块培养下面的程序可以在层流罩外面执行。在注射DNA和EP后，从小鼠胚胎中分离脊髓，并在37°C、5%Co2的胶原基质中培养4天（图2A-2H）。在此培养期间，表达vyfp的连合轴突到达、穿过腹中线并在对照脊髓制剂中纵向转动（图2i）。基因敲除和敲除的效果可以在中线轴突导向方面进行评估。
1. 如上所述，将E11.5小鼠胚胎解剖成HCMF。通过对小鼠胚胎进行准确的分期，选择适合于ep的胚胎。
  注：胚胎神经管的弯曲形态与电极的形状相匹配是很重要的。在我们手中，e11.5之前的阶段适合于通过ep和轴突中线原位交叉将质粒/shrnas导入预先交叉的神经元。E10.5-11.0脊髓很难有效电穿孔并在随后的步骤中制备外植体，从而导致中线交叉轴突标记不足。
2. 为了进行子宫外极压，在解剖显微镜下，将胚胎放在一个新的100毫米培养皿中，培养皿中含有足够体积的冷无菌dpbs。用含有shrna结构物（2μg/μl）和pcag-vyfp（0.4μg/μl）的溶液（添加0.05-0.1%快绿并在dpbs中稀释）手动注射e11.5胚胎脊髓（视频1）。紧接着，利用NEPA21电穿孔器（NEPA基因）和镊子型电极（CUY665P9-6-2-5，NEPA基因）（图2E和2F），以50 ms的间隔，用3个50 ms、20 V的脉冲单侧电穿孔胚胎（对于E11.5 ICR胚胎）。在进行EP之前，将注入的胚胎轻轻地夹在两个电极之间（我们设置阴极左侧和阳极右侧），然后按下NEPA21机器的脚踏开关。等到EP完成。在EP过程中，不要将电极夹得太紧。如果夹得太紧，注入的DNA溶液会漏出来，胚胎可能在EP期间受损。
  注意：
  1. 如果使用不同类型的pbs，胚胎ep的实际电条件可能会有很大的不同。我们建议从基因转移效率和组织完整性的角度，对几种pbs进行ep检测。此外，如果我们继续使用相同的dpbs处理许多胚胎的ep，那么电流和电能会显著增加，这也会影响组织的完整性。我们每3个胚胎在一个新盘子中使用新鲜的DPB。
  2. 将足够体积的DNA溶液注入神经管的腔中（图2A中给出了两种方法），但体积过大并不能提高基因转移到脊髓的效率，因为神经管爆裂后DNA往往会从胚胎中泄漏。ep脉冲使胚胎组织，特别是fp区变得脆弱。为了获得最佳的效果，在基因转移的位置和效率方面，将需要充分的实践。如果即使在练习后，EP的效率仍然太低，请考虑电极的形状是否与胚胎脊髓的弯曲形态相匹配，并且EP的电条件可能必须进行修改（有效的EP取决于电极的类型、脉冲电压、宽度、数量间隔和阻尼系数）。
    < > < > 视频1。将轴突示踪质粒注射到小鼠胚胎的神经管中。本视频展示了在解剖显微镜下将dna注射到小鼠脊髓e11.5中的实验。（这张录像是在福冈大学制作的，根据福冈动物护理大学的指导方针，由福冈大学动物研究伦理委员会根据《第1815122号议定书》批准）。< >
    图2。离体电穿孔和闭书脊髓组织块培养。A-D.离体电穿孔（EP）和组织块培养示意图：A.两种DNA注射方法。脊髓区的极压。c.将外植体植入胶原基质中，然后进行4天的培养。d.开卷准备和轴突轨迹观察。用于脊髓ep的e.cuy665p9-6-2-5电极（nepa基因）。一个EP实验的例子。G. An的例子是脊髓外植体植入胶原凝胶中，然后加入培养基。R：吻侧；C：尾侧。h.在极压过程中测得的电流和电能之间的显著斯皮尔曼相关（在以50 ms间隔的3个50 ms、20 v脉冲的情况下）。开放书本准备中vyfp/shrna共电脊髓神经元的中线轴突轨迹。在fp内（用括号标记）或fp对侧边缘的轴突由箭头表示。shrna介导的连合神经元arf6基因敲除导致轴突中线停滞。比例尺：50μm.j.《shcontrol和shrna电穿孔脊髓中线典型轴突轨迹总结》
    
