材料和试剂

圆珠笔（纸伴侣，目录号：89466）
纸巾（Cascades Pro，目录号：CSDH170）
1毫升注射器（bd，目录号：309602）
0.2微米过滤单元（Thermo Scientific，产品目录号566002）
27 G 1/4针头（bd，目录号：305136）
成年C57BL/6NCRL小鼠（Charles River，目录号：027）
雄性或雌性小鼠可在该协议中使用。老龄小鼠可以在这个协议中使用，只要它们足够健康，能够承受与游泳相关的轻微压力。
白色蛋彩画（Funstuff？，Reeves and Poole Group Inc.，目录号：92080）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
在载体中制备的首选速效药物
注：选择的药物必须具有明确的药代动力学特性。特别是，药物必须能够跨越血脑屏障，半衰期不超过1小时，以便在不影响随后阶段（即巩固）的情况下，区分对某一记忆阶段（即获得）的影响。我们最近评估了溶于无菌盐水溶液（0.9%[w/v]NaCl）中的快速药物二氯乙酸（DCA，Sigma-Aldrich，目录号：347795）对记忆获取和恢复的影响（Harris等人，2019年）。
不含药物的溶媒溶液
注：我们通常使用无菌盐水溶液（0.9%[W/V]NaCl）（见配方）。

设备

温度计（Fischer Scientific，s02674）
照明良好的房间（1400勒克斯，室温25°C），以容纳MWM和试验区域外的保温区域
morris水迷宫装置包括：
1. 白色聚氨酯水箱，直径122厘米，高度81厘米（圣地亚哥仪器，目录号：7000—0723）
2. 可调高度透明丙烯酸圆水迷宫平台（10厘米直径，32-56cm高度），包括可拆卸旗杆（圣地亚哥仪器，目录号：7500—0310）
油箱排水箱（圣地亚哥仪器，目录号：7500—0217）
潜水式水族箱加热器（AQ UEON，目录号：TA300H）
四个彩色建筑用纸的远端空间线索，切割成不同形状例如、圆形、三角形、加号、心形和菱形（~25 cm长/宽）（订书钉，目录号：25305）
注意：确保球杆的颜色与悬挂在其上的墙壁形成最大的对比。
高架数码相机（罗技，目录号：C920）
运行Windows操作系统并连接到相机的PC计算机（ASUS，目录号：M51A）
带恒温器控制器的热垫（122 cm x 51 cm）（Vivosun，目录号：4820）
透明胶带（订书钉，目录号：52384-PD）

软件

任何迷宫行为跟踪软件（stoelting，https://www.stoeltingco.com/any-maze-video-tracking-software-1224.html）
注：本协议概述了分析迷宫软件的使用。但是，使用其他软件或手动评分视频也可以使用此协议。
棱镜（graphpad，https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/“target=”\u blank“>https://www.graphpad.com/scientific software/prism/）
rstudio（rstudio，https://www.rstudio.com/“target=”轱blank“>https://www.rstudio.com/）

