材料和试剂

96孔平底测定板（Greiner bio-one，目录号：655180）
具有紫外线功能的96孔平底测定板（Corning，目录号：3635）
玻璃瓶
Eppendorf管（1.5 ml）（Eppendorf，目录号：0030120.086）
Sarstedt管2毫升（Sarstedt，D-51588）
50 ml塑料离心管（Corning CentriStar）
玻璃超细纤维过滤器（Whatman，目录号：1820-025）
水稻成熟植物
内聚半乳糖醛酸内切酶M2（Megazyme，目录号：PGALUSP，4°C）
果胶甲基酯酶（Sigma-Aldrich，目录号：P5400-1KU，-20°C）
α-淀粉酶（Megazyme，目录号：E-BLAAM，4°C）
ddH 2 O
乙酸测定试剂盒（Megazyme，目录号：K-ACET，4°C）
丙酮
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
70％（v / v）乙醇水溶液
氯仿/甲醇（1：1，v / v）溶液
上接枝试剂（乙酸：硝酸：水，8：1：2 v / v）
72％硫酸（用浓硫酸GR制备）
1 mg / ml葡萄糖原液（由D-（+）-葡萄糖制备）（Sigma-Aldrich，目录号：G8270，−20°C）
蒽酮试剂（浓硫酸中的2 mg / ml蒽酮）（Sigma-Aldrich，目录号：319899）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6508）
甲酸铵（Aldrich，目录号：516961）
11％过氧乙酸溶液（由35％过氧乙酸制备）（阿拉丁，目录号：P112625）
乙醇：甲醇：水溶液（7：2：1，用HCOOH调节pH值至3.0）
1％草酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：09898）
37％氯化氢
MES / Tris缓冲液（pH 8.1-8.3）（请参阅食谱）
2 M三氟乙酸（请参阅食谱）
1 N氢氧化钠（请参阅食谱）
1 N氯化氢（请参阅食谱）
50 mM甲酸铵（pH 4.5）（请参阅食谱）

设备

冷冻干燥机（北京松原华兴科技发展有限公司，型号：LGJ-12）
球磨机（QIAGEN，TissueLyser II，目录号：85300）
（可选）涡旋振动筛
篮式离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机（Eppendorf，型号：5430）（适合Eppendorf 1.5 ml管）
温控器舒适度（Eppendorf）
Dri-Block加热器（技术，型号：DB200 / 3）
酶标仪（PerkinElmer，Enspire）
集中器（Eppendorf，集中器加）
（可选）干燥箱
（可选）摇动培养箱
筛子（筛孔尺寸0.15毫米）
pH计（梅特勒-托利多）
半微米秤（双分辨率起始于0.01 mg）