    < >
3. EP后，立即将胚胎移植到含有L-15培养基的35毫米培养皿中。把它们放在冰上以备恢复。对每个胚胎进行EP后，用70%乙醇轻轻擦拭电极。
  注：我们发现，与HCMF相比，在L-15中保持电刺激脊髓的组织完整性更好。完成所有EP步骤后，清洁电极，用牙刷（或棉签）和牙膏轻轻地刷。用蒸馏水清洗，最后用70%乙醇清洗，晾干。
4. 所有胚胎的极压完成后，将胚胎转移到新鲜的含hcmf的培养皿中，并逐一仔细解剖脊髓。当从胚胎中分离电穿孔脊髓时，我们通常从靠近顶板的区域开始解剖，以避免损伤fp。不要把脑膜从脊髓上取下来。准备封闭的书外植体，附脑膜。
  注：我们恢复了从颈椎到腰椎的电穿孔脊髓，用于组织块培养。在我们手上，vyfp在脊髓中成功表达，轴突向腹侧延伸，轴突中线交叉通常从上肢到下肢。
5. 将分离的脊髓植入胶原凝胶中。在开始包埋之前，将酸性胶原溶液、5x浓缩培养基（DMEM/F12）和重建缓冲液保存在冰上。将7体积的酸性胶原蛋白溶液（例如，在我们的实验中，350μl/管）和2体积的5x浓缩介质（DMEM/F12）（例如，100μl/管）混合，并保持在冰上，直到使用。使用前，向上述混合物中加入约0.9-1体积的重建缓冲液（例如45μl/管），用移液管充分混合，如有需要，参照混合物中酚红的颜色将pH调整到~7.4。当保持在冰上或在4°C时，胶原混合物可以在溶胶状态下保持一段时间。当在37℃的co2培养箱中保存时，混合物将糊化。
6. 每35毫米碟放置一根脊髓（我们通常将FP保持在右侧[图2g]，这样脊髓的电镀侧就位于上方）。用120μl溶胶-状态胶原混合物覆盖外植体的“封闭式书本”制备，并在co2培养箱中培养15-30分钟（不要太长）。当胶原蛋白已糊化时，缓慢地向盘中加入2-2.5毫升培养基4。
7. 37°C培养4天（每天交换半体积，约1毫升培养基）。
8. 培养4天后，从胶原凝胶中分离出脊髓。转移到PBS或HCMF。取出脑膜，切顶板，准备开卷准备。在室温下，用4%pfa在pbs中固定脊髓在sylgard涂层解剖皿上15分钟（在这个固定步骤中，sylgard涂层皿似乎比通常的培养皿好得多）。继续固定，在4°C下浸泡固定脊髓过夜。用PBS清洗脊髓两次，最后用PBS+0.025%NaN3代替储存。
  注：
  1. EM>从凝胶中回收脊髓时，其外观应与培养前相似，无明显肿胀。如果情况如此不同，请考虑较温和的EP条件（例如，，尝试较少的脉冲和较低的电压）。在无蔗糖的pbs中用4%pfa固定。当固定物中含有蔗糖时，由于表面张力，脊髓会漂浮并受损。
  2. 我们不使用胶原酶从凝胶中回收脊髓。
9. 安装电刺激的脊髓进行观察。将开放式脊髓外植体和PBS一起转移到一个24 x 60 mm的矩形盖玻片上，取出大部分PBS，加入Permafluor并用另一个盖玻片（同样大小）盖住外植体，制成三明治。在共焦显微镜下观察。我们获得共聚焦的绿色通道图像，用于可视化vyfp信号和dic图像，以显示精确的fp位置。必要时，我们通常先从心室侧观察脊髓组织块，然后从软脑膜侧观察。

数据分析

脊髓外植体连合轴突中神经元引导受体表达的量化（在我们的病例中，我们分析了Robo受体的分布；见图3）。
1. 在激光扫描显微镜或keyence一体化荧光显微镜上利用适当的拼接功能拍摄免疫染色外植体的图像。或者，用传统的共焦显微镜手工采集外植体的图像。通过对最大强度投影图像的拼接得到合并后的图像。
2. 使用mormate（或imagej）软件测量单个轴突（或小轴突束）的信号强度。我们通常量化l1阳性连合轴突最远端和轴（30μm长）的免疫信号强度，这是tuj1免疫反应（这些信号反映轴突密度）的标准化。我们通常为每个实验组准备3-8个脊髓外植体，从而从相同数量的小鼠胚胎（每个胚胎一个外植体）中，分析每个实验组超过100个轴突成像场（每个外植体30个图像）。对于统计分析，我们执行非参数mann-whitney检验（参见Kinoshita Kawada等人，2019；图1和图4）。
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  图3。脊髓外植体连合轴突生长的免疫细胞化学特征a.从e11.5胚胎制备的dsc（-fp）和sc（+fp）外植体上培养的轴突生长。外植体对tuj1进行免疫染色。还显示了差分干涉接触（dic）图像。FP用红线标记。从dsc延伸的轴突对robo1呈阳性，而对tag-1呈阴性，表明它们不具有交叉前连合轴突的特征。c.Robo1、L1和Tuj1的dsc（-fp）和sc（+fp）外植体的三重免疫染色。从dsc（-fp）和sc（+fp）外植体延伸的轴突对robo1和l1是双重阳性，l1是一个交叉连接后轴突标记。比例尺：A中250μm；B和C中20μm。
  