程序

房间准备
1. 将油箱放在分段/封闭测试区域的中心。
2. 在试验区北、东、南、西四壁用透明胶带悬挂不同的空间线索，距离试验区1-2米。
  注意：确保提示较大，并包含与测试区域墙壁/窗帘形成对比的颜色，以便更好地看到，并且在距离和高度上，老鼠可以从油箱内部看到这些提示（图1）。
  < >
  图1。保持和测试区域设置。必须用帘子隔开/用墙隔开油箱，以使保持区域和实验者在油箱中的老鼠看不到。在测试区域的不同空间线索必须显示在一个高度可见的老鼠从坦克。数码相机安装在油箱中心上方（未显示）。
  < >
3. 将摄像机对准油箱正上方，正面朝下，高度足够高，可以拍摄到整个直径。
4. 将摄像头连接到位于测试区域外的Windows PC。
5. 把没有旗帜的平台放在坦克的中央。
6. 在水箱中注满水，使其位于墙顶20厘米以内。
7. 调整平台的高度，使其淹没在水面以下1 cm处。
8. 将水族箱加热器浸入水箱中的水中，并将其设置为24°C，并让至少24小时达到设定温度。在进行行为测试前立即拆下加热器，并在每次测试后更换。
9. 在水中加入蛋彩画，直到它变成不透明。要达到不透明度，大约需要0.34g/L的油漆粉。不透明的水可以防止老鼠潜在地使用水下物体，例如从过去的试验中掉落的物体或逃生平台的底部，作为导航的视觉提示。< >
  < >
软件设置
1. 启动任何迷宫，然后在“文件”下单击“新实验”。任何迷宫都会打开一个新窗口，标题为“实验细节”。在“实验”选项卡的“标题”下输入实验名称，然后在“治疗”部分输入治疗名称和每次治疗的动物数量。
2. 为每个治疗分配动物：在测试选项卡下，单击“治疗代码报告”，任何迷宫都会为在“实验详细信息”部分输入的每个治疗分配一个字母（例如，，对照治疗指定字母代码A，药物治疗指定字母代码B）。单击“动物治疗和数据”，在“治疗”列下，使用下拉菜单将字母代码分配给治疗组的每只动物（例如，，动物编号1分配字母代码A，动物编号2分配字母代码B等）。这将确保实验中使用的所有动物都被指定为治疗组，并且可以通过点击<强>实验> <强>标签，并查看右侧的“强>治疗”<强>窗口。
3. 对于协议设置，单击“协议”选项卡，然后执行以下步骤：
  1. 单击“未命名协议”，并为您的协议指定一个名称。
  2. 单击“未命名协议”文件夹图标展开所有选项。
  3. 单击“视频源”，然后单击“新建视频源”。
  4. 从“视频图像源”下拉菜单中选择“数码相机”。通过在“视频源名称”文本框中输入一个名称，可以重新命名该视频源以供将来实验使用。
4. 设置相机后，按以下步骤继续配置MWM：
  1. 单击“设备”展开所有选项，水箱应在屏幕右侧的“新设备”标题下可见。
  2. 在“设备名称”文本框中将设备重命名为莫里斯水迷宫。
  3. 从“视频源”下拉菜单中选择“数码相机”。
  4. 从“测试控制键”下拉菜单中选择键盘上用于启动和停止分析的首选键。也可以使用外部设备（如无线鼠标），只要它们连接到计算机，并且在“测试控制键”下拉菜单下可见。
  5. 如果使用键盘，请从“测试控制开关”下拉菜单中选择“无”。
  6. 选择选项“如果用户结束测试，保存结果而不请求确认”。
5. 通过以下步骤在mwm油箱上绘制虚拟地图：
  1. 在右侧窗口中，单击“image”标题下的圆圈图标，并在MWM水箱顶部绘制一个圆圈，使圆圈的边缘与水箱中的水的边缘完全对齐。这将设置MWM设备的边界。
  2. 下一步，单击“image”标题下的线条图标，并绘制一条垂直和水平线，穿过先前绘制的圆的中间，使圆分成4个相等的象限。
  3. 将水迷宫平台放置在目标象限的中心，并使用“image”标题下的圆圈图标在平台周围画一个圆圈。
  4. 为了允许任何迷宫测量MWM装置内的距离，用尺子实际测量水箱中的任何距离（e.g.，水箱直径，平台直径等）。在“标尺线的长度为（mm）”前面的文本框中记录测量的距离。确保将“标尺线”沿着罐中测量的距离定位，以便任何迷宫都能正确地评估仪器内的刻度。（标尺线）可以在窗口的左下角找到，标记为“图像”。
6. 绘制虚拟圆和象限后，必须将每个象限指定给特定区域，如下所示：
  1. 单击“区域”，在“区域名称”文本框中输入名称，然后单击“图像”窗口中要分配给此区域的象限。
  2. 对其余3个象限和平台重复上述步骤。
  3. 分配完所有5个区域（4个象限和一个平台）后，单击第一个区域以验证“区域输入设置”。
  4. 确保选中了“Use the center of the animal is checked”（使用动物中心）前面的复选框。
  5. 对所有剩余区域重复此操作。
7. 为了让任何迷宫计算动物到平台的距离，需要在仪器内为平台指定一个参考点，如下所示：
  1. 单击“点”在设备中添加新点。将点放在右侧“图像”窗口中平台的中心。在“点名称”文本框中将此点重命名为平台。
  2. 确保选中了“计算距此点的距离时使用动物中心”前面的复选框“”。
8. 通过单击“测试设置和选项”调整测试设置，然后：
  1. 在“动物颜色”下，选择“动物比设备背景暗”选项。
  2. 在“跟踪动物头部”下，选择“否，我不需要跟踪动物头部”选项。
  3. 在“自动启动测试”下，选择“否，我将手动启动测试”选项。