程序

脱醇的不溶性细胞壁残留物（AIR）的制备
1. 汇集5-20个水稻成熟植物的整个第二节间（从上到下编号）。
2. 将新鲜样品在液氮中冷冻，然后在冷冻干燥机中冻干（将稻节间冻干48小时以确保完全干燥）。
3. 使用球磨机将组织研磨至不超过0.15毫米的粒度，并通过0.15毫米大小的筛网过筛。
4. 在50 ml塑料离心管中称取约1 g地面植物生物量。
5. 加入30 ml的70％（v / v）乙醇水溶液，使用涡旋混合器充分混合，然后在37°C和200 rpm的温度混合器中放置12小时。
6. 在篮式离心机中以1,500 x g 离心10分钟，并弃去上清液。
7. 重复步骤A5-A6。
8. 加入30 ml的氯仿/甲醇（1：1 v / v）溶液，使用涡旋混合器充分混合，然后在37°C和200 rpm的振动培养箱中放置30分钟。
9. 在室温下以1,500 x g 离心10分钟，弃去上清液。
10. 重复步骤A8-A9两次。
11. 加入15毫升的丙酮，摇动试管以重新悬浮沉淀物。
12. 以1,500 x g 离心10分钟，弃去上清液。
13. 重复步骤A11-A12两次。
14. 让生物质样品在40°C的干燥箱中干燥，不要摇动约16 h。
15. 在97°C下用40 ml MES / Tris缓冲液（pH 8.1）中的100 Uα-淀粉酶处理残留物35分钟，然后在60°C下处理1 h。
16. 以1,500 x g 离心10分钟，弃去上清液。
17. 用30 ml ddH 2 O洗涤沉淀3次，用15 ml丙酮洗涤2次，离心（每次1,500 x g 10分钟），每次洗涤后除去上清液。
18. 让生物质样品在40°C的烤箱中干燥约16小时，以去除空气中的淀粉。
结晶纤维素含量的分析
1. 称量2 mg AIR材料，一式五份，放入2 ml Sarstedt管中。
2. 向每个样品中加入250 µl 2 M三氟乙酸（TFA），并确保没有材料溅到管壁上。
3. 盖紧盖子，在Dri-Block加热器中于121°C孵育90分钟。
4. 在冰上冷却加热块和样品。
5. 以11,000 xem 离心10分钟，然后将上清液转移至新的Sarstedt管中以进行可选的非纤维素多糖成分分析（Foster et al。，2010），并保持沉淀结晶纤维素测定。
6. 向步骤B5剩下的沉淀物中加入1 ml Updegraff试剂（乙酸：itric酸：水，8：1：2 v / v），盖紧瓶盖并涡旋。
7. 在Dri-Block加热器中于100°C加热30分钟。
8. 在冰上冷却样品。
9. 将样品以11,000 x g 的速度离心10分钟。
10. 丢弃上清液，以确保不丢弃任何沉淀物。
11. 用1 ml水洗涤一次，并用1 ml丙酮洗涤四次，离心并按照上述方法弃去上清液。
12. 在35°C的Dri-Block加热器中风干沉淀。
13. 加入175 µl 72％硫酸，在室温下孵育60分钟。
14. 加入825 µl ddH 2 O，涡旋并以11,000 x g 的速度离心5分钟。
15. 在96孔平底测定板中使用蒽酮测定法分析上清液中的葡萄糖含量。
16. 加入10 µl样品和90 µl ddH 2 O，每个样品孔中的总体积为100 µl。
17. 使用1 mg / ml葡萄糖储备液（-20°C的储备液）准备标准液。通过将0、2、4、6、8和10 µl移入适当的孔中，加入100、98、96、94、92和90 µl ddH，制成0、2、4、6、8和10 µg标准液 2 O。
18. 加入200 µl新鲜制备的蒽酮摄政剂。
19. 将板在80°C的温度下加热30分钟，同时在热混合器中摇晃。冷却至室温。
20. 在恒温混合器中彻底摇动平板，然后在1小时内读取625 nm处的吸收。
从细胞壁残留物中提取果胶
1. 称重约6 mg脱淀粉的AIR，重复5次，放入1.5 ml Eppendorf管中。
2. 加入1 ml 50 mM甲酸铵（pH 4.5）缓冲液，然后加入2 U内聚半乳糖醛酸酶M2和0.04 U果胶甲基酯酶。混合并在37°C下孵育16小时，然后在300 rpm的温度下摇动，并置于舒适的温度混合器中。
3. 于3,000 x g 离心10分钟，然后将富含果胶的上清液转移至新试管中。将残留物保留为无果胶样品。
4. 用液氮冷冻上清液，然后在冷冻干燥机中冻干，最后得到凝胶状果胶。
从AIR分离乙酰木聚糖
1. 称量约400 mg脱去淀粉的AIR到50 ml离心管中。
2. 加入30 ml 1％草酸铵，在85°C下孵育2小时。在篮式离心机中以1,500 x g 离心15分钟。丢弃上清液以除去果胶。
3. 加入30 ml 11％过氧乙酸溶液，在85°C的水浴中孵育30分钟以进行脱木素作用。
4. 以1,500 x g 离心10分钟。弃去上清液，并通过离心（1,500 x g 10分钟）并用30 ml ddH 2 O洗涤3次，并用15 ml丙酮洗涤一次，沉淀。
5. 让颗粒在设定为40°C的烤箱中干燥约16小时。
6. 加入30 ml DMSO，然后在70°C下孵育12 h以进行提取，以1,500 x g 离心10分钟，然后将上清液转移至新的玻璃瓶中。
7. 用12 ml DMSO重复步骤D6，并合并含有提取物的上清液。
8. 通过玻璃微纤维过滤器过滤提取物。
9. 在4°C下用5体积的乙醇：甲醇：水溶液（7：2：1，pH 3.0）沉淀提取物12小时。
10. 以1,500 x g 离心15分钟。弃去上清液，并用10 ml无水乙醇离心4次（每次1,500 x g 10分钟）洗涤沉淀四次，每次洗涤后除去上清液。
11. 在室温下在浓缩器中真空干燥沉淀。
测定乙酰基酯的含量
1. 称重约1 mg脱淀粉的AIRs /果胶/木聚糖，重复5次，放入1.5 ml Eppendorf管中。
2. 向试管中加入100 µl 1 N氢氧化钠，并在28°C和200 rpm下摇动1 h，以释放结合的乙酸盐。
3. 加入100微升的1 N氯化氢以中和样品。
4. 以15,000 x g 的速度离心10分钟，然后将10 µl上清液等分试样转移至具有UV功能的96孔平底测定板中，并根据乙酸测定试剂盒的说明立即定量释放的乙酸。
5. 向具有UV功能的96孔平底测定板的每个样品孔中加入94 µl ddH 2 O。
6. 加入42 µl由试剂盒提供的溶液1和2（2.5：1、30 µl + 12 µl各自）制成的新鲜制备的混合物，混合并在25°C下温育3分钟，并在300 rpm的温度下摇动，并置于热混合器中。
7. 读取340 nm（A0）处的吸收。
8. 加入12 µl新鲜稀释的试剂盒提供的溶液3（1：10，v / v，在ddH 2 O中），混合并在25°C下孵育4分钟，并在300 rpm下摇动。温控器的舒适性。
9. 读取340 nm（A1）处的吸收。
10. 加入12 µl新鲜稀释的试剂盒提供的溶液4（1：10，v / v，在ddH 2 O中），混合并在25°C下孵育12分钟，并在300 rpm下摇动。温控器的舒适性。
11. 读取340 nm（A2）处的吸收。
12. 同时，必须同时进行空白对照和标准曲线。要绘制标准曲线，请添加等于，等于0.5、1、1.5、3、5 µg的5、10、15、30、50 µl乙酸标准溶液（溶液5），并调节ddH 2 O，分别为99、94、89、74、54 µl。

