材料和试剂

灭菌0.22μm孔径过滤器，直径33毫米（微孔，目录号：SLGP033 RS）
细胞培养用无菌6孔板（Cultek，目录号：153506）
透明96孔微孔板（Sudelab，目录号：900011）
96孔透明底黑色微型板（Biogen，目录号：PO-215003）
96孔白底微型板（Biogen，目录号：PO-204003）
无菌15ml离心猎鹰管（Cultek，目录号：45352096）
无菌2毫升Eppendorf试管
人胚肾（HEK-29 3T）细胞[93T（ATCC ®< /SUP>，目录号：CRL-316 TM ）]在液氮中贮存等分试样
细胞转染质粒
EM>注释：一个包含一个与RLUC融合的蛋白的编码，另一个包含第二个与增强的黄色荧光蛋白（EYFP）融合的蛋白的编码。包含RLUC或YFP序列的质粒可从AdGEGEN中获得，存储在-20°C. >
谷氨酰胺（GIGBO，目录号：25030-024），存储在-20°C
青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122），储存于-20°C
氯化钠（NaCl）（PANRACEApHealm，目录号：141659.1211），在室温下储存固体，或在4°C处储存150毫米等分试样。
NaCl（Panreac，目录号：131659.1211），室温储存
乙醇
cacl2·2h2o（panreac，目录号：131232.1211），室温保存
KCL（panreac，目录号：131494.1211），室温储存
kh2po4（panreac，目录号：141509.1211），室温保存；
mgcl2，无水（sigma-aldrich，目录号：m8266），室温贮存
mgso4·7h2o（panreac，目录号：141404.1211），室温保存
Na2HPO4·12h2O（PANRAC，目录号：141678.1211），室温保存
HEPES（Panreac，目录号：A37240500），室温储存
葡萄糖（panreac，目录号：A14221000），室温贮存
Bradford reagent（BioRad，目录号：500—00 06），存储在4°C
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A6003-25G）在4℃下储存固体，或在-20℃下储存在溶液中
科伦替拉嗪H（attendbio，目录号：E-102181），储存于-20°C，避光
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：21969-035），4°C保存
mem非必需氨基酸溶液（gibco，目录号：11140-035），4°C下储存
胎牛血清（FBS）（GIBCO，目录号：10270106），储存于-20°C
聚乙烯亚胺（PEI）（Sigma-Aldrich，目录号：408727），在室温下储存固体，或在-20°C下储存在40μm等份中
无菌40μm PEI（见配方）
无菌150毫米氯化钠（见配方）
BSA系列稀释液（0-1 mg/ml）（见配方）
补充DMEM（见配方）
HBSS（见配方）
科伦替拉嗪H溶液（见配方）

设备

水浴（Kotterman，型号：D-3162）
离心机（Eppendorf，型号：5084R）
离心机（Eppendorf，型号：5415R）
细胞培养箱（Thermofisher，型号：3308）
层流罩（更快，型号：BIO60）
分光光度计（温度计，多角度上升；354）
Fluostar Optima Fluorimeter（BMG LabTeCo，FuloStudio Optha）配备了高能氙闪光灯，10纳米带宽激发滤波器在485纳米和530纳米发射滤波器
Mithras LB 940平板阅读器（Berthold Technologies），配备485 nm和530 nm滤波器

软件

GraphPad Prism软件（GraphPad，https://www.graphpad.com/scientific software/prism/）
Microsoft Excel（Microsoft，https://products.office.com/es/excel“target=”\u blank“>https://products.office.com/es/excel）
MulkSCAN软件，由平板阅读器制造商提供，用于测量蛋白质浓度
由荧光板阅读器制造商提供的Oppima软件
MikRin 2000软件，由布雷特阅读器制造商提供