  4. 在“测试时录制内容”下，从“录制频率”下拉菜单中选择“录制最多10个位置/秒”选项。
  5. 在“测试时显示什么”下，确保选择了以下选项：
    1. 显示经过的时间（即，向上计数）。
    2. 标记动物的中心点。
    3. 列出所有活动区域。
    4. 在图像的右上角显示指示灯。
    5. 在图像的右下角显示实时。
    6. 从视频工作时不显示视频文件名。
  6. 在“高级跟踪选项”下，选择“抑制水迷宫反射”选项。
9. 要自定义在MWM分析期间运行的所有试验的设置，请单击“阶段”，选择“手动安排试验”选项，然后单击“阶段”下的“试验”自定义试验设置，如下所示：
  1. 将“stage name”重命名为试用版。
  2. 将“测试持续时间”设置为90 s。
  3. 将“此阶段的最大试验次数”设置为4。
  4. 在试验的“自动重复”下，选择“不在此阶段自动重复试验（默认）”选项。
10. 要配置自动数据分析，请单击“分析”展开所有选项并执行以下操作：
  1. 在“跨时间分析”下，在“指定时间段的持续时间”前面的文本框中输入30s。
  2. 在“heading errors”下，选择“the following time after the start of test”选项，并在其前面的文本框中输入500毫秒。同时选中“计算区域中心的航向误差”选项。
  3. 在“向区域和点移动并远离区域和点”下，选择“根据整个区域计算向区域移动的时间”选项。
  4. 在“Additional Scoring–Overlapping Key Strokes”（附加评分-重叠按键笔划）下，选择“Merge Overlapping Key Strokes”（合并重叠按键笔划）选项。
  5. 单击“结果、报告和数据”，并调整“测试计划报告”的以下设置：
    1. 在“动物和测试信息”下，应选择以下选项：
      测试编号
      动物数量
      阶段
      试验编号
      仪器
      测试日期
    2. 在“仪器测量”下，应选择以下选项：
      试验持续时间
      总行驶距离
    3. 所有“区域度量（不包括平台区域）”都应选择以下选项：
      区域内的时间
      区域内行驶距离
    4. 在“平台区域测量”下，应选择以下选项：
      区域的条目数
      第一次进入区域的延迟
      区域初始航向误差
      平均航向误差
    5. 在“字段条目”下，选择“动物ID”选项
    6. 在“平台点测量”下，应选择以下选项：
      距点的平均距离
      距点的最大距离
      距点的最小距离
  6. 在“动物和测试详细信息报告”下调整以下设置：
    在“仪器测量”下，应选择以下选项：
    试验持续时间
    总行驶距离
    平均速度
  7. 在“测试数据报告”下调整以下设置：
    1. 在“动物位置和活动”下，选择“动物的位置”选项。
    2. 对于“测试数据报告”下列出的所有区域，仅选择“区域条目”选项。
  8. 在“数据页”下调整以下设置：
    1. 在“动物和测试信息”下，应选择以下选项：
      动物数量
      治疗
      治疗代码
      阶段
      试验编号
      仪器
      测试日期
    2. 在“仪器测量”下，应选择以下选项：
      试验持续时间
      总行驶距离
      平均速度
    3. 所有“区域度量”（不包括平台区域）都应选择以下选项：
      区域内的时间
      区域内行驶距离
    4. 在“平台点测量”下，应选择以下选项：
      区域的条目数
      首次进入区域的延迟
    5. 在“字段条目”下，选择“动物ID”选项。
    6. 在“平台点测量”下，应选择以下选项：
      距点的平均距离
      距点的最大距离
      与点的最小距离
      向点移动的时间
      离开点的时间
      指向点的初始航向误差
      平均航向误差
11. 要配置每个实验的结果，请单击“结果”选项卡以执行以下操作：
  1. 在“文本报告”下调整以下设置：
    1. 在“仪器测量”下，选择“测试持续时间”选项。
    2. 从“在X轴上显示”下拉菜单中选择“治疗”。
    3. 从“选择要显示的图形类型”中选择“散点图”选项。
    4. 选择单个点和组意味着从“选择图形应显示的内容”。
  2. 在“图形报告”下调整以下设置：
    1. 在“仪器测量”下，选择“测试持续时间”选项。
    2. 从X轴显示的下拉菜单中选择“治疗”。
    3. 从“选择要显示的图形类型”中选择“散点图”选项。
    4. 选择单个点和组意味着从“选择图形应显示的内容”。
  3. 在“统计分析报告”下调整以下设置：
    1. 在“仪器测量”下，选择“测试持续时间”选项。
    2. 从“选择第一个自变量”下拉菜单中选择“治疗”。
    3. 从“选择要使用的统计测试类型”选项中选择“参数化”。
    4. 在“选择要与之比较的控制组”下选择以下选项：
      