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电穿孔和培养脊髓外植体中联轴突交叉的定量研究。
1. 在观察当天，在两个盖玻片之间安装脊髓外植体。
2. 用LSM共焦显微镜拍摄图像（至少应获得绿色和DIC通道的图像）。
3. 为了量化，计算vyfp阳性轴突的数量，这些轴突表现为反侧（交叉）或同侧，停滞（在到达fp之前，在FP内[我们包括FP内的纵向轴突生长]或穿过FP后）或在每个成像区域中重新交叉/回环，并以VYFP阳性轴突总数的百分比表示数据（轴突轨迹分类见图2J）。我们通常分析每个实验组至少4个胚胎的轴突轨迹（追踪大约200-3000个标记的轴突），并用dunn的事后检验进行kruskal-wallis检验进行统计分析。在这些分析中，没有排除vyfp阳性轴突的数据，除了过度投射轴突（见下文；另见Kawada Kinoshitaet al.，2019；图7）。我们发现，连合神经元的轴突表型在吻侧乳房轴上有明显的变化，甚至在同一胚胎内也是如此。因此，我们一直在分析电穿孔脊髓中作为不同数据点和作为生物复制物的个体胚胎在不同头乳房水平上的量化值。注：在我们的研究中，VYFP标记的轴突的中线过冲表型被排除在分析之外，因为我们在EP和/或操作过程中受损的组织区域，甚至在对照电穿孔小鼠胚胎中检测到过冲表型。

笔记

所有涉及动物的实验程序都应该得到你的机构动物护理委员会的批准。
当使用基质凝胶或胶原蛋白时，尽可能将原始瓶子和溶液放在冰上，以防止凝固或形成聚集体，这可能会影响外植体轴突的生长。

食谱

盖玻片酸洗
1. 用足够量的蒸馏水清洗盖玻片，用超声波（如果有的话）清洗三次，持续5分钟
2. 用70%乙醇清洗盖玻片10分钟，用蒸馏水清洗10分钟，同时摇晃
3. 用1 N HCl清洗盖玻片，偶尔摇晃1小时以上
4. 用蒸馏水清洗盖玻片，同时摇动，5次10分钟，然后3次30分钟
5. 风干Kimwipe纸上的盖玻片
  注意：请逐个放置。在这一步把它们分开。烘烤后，几乎不可能将它们分开。
6. 将其转移到100毫升烧杯中，并在180°C下烘烤3小时进行消毒。
2 mg/ml cona储备液
1. 在12.5毫升HCMF中溶解25毫克Cona
2. 分配0.5毫升/1.5毫升试管并在-80°C下储存
注：我们不通过过滤对cona原料进行灭菌。相反，我们在实验当天用紫外线照射对一个cona涂层的nc过滤器进行消毒。小心处理并戴上口罩；不要吸入粉末，因为cona有毒。
中等1
DMEM
10%FBS
2毫米L-谷氨酰胺
100单位/ml笔/ 100单位/ml SRIP
储存于4°C
中等2
基底神经+B-27
10毫米HEPES
2毫米L-谷氨酰胺
100单位/ml笔/ 100单位/ml SRIP
储存于4°C
中等3
介质1和介质2的1:1混合物（储存在4°C下）
5x浓dmem/f-12培养基
1. 制备5X浓缩培养基，加入钢笔/链球菌，但不含NaHCO3。
2. 过滤灭菌（0.22μm），4°C保存。该培养基含有酚红
重建缓冲液（用于胶原蛋白的糊化）
1. 每100毫升蒸馏水溶解0.05 N NaOH（0.2 g）、0.26 M NaHCO3（2.2 g）和0.18 M Hepes（4.8 g）
2. 过滤灭菌（0.22μm），4℃保存
介质4（Sabatier等人，2004年）
45%光学内存
50%F-12
5%热灭活马血清< BR> 2毫米谷氨酰胺
40毫米葡萄糖
100单位/ml笔/ 100单位/ml SRIP
在4°C下储存

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院和日本协会促进科学研究的资助。我们感谢Wu和Rao实验室的所有现任和前任成员的建议，感谢Fujio Murakami博士和Atsushi Tamada博士慷慨地提供了抗机器人抗体，感谢Chen Bing Guan博士慷慨地提供了SLIT2纯化方案，感谢OIST的动物/生物资源部分，kubota（分子器件）和nepa基因为其提供了宝贵的支持。我们感谢Hiroyuki Ichijo博士向我们介绍了最初由Friedrich Bonhoeffer博士及其同事开发的视网膜外植体培养技术。我们的dsc（-fp）/sc（+fp）外植体培养方案改编自先前发表的方案（bonhoeffer和huf，1982；halfter等，1981和1983；ichijo和bonhoeffer，1998；walter等，1987a和1987b；zou等，2000）。我们的离体 RNAi检测系统是基于先前发表的协议（PARRA和Zou.，2010；保鲁夫等，，2008）进行的。最后，我们要感谢赵晨博士的盛情邀请，在这里发表我们的协议。