材料和试剂

纸巾
96孔板（透明平底，Max ISORP，热菲舍尔科学，目录号：442404）
4-羟基壬醛（Caymen Chemical，目录号：32100）
无菌牛血清白蛋白溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）
免疫注射铂（Cosmo Bio，目录号：CSR-IS-P-500）
抗HNE抗体（Percipio Biosciences，目录号：24327）
山羊抗鼠hrp结合抗体（Santa Cruz Bio Technology，目录号：170-5047）
Amplex UtraRed Reagent（菲舍尔热科学，目录号）
磷酸钠缓冲液（50 mm，pH 7.4）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
KCL（Sigma Aldrich，目录号：p3911）
NA2HPO4·2H2O（Sigma Aldrich，目录号：71643）
kh2po4（sigma aldrich，目录号：795488）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：p1379）
RIPA缓冲器（Thermo Fischer，目录号：89901）
Tris Base（罗氏，目录号：Tris-Ro）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
egta（sigma-aldrich，目录号：e3889）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
h2o2
1x磷酸盐缓冲盐（PBS，见配方）
1X elisa洗涤缓冲液（见配方）
1x Amplex红外线溶液（见配方）
1x tee-t缓冲器（见配方）

设备

INCU搅拌机（Benchtop Scientific，型号：MP4）
标准实验室摇杆（任何品牌）
荧光多孔读板器
双组织研磨机（Kimble，型号：3432N07）

程序

样品制备
1. 血清
  电镀前在PBS中稀释血清1:10（见配方）。
2. 组织匀浆
  使用双组织研磨机（Kimble）和1 g:10 ml的重量体积比，在tee-t缓冲液中均匀化心脏组织（见配方）。
3. 细胞裂解物
  使用RIPA缓冲液以1毫升缓冲液的比例溶解细胞：106细胞。
4. 阳性对照
  细胞培养：向细胞中加入100μm h2o22小时，在ripa缓冲液中制备细胞裂解液。包括在ELISA平板上的样品。对于血清或组织匀浆：在均一化和抗原吸附步骤之前（步骤2），将1.25μm的加合物（从步骤2）添加到至少2个未知样品中，并将这些样品包括在ELISA板上。
hne加合物标准曲线溶液的制备
1. 新鲜制备标准曲线，在每次elisa前一天，用1%bsa连续稀释hne（在50 mm pbs中稀释bsa溶液，pH7.4）。在保持bsa恒定的条件下，hne在1%bsa的200μl溶液中连续变化（0-0.019-0.0375-0.075-0.15-0.31-0.625-1.25-2.5-5μm）。
2. 37℃孵育24小时。
抗原吸附
1. 将100μL标准曲线溶液和100μl未知样品加入威尔斯，一式三份，并用胶粘剂盖住。
2. 摇动时在4℃下孵育过夜。
洗盘
1. 清空盘子，用纸巾吸干多余的液体。
2. 每孔加入200μl elisa洗涤液。
3. 重复步骤4a和4b直到盘子被洗涤总共6次。
阻塞
1. 在每孔中加入200μL免疫注射铂封闭剂，并用粘接密封盖住。
2. 摇动时在室温下孵育4h。
洗盘
按步骤4所述清洗板。
一次抗体孵育< BR>
1. 将100μL 1:100稀释的一级抗体（PrPiPIO BiosiScices）在PBS中加入到每个孔中，并用粘接密封覆盖。
2. 在37℃下搅拌2小时，在搅拌槽内搅拌。
洗盘
按步骤4所述清洗板。
二次抗体孵育< BR>
1. 将100μl的1:7500稀释的二次抗体（圣克鲁斯生物技术）在PBS中加入到每个井中，并用粘接密封盖住。
2. 在37℃下搅拌2小时，在搅拌槽内搅拌。
洗盘
按步骤4所述清洗板。
荧光显影与读数（amplex紫外溶液）
1. 向每个孔中加入100μl Amplex红外线溶液（新鲜制备），并盖上粘性密封。
2. 室温下培养，避光。
3. 使用多孔板式读取器，测量每个阱中的荧光在560 nm / 590 nm（EX/EM光谱为ReavuFiA，氧化产物在H2O2与Apple ReX反应，HRP催化）中形成。添加Amplex红外线溶液15、30和60分钟后进行此操作。

数据分析

将每个样品的荧光值输入分析软件（例如>，Excel，Gracpad PrSm，SigmaPlot）。
每一时间点（15, 30, 60分钟）的荧光值必须与HNE-BSA标准在同一时间点的值进行比较。在某些情况下，15分钟可能不够长，或者60分钟可能太长。这需要为每个实验室单独优化，并且可以根据荧光板读取器的灵敏度和可用性和/或其他因素而变化。
标准曲线符合适当的方程（通常为3rd阶多项式）。
用标准曲线方程对未知样本威尔斯中的值进行插值。
在未知样品威尔斯中的HNE加合物的浓度应归一化到每个孔中的蛋白质浓度。< BR> < BR>

结果>

由我们的实验室从人类心房活检制备的组织裂解物的代表性HNE adduct ELISA如图1所示，并已发表（KATUNGA 等。，2015B）。使用tee-t缓冲液制备裂解液，如下配方所述。然后将图1C所示的内插数据归一化为每个样品的蛋白质浓度。从这些数据中可以清楚地看出，测定的灵敏度标度为组织裂解物的低纳摩尔范围，但是这些值必须归一化到最终的呈递中的阱内的蛋白质浓度。最终单位通常表示为“nmol hne加合物/mg蛋白质（或μmol/g）。”
< BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“76”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /2019928080121381982 PNG”/> BR/> 图1。HNE加合酶联免疫吸附试验（ELISA）的代表性数据集（HNE加合酶联免疫吸附测定法）用于测定在手术时获得的右心耳活检组织中的HNE加合物/裂解物（<乔林> EM >等。，2014；KATUNGA 等。，2015A）。按方案要求制备样品，并按1:10稀释成PBS。在面板A是已知浓度的HNE-BSA加合物的标准曲线，在B板上是从同一板上的样品捕获的原始荧光数据，并且在C板中是来自相同样品的内插数据。标准曲线用第三阶多项式方程（立方）拟合，95%个置信区间用虚线表示。

食谱

1x磷酸盐缓冲盐（1L，pH 7.4）
8g氯化钠
0.2克kcl
1.44克钠2hpo4·2小时2o
0.24克kh2po4
1x elisa洗涤缓冲液（1L）
0.5毫升吐温20
999.5毫升多溴联苯
1x Amplex红外线溶液（10毫升，用于96孔板）
50μl Amplex红外线（DMSO中10 mm）
23μl 3%过氧化氢
9.925毫升多溴联苯
注意：在第11步之前立即准备。>
1X三通缓冲液（1L，pH值7.5）
1.21 g Tris碱
292毫克edta
380毫克egta
5毫升Triton-X
995毫升蒸馏水

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（HL122863，AG057006）和美国国防部（PR181276）对E.J.A.的资助。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突需要披露。

工具书类

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