      1）
      
      包括一列标准偏差。
      
      2）
      
      在数据值旁边显示动物编号。
  4. 以下是“轨迹图报告”下的设置：
    1. 从“绘图类型”下拉菜单中选择动物中心点轨迹。
    2. 从“分组绘图依据”下拉菜单中选择“治疗”。
12. 配置完所有参数和设置后，将协议另存为所需文件夹中的文件。每个MWM实验的每个训练日都可以制作该协议文件的副本，并相应命名。 < >
行为测试
1. 第1-3天：习惯训练
  1. 第一天：让老鼠适应饲养区。
    1. 将老鼠放在家中的笼子里，放入饲养区30分钟。
      老鼠可以被分为一组，每个笼子最多4只，也可以被隔离。除非使用老年小鼠，否则每个笼子的小鼠数量对C57BL/6小鼠（V_ikar等人，2005年）的MWM行为几乎没有影响。对于老年小鼠，社会隔离可能是一个难题（Huang等人，2018年），不建议这样做。
    2. 回到正常的住房房间。
  2. 第2天：使小鼠适应腹腔注射程序和试验区域。
    1. 把老鼠放在笼子里。
    2. 从笼子里取出一只老鼠，用一只手抓住老鼠，用食指和拇指紧紧抓住它，同时用3rd和4th手指固定尾巴。
      注意：请务必确保您的机构动物护理和使用委员会批准所有有关老鼠的程序。
    3. 用圆珠笔牢固地戳老鼠来模拟腹腔注射。不要使皮肤凹陷超过0.5厘米。
    4. 将鼠标放回主笼30分钟。
    5. 对每个鼠标重复步骤c1b ii-c1b iv。
    6. 将一只鼠标放在迷宫中心的平台上。
      
      1）
      
      把老鼠放进迷宫后，立即离开测试区域。
      
      2）
      
      将鼠标放在平台上15秒。
      注意：在训练过程中，鼠标需要注意额外的迷宫视觉提示，以帮助确定平台的空间位置。如果老鼠在训练试验中找不到平台，引导它到平台并让它坐在那里15秒，将为老鼠提供一个看到视觉线索的机会，并更好地在迷宫中确定其空间位置。不同的mwm协议之间的时间量有所不同，但通常使用15秒，通常可以很好地生成学习和记忆（vorhees和williams，2006年）。
      
      3）
      
      如果鼠标从平台上跳下，请用手将其引导回平台，以确保其在平台上连续坐15秒。
    7. 把老鼠从迷宫里拿出来，用纸巾把它擦干，然后放回笼子里。
    8. 对每个鼠标重复步骤c1b vi-c1b vii。
  3. 第3天：使小鼠适应训练程序。
    1. 将所有老鼠放在家中的笼子里，放在一张被加热到37℃的垫子上。
    2. 把没有国旗的平台放在测试区迷宫的中心。
    3. 把一只老鼠从笼子里拿出来，用一只手把它抓起来。
    4. 用圆珠笔牢固地戳老鼠来模拟腹腔注射。
    5. 把老鼠放回笼子里30分钟。
    6. 对每个鼠标重复步骤c1c ii-c1c iv。
    7. 为了开始试验，将一只老鼠放在迷宫周边的水中，以随机选择的一个基本方向（N、E、S或W）面向迷宫的墙壁（图2）。
      