数据分析

标准曲线的生成和纤维素含量的计算
要计算纤维素含量，首先需要绘制标准曲线（葡萄糖标准品的吸光度与葡萄糖标准品的浓度）。然后用标准曲线计算样品的纤维素含量（微克葡萄糖/毫克空气）。
用于乙酰化含量分析：Δ乙酸=（A2-A0）样品-（A1-A0） 2 样品 /（A2-A0） sample -[（A2-A0）空白-（A1-A0） 2 空白 /（A2-A0）空白]。
在标准曲线中找到样品值，并获得等分样品中的乙酸含量。通过乘以（100 + 100）/ 10 /重量（µg / mg AIR）的系数来计算样品含量。
对于统计分析，通常使用节点间池中的至少五个生物学副本。结果以均值报告，标准差和统计显着性通过学生的 t 检验或单向ANOVA进行评估，然后再进行Tukey的多重比较检验。

笔记

如果没有冷冻干燥机，则可以选择直接用冷冻的组织制备AIR，冷冻后的组织用研钵和研杵浸入液氮中匀浆，或者将球磨机预先浸入液氮中。
为了进行乙酰化分析，应尽快测定释放出的乙酸，不要在板读数前放置太久。

菜谱

MES / Tris缓冲液（pH 8.1）
1. 在40毫升双蒸馏水中加入488毫克MES和355毫克Tris。
2. 用氢氧化钠调节pH至8.1，最后稀释至50 ml
2 M三氟乙酸
用ddH 2 O稀释15.31 ml TFA，使最终体积为100 ml
1 N氢氧化钠
向50 ml的ddH 2 O中添加2 g氢氧化钠
1 N氯化氢
将4 ml 37％氯化氢与44 ml ddH 2 O
50 mM甲酸铵（pH 4.5）
1. 将0.15克甲酸铵加到50毫升ddH 2 O中
2. 用甲酸将pH调节至4.5

致谢

该协议改编自以前的工作（Zhang et al。，2019）。这项工作得到了中国国家自然科学基金（批准号31530051、31571247和91735303），中国科学院青年创新促进会的支持（批准号2016094）。该协议基于以下先前已发布的报告：Updegraff（1969），Harholt 等人（）（2006），Goncalves 等人（）（2008），Li 等人（（2009），福斯特（emoster）等人（）（2010），布罗姆利（emrom）等人（）（2013），德苏扎（em Souza）等人（2014），张 et al。（2017）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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