程序

融合蛋白
为制备融合蛋白而克隆的描述不在当前协议的范围内。< BR> 注：对于gpcrs，添加的（rluc或eyfp）蛋白质必须位于c末端，即细胞质（图2）。异常可能发生在特殊情况下（例如，如果想要寻找C类GPCRs的巨大胞外结构域之间的相互作用。简言之，将编码感兴趣蛋白质的cdna（不含其终止密码子）放入prluc-n1或peyfp-n1载体中，以获得包含rluc或eyfp的融合蛋白。其中一个受体（r1）应与rluc融合，另一个受体（r2）应与eyfp融合。我们建议尝试两种组合，因为通常一种组合比另一种效果更好。对于阴性对照，应将非相互作用受体（R3）融合到EYFP上，以使用R1 RLUC进行BRET。>
< BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“34”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /20199280957 10103063JPG”/>
图2。含有RLUC或YFP的融合蛋白在每个受体C端的卡通表达< <强> Br/> < BR>
细胞培养和瞬时转染（适用于真核细胞的任何电流细胞转染试剂；我们常规使用PEI）
1. 用2 mL L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素、1%（V/V）MEM非必需氨基酸溶液和5%（V/V）热灭活胎牛血清（FBS）在37℃和5%℃、2℃/2℃下培养HEK-29 3T细胞。细胞生长是最佳的，不需要使用较高的FBS浓度。在6孔板中的板细胞密度为250000个细胞/孔。单个布雷特测定需要9个转染条件，并且每个将需要2个威尔斯。总共9×2＝18威尔斯＝三个6孔板。10次传代后丢弃每批细胞，并解冻一个新的液氮储存瓶。
2. 电镀24小时后，转染hek细胞（它们应该是~50%汇合）。每两个威尔斯增加EYFP质粒的量（如上所述，在2威尔斯中进行相同的转染条件）。RLUC必须保持相对恒定，这需要初步测定以优化EYFP/RLUC比率。表1给出了转染条件的示例。第一个条件，仅包含rluc，用作细胞荧光的空白。在进一步的实验中，必须调整dna量以获得所需的蛋白质rluc和蛋白质eyfp表达值（见下文）。
  < BR> 表1。用于转染的DNA量的例子（每种条件需要两个威尔斯所需的总DNA）<<强> Br/> < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“650”高度＝“277”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /20199280957339171.PNG”/> BR/> < BR>
  1. 将250微升150毫米氯化钠（每管）添加到9个无菌15毫升离心管中。
  2. 添加所需数量的DNA，并使用漩涡混合。
  3. 同时，制备40μm PEI和150 mm NaCl（1:20）的混合物，用力旋涡。
  4. 将250微升PEI:NaCl混合物添加到每个试管中，使用涡流混合。< BR>
  5. 室温下孵育10分钟。< BR>
  6. 添加1.5毫升/管未添加的DMEM，混合（现在每管应包含2毫升转染混合物）。
  7. 从6孔板中吸取培养基，并小心地向每个孔中加入1毫升转染混合物。
  8. 将细胞置于37°C、5%CO2潮湿环境中培养4h。
  9. 用2毫升补充的DMEM替换转染混合物，并将细胞再次放入培养箱中48小时。
    < BR>
bret分析的细胞准备
1. 制备添加0.1%（w/v）葡萄糖的HBSS（见配方），在37℃水浴中预热混合物。
2. 从转染细胞中提取培养基。
3. 用预先加热的hbss葡萄糖溶液清洗细胞。
4. 每孔加入1毫升HBSS葡萄糖。
5. 分离细胞，池细胞从2威尔斯与相同的转染条件在2毫升EpBordRF管。
6. 在1000x g（室温）下离心5分钟。
7. 在200μL的HBsS葡萄糖中重新沉淀每个颗粒。
8. 为了调节蛋白质量，进行BrADFAD蛋白测定。
  1. 在96孔透明微孔板中，每孔加入10微升的牛血清白蛋白（BSA）稀释液（0-1毫克/毫升；一式两份）。
  2. 添加10 L L细胞样品/孔。
  3. 加入BrADFED试剂（200升L/井；以前稀释1∶5在MILQ水中）。
  4. 在室温下摇动盘子2分钟。
  5. 读取595nm处的吸光度。
  6. 使用GrofPad软件计算标准参数，并用它们计算每个细胞悬浮液中的蛋白质浓度。计算每个细胞悬浮液中必须加入的HBsS葡萄糖的量，以获得相当于0.2毫克/毫升的蛋白质浓度。 < BR>
评估eyfp表达量
1. 在96个透明底部的黑色微孔板上，每个样品（100个重复）加载20 L g／阱（2×G蛋白）。
2. 使用FuroStAR Optha荧光计平板读取器，用高能量氙闪光灯激发样品，使用10纳米带宽激发滤波器在485 nm处，并在530 nm处读取荧光。参见表2中的荧光测量示例。
  < BR> 表2。根据表1所示的每种条件下蛋白质EYFP表达进行荧光测量的示例 < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“480”高度＝“371”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /2019928095833×8092 PNG”/> BR/> < BR>
布雷特测量
1. 从库伦他嗪H原料中制备一种库伦他嗪H:HBSS葡萄糖稀释液（见配方）（1:40），放在冰上，避光。
2. 将90微升/孔的每个电池悬浮液（一式两份）装在底部不透明的96孔白色微孔板上。
3. 加入10微升/孔的科伦四嗪H溶液（科伦四嗪的最终浓度为5微米）；轻轻摇动平板。
4. 在加入柯伦四嗪H 1分钟后读取能量转移（例如>在Mithras LB 940平板阅读器上），使用485纳米滤光片（短波）检测蛋白质RLUC发出的生物发光，使用530纳米滤光片（长波）检测蛋白质RLUC能量转移时蛋白质EYFP发出的荧光。读写器能够集成两个波长并提供布雷特值，即两个读数之间的比率（参见布雷特读数示例表3）。 < BR> 表3。表1所示每个条件下的BRET读数示例 BR/> < BR>
评估rluc表达量
为了确定蛋白质RLUC的表达，在使用485纳米滤光片的MiTRAS LB 940平板读取器上加入腔肠菌素H 10分钟后，读取样品的生物发光（使用与布雷特读数相同的样品）。蛋白质RLUC读数示例见表4。
< BR> 表4。表1所示每种条件下蛋白质RLUC表达的生物发光读数示例 < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“430”高度＝“359”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 / 2090928、1001002、734、PNG”/> BR/>