      1）
      
      把老鼠放进迷宫后，立即离开测试区域。
      
      2）
      
      让鼠标90秒找到平台。
      
      3）
      
      找到平台后，让鼠标停留15秒。
      
      4）
      
      如果90秒后鼠标找不到平台，或从平台上跳下，请用手将其引导回平台，并确保其在平台上坐了15秒的体验。
      < >
      图2。平台和鼠标位置。每次试验开始时，鼠标的起始位置由一只手握住鼠标来指示。在第3天及以后的所有试验中，小鼠将开始面对池壁。选择在第3天开始小鼠试验的初始位置决定了小鼠在随后几天开始每次试验的相对位置。灰色的小圆圈表示水箱内潜水平台的位置。< > < >
    8. 为了结束试验，把老鼠从迷宫里拿出来，用纸巾把它擦干，然后回到家里，把笼子放在加热过的垫子上，以防体温过低。
    9. 对每个鼠标重复步骤c1c vii-c1c viii。从同一个方向开始。
2. 第4-7天：培训课程
  1. 将所有老鼠放在家中的笼子里，放在一张被加热到37℃的垫子上。
  2. 将没有旗帜的平台放置在迷宫的一个象限的中心，与墙壁和游泳池中心等距。
    注意：在这个协议中，我们将平台放在训练过程中每次试验的同一象限中。或者，四分之一的动物可以在每个象限的平台上进行测试。后一种方法抵消了在寻找目标象限时可能出现的偏差。
  3. 把一只老鼠从家里的笼子里拿出来，用一只手把它抓起来。
  4. 空间记忆采集注入方式：
    1. 为了测试药物治疗对空间记忆获得的影响，将药物或载体腹腔注射到小鼠体内（图3）。
    2. 为了测试药物治疗对空间记忆巩固或恢复的影响，用圆珠笔用力戳小鼠模拟腹腔注射。
      < >
      图3。行为测试时间表。分别测试药物对记忆获得、巩固或恢复的影响的注射方案。指示颜色的箭头指定何时进行药物注射。当测试药物对获取或巩固的影响时，模拟腹腔注射的圆珠笔戳模拟注射发生在探针1、探针2和flag试验之前。当测试药物对恢复的影响时，模拟注射发生在每天的训练之前。在所有测试条件下，模拟注射在习惯化过程中进行。
      
      < >
  5. 将鼠标放回主笼30分钟。
  6. 对每个鼠标重复步骤c2c-c2e。
    在进行实验时，将老鼠的数量限制在30分钟内可以实际注射的数量。这可以防止小鼠在步骤c2d注射和步骤c2h开始训练试验之间的时间超过30分钟。
  7. 启动任何迷宫软件并打开先前配置的协议。确保视频源（摄像机）工作正常。MWM应该出现在右边的窗口中。
    1. 单击“测试”选项卡。
    2. 单击“测试计划报告”。每个鼠标的所有试运行都应该在左窗口的mwm实验中可见。
  8. 要开始训练试验，请将鼠标放在水箱中，与习惯训练时使用的基本方向相同，并面向池壁。
    1. 将鼠标放入迷宫中后，在将鼠标放入水箱中后立即按“播放”，启动计时器并在任何迷宫中激活视频录制。腾出测试区域，以确保实验人员对动物不可见。
    2. 鼠标在水箱中找到平台后，按“停止”键停止计时器。如果在分配的试用时间内鼠标无法定位平台，则软件将在达到分配的时间后自动停止计时器。
    3. 如果90秒后鼠标没有找到平台，请轻轻地将鼠标引导到平台上，并确保它在平台上坐了15秒。
  9. 每次试验结束后，将老鼠从迷宫中取出，用纸巾充分擦干，然后回到家中的笼子里，放在加热过的垫子上，以防体温过低。
  10. 对每个鼠标重复步骤c2h-c2i四次。
    1. 确保每只老鼠有10分钟的试验间隔。
    2. 在当天的第一次训练试验中，以相同的基本方向启动所有老鼠。
    3. 在随后的试验日，从上一个试验日的起始位置顺时针旋转四分之一圈，以基本方向启动每只老鼠。
  11. 内存整合注入机制：
    1. 为了测试药物治疗对空间记忆巩固的影响，每天最后一次训练后立即腹腔注射药物或载体。
    2. 为了测试药物治疗对空间学习或记忆恢复的影响，通过用圆珠笔牢固地戳每一只小鼠来模拟腹腔注射。
  12. 在随后的每一天训练中重复步骤c2a-c2j。
    注意：对于每一个训练日，将第一次试验的开始方向改为从前一天顺时针旋转四分之一圈的主方向。
3. 第8天：24小时长时记忆探针试验
  1. 把家里笼子里的所有老鼠都带到饲养区，放在加热到37℃的垫子上。
  2. 从测试区域的迷宫中移除平台。
  3. 把一只老鼠从家里的笼子里拿出来，用一只手把它抓起来。
  4. 内存恢复注入机制：
    1. 为了测试药物治疗对记忆恢复的影响，在探针试验前腹腔注射药物或载体。
    2. 为了测试药物治疗对空间学习或记忆巩固的影响，通过用圆珠笔牢固地戳小鼠来模拟腹腔注射。
  5. 把老鼠放回笼子里30分钟。
  6. 对每个鼠标重复步骤c3c-c3e。
  7. 启动任何迷宫并打开保存的协议。
  8. 要开始探针试验，将鼠标放在水箱中，与习惯化训练时使用的基本方向相同，并面向池壁。< >
    1. 将鼠标放入迷宫中后，立即在任何迷宫中按“播放”，并腾出测试区域，以确保实验人员对动物不可见。
    2. 让老鼠60秒探索迷宫。
    3. 任何迷宫在鼠标到达平台并记录时间后自动停止记录。如果鼠标找不到平台，则时间记录为60秒。
  9. 为了结束探针试验，将老鼠从迷宫中取出，用纸巾擦干，然后回到家中，放在加热过的垫子上，以防止体温过低。
4. 第15天：为期7天的长期记忆探针试验和视觉空间导航测试的flag试验
  1. 以相同的方式重复步骤c3。
  2. 所有小鼠完成第二次探针试验后，将带旗子的平台放置在迷宫中与训练和探针试验期间使用的目标象限相对的象限中心。
    注意：确保旗子在水面上方可见。
  3. 要开始旗帜测试，请将鼠标放在坦克中，与习惯化训练中使用的基本方向相同，面向池壁，远离旗帜。
    1. 将鼠标放置在迷宫中后，立即激活任何迷宫中的视频录制并腾出测试区域。
    2. 让鼠标90秒找到平台。
    3. 一旦90秒过去或鼠标找到平台，结束试验。
  4. 为了结束试验，把老鼠从迷宫里拿出来，用纸巾把它擦干，然后回到家里的笼子里，放在加热过的垫子上，以防体温过低。

数据分析

在训练和探针试验期间由任何迷宫获得的视觉数据被自动处理，并且可以提供关于多个参数的信息。每一个训练日绘制的平台或路径长度的平均值+/-标准误差应绘制在每个训练日（图4），并且具有重复测量的双向方差分析可以用来检测药物治疗的效果，以及在训练过程中的学习曲线。天。在训练过程中，缺少减少的转义延迟或路径长度来找到平台，这表明内存获取或整合受到损害。应在训练期间测量平均游泳速度作为对照，以确保试验药物对运动能力没有不良影响。
< >
图4。药物介导的记忆获得效应的代表性数据。在每个训练日的所有四个试验中，小鼠找到平台（a）、路径长度（b）和平均速度（c）的平均潜伏期。探针1上小鼠的总行驶距离（d）和在目标象限（e）中花费的时间百分比。在对探针1（f）和探针2（g）进行训练期间，老鼠进入平台先前所在区域的次数。小鼠在最终标记试验（h）中找到标记平台的潜伏期。数据表示为平均值和扫描电镜（n=7）。每组推荐不少于7只老鼠。然而，如果效果很小，则可能需要更多的小鼠来检测药物和载体治疗小鼠之间的统计显著差异。提供的示例数据展示了显示对记忆获取的影响的药物。同样格式的图表将单独制作，用于测试药物对记忆巩固和恢复的影响。注射显示对记忆巩固或恢复有影响的药物预计不会导致寻找平台和路径长度的潜伏期的显著差异，如（a）和（b）所示，但预计会导致目标象限时间百分比的减少，如（e）所示，或平台入口数量，如（f）和（g）所示。< > < > 对于探针试验，应绘制在目标象限或平台入口数量上花费的平均百分比时间，并且可以使用未配对t检验来检测药物和载体治疗之间的差异。在目标象限中花费的时间或平台条目数的减少表示内存检索受到损害。作为对照，可以测量探针试验过程中的总行程或平均游泳速度，以确保试验药物对运动能力没有影响。最后，还应绘制小鼠在最终标记试验中找到标记平台的潜伏期。对于训练阶段和探针试验，应根据评估药物对空间记忆的影响所使用的措施的多少，对显著性阈值进行Bonferroni多重比较校正。例如，如果在探针试验期间，使用目标象限中花费的平均百分比时间和平台条目的数量来评估空间记忆（两个独立的假设要测试），那么α的显著性阈值<；0.05应除以2，得出校正阈值α<；0.025。可以使用rstudio v0.97.551进行统计分析。