数据分析

注意：>

当读取蛋白质yfp荧光时，第一个转染条件（即缺少蛋白质eyfp的条件）的值应在9000个荧光单位左右，其余条件的值应增加到60000个荧光单位（见表2）。>
当读取蛋白质RLUC表达时，数值应该在50000-150000单位左右（见表4）。>
如果表达式值不在此范围内，则丢弃数据。重新调整转染量，直到在所指示的范围内获得表达值。> BR/> < BR>

计算
1. 布雷特图的X轴（图3）示出了在测定中两种融合蛋白的表达之间的比率。从所有条件中减去第一转染条件（空白）的蛋白质yfp发射值。然后，将该荧光值除以相应转染条件下的蛋白rluc表达。最后，将该比率乘以1000，以便于数据处理（表5）。 < BR> 表5。自变量（x轴值）< <强> > BR/>的计算实例 < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“660”高度＝“331”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 / 2090928、1000、3535、45.59、PNG”/＞BR/> < BR>
2. 图的y轴显示了布雷特（图3）。净bret定义为[530 nm发射/485 nm发射]减去在第一条件下获得的[530 nm发射/485 nm发射]值（空白）。当测量布雷特时，Mithas软件已经为每个孔板给出了蛋白质EYFP发射（由于能量传递）和蛋白质RLUC发射之间的比率（见表3）。所有这些值减去第一个条件的比值（空白）。net bret值通常用毫微单位表示（mbu）=net bret x 1000。应丢弃负的netbret值。20 mBu下的netbret值表明缺乏能量传递（在分析条件下）（表6）。< BR> < BR> 表6。依赖变量（Y轴值）表6的计算示例。因变量（y轴值）<强> > BR/>的计算实例 < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“660”高度＝“306”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /2090928 1001001305967 PNG”/> BR/> < BR>
数据绘图和参数计算：布雷特 max 布雷特 50 < /Sub> BR/> 每个条件大约需要5个副本（都显示出良好的表达值）来构建适当的bret曲线。当收集到足够的数据时，将每个条件的x/y对值输入到图形化软件中，并通过非线性回归将值调整为“一个位点特定的结合方程”（由软件提供：y= bmax／Sub＞X/（KD＜/Sub> +X））。GbPad将显示BMax＜/Sub＞Em＞KD＞；BMax＜/Sub＞最大布雷特（布雷特Max＜/Sub＞），而EM＞KD< E/>＞等于（x轴）的布雷特读数（y轴）等于布雷特Max2。这些参数可用于比较来自不同布雷特实验/条件的数据。< BR> < BR> 如果数据导致饱和曲线，该曲线至少达到20 mBu的bretmax，则认为bret为正，即两个受体之间存在相互作用（图3）。如有必要，为了获得较高的x轴值（达到饱和）的读数，进一步进行蛋白含量较高的转染条件。任何线性关系都被认为是一个负结果，即>，缺乏相互作用。在这种情况下，例如>绘制阴性对照时，必须通过线性回归（x=0，y=0，图4）调整数据。
< BR>
优势、陷阱和解决问题
与fret相比，bret的优点是缺乏激发荧光供体的荧光发射源。此外，荧光照明可能导致高背景信号，并最终导致受体激发和/或信号猝灭。作为例外，当用共焦fret方法研究组织切片中的相互作用时，fret是一种选择。缺乏特定信号可能与缺乏互动无关。如前所述，可以尝试两个选项：r1 rluc和r2-yfp或r2 rluc和r1-yfp。最终bret2（使用融合到rluc的受体和融合到gfp2的另一个受体）可以解决这个问题，因为信号强度高于bret1
注：>
< div >
1. 必须至少进行五次不同的BRET实验课程。>
2. 每一个读数都被认为是用图形软件进行计算的一个值。在不同的时间内“相同”的结果的平均值是不正确的。原因：转染效率每天都有变化。因此，X轴中的比例从实验改变为实验，因此，在给定实验中每个点的X值平均值被认为是个体值。在非线性回归中得到SD，包括在所有实验阶段中获得的所有“个体”数据点。在过去的几年中，研究人员用不同的实验和“水平”条形误差来表示平均X值，但这个过程是不正确的。 BR/> < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“229”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /2019928 10010066936.JPG”/>
  图3。当两个受体形成异构体时，布雷特测定结果呈饱和曲线。BMax和 K> 子> d曲线是由非线性回归提供的。对于该曲线，bretmax=220±10 mbu，bret50=43±7（数据为平均值±sem）。
  < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“219”ALT=“”SRC=“/附/图像/ 20190928 /2019928 1001002213678. JPG”/>
  图4。负布雷特的例子。<强>在两个不形成异聚物的受体的情况下，数据适合于线性回归。