笔记

与注射载体的小鼠相比，干扰记忆获取和巩固的药物将导致更长的寻找平台的潜伏期和更长的行进距离。但是，重要的是，在药物治疗和载体治疗之间，在训练试验期间的平均游泳速度和探针试验期间的总行驶距离没有观察到差异，因为这表明药物可能影响游泳性能或寻找平台的动机，可能混淆了分析。此外，为了确保药物对视力没有不良影响，在车辆和药物治疗的小鼠之间，在寻找标记平台的能力上不应存在显著差异。
有时有些动物没有动力逃跑，只是漂浮。在这种情况下，老鼠应该留在MWM中直到审判结束。如果它在第二次试验中再次漂浮，那么它应该回到笼子里，第二天再进行试验。如果动物现在在接下来的测试日游泳，那么测试应继续与老鼠，但将错开一天落后于其他动物的测试时间表。如果动物在第二天没有游泳，那么它应该被排除在进一步的测试之外。此外，一些老鼠最初倾向于沿着游泳池的墙壁游泳（触壁游泳）。这种行为通常反映了焦虑和压力，尽管该方案中广泛的习惯化倾向于减少小鼠的焦虑。不能排除在训练试验和探针试验期间坚持使用麻醉剂策略的动物，除非它们在试验结束时未能在旗帜试验期间找到平台。焦虑效应可以通过额外的测试来明确测量，如高架正迷宫、高架零迷宫、明/暗测试或野外测试。
有人认为，在4天以上的MWM中使用的多个训练课程可能会导致在每次学习课程中重新激活和巩固的记忆痕迹，可能会掩盖与空间记忆最初巩固相关的事件（Florian和Roullet，2004）。另一种为期一天的集体训练方案已经开发出来，即小鼠在70-90分钟的时间内连续接受四次试验，然后在24小时后进行探针试验（Florian and Roullet，2004；Stein等人，2014；Villain等人，2016）。一天方案的优点是，它可以暴露药物治疗对训练后早期巩固的影响，而不会在多天训练方案中出现重叠的再巩固过程的并发症（Stein等人，2014年）。然而，使用集体训练的潜在问题包括记忆痕迹的建立较差和可能的低温效应。大鼠海马内注射蛋白激酶c（pkc）化学抑制剂后发现，使用mwm的一天集体训练或多天训练方案（bonini等，2007）。因此，使用多天方案在训练后阶段注射药物可以识别药物对巩固过程的影响，但需要注意的是，再巩固过程也可能受到影响。
记忆巩固的一些细胞方面可能在最初接触训练的30分钟内发生（Runyan等人，2019年）。由于每次训练结束时（持续时间约40分钟）都会注射一种药物以评估对记忆巩固的影响，因此使用本方案可能不会完全影响某些早期巩固阶段。然而，使用MWM的集体训练方案，在训练70分钟后，已经注意到药物对巩固的影响（Villian等人，2016年）。
小鼠比大鼠更易受MWM中的高温影响（iivonen等人，2003年）。通过确保在整个方案中水温保持在24°C，从水中取出后彻底干燥小鼠，在加热垫上保持家中笼子的温暖，可以降低高温的风险，并确保试验间隔不少于10分钟。如果使用老年或转基因小鼠，这一点尤为重要。