食谱

无菌40μm PEI
1. 将1g PEI稀释在1L毫升水中，用1 M HCl调节至pH=5.5
2. 通过0.22微米的过滤器过滤
3. 小量保存，避免连续冻融循环（例如，5 ml）
无菌150毫米氯化钠
将8.7 g NaCl稀释在1 l毫升水中，通过0.22μm过滤器过滤
牛血清白蛋白系列稀释液（0-1 mg/ml）
将1 mg牛血清白蛋白（bsa）在1 ml的毫升水中重复使用，并在毫升水中进行连续稀释，得到0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和0 mg/ml的溶液。
补充dmem
在500毫升DMEM瓶中加入25毫升热灭活FBS（在56°C孵育30分钟）、5毫升L-谷氨酰胺、5毫升青霉素/链霉素和5毫升MEM非必需氨基酸溶液。
HBSS
1.26毫米cacl2
5毫米kcl
0.44毫米kh2po4
0.5mm氯化镁2
0.4毫米mgso4
137毫米氯化钠
0.34毫米钠2hpo4
10毫米HEPES
对于5升：
0.92 g cacl2·2小时2o
1.85克kcl
1.85g kh2po4
0.235 g氯化镁2，无水
0.5 g mgso4··7h2o
40克氯化钠
0.605克钠2hpo4·12h2o
11.925克肝素
溶于5升毫厘水，pH=7.4
在4°C下储存溶液
对于HBSS葡萄糖0.1%（w/v）：
在100毫升HBSS中稀释100毫克葡萄糖（新鲜制备）
科伦替拉嗪H溶液
在1227微升乙醇中重新使用1 mg储备

致谢

这项工作得到了西班牙创新和竞争力部的支持。批准参考号：SAF2009-07276、SAF102-39875-C02-01和BFU2015-64405-R（可能包括欧盟联邦快递基金）。< BR> < BR> 该协议是在纳瓦罗等人出版的。，2018。我们的实验室已选用的文献中有一篇文章选择了：Chanes 等.（2003和2004），Carriba 等。（2008），MalueNez Piula[Em＞et al.（2014和2015），纳瓦罗& NSbSt= =“字体大小：1333 33 px；”等。> < /SPAN > SnSt= =“字体大小：1333 33 px”＞nbsp；

竞争利益

作者宣称没有利益的竞争。

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