材料和试剂

50 ml离心管（Thermo Fisher，目录号：338652）
金属锅铲（Fisher Scientific，目录号：11523482）
玻璃盖玻片（Thermo Fisher，货号：102260）
用于P3小鼠的25 G，19 mm（0.75英寸）的Probe Point（Blunt）针（哈佛仪器，目录号：725461）；带有铝制轮毂的Monoject钝针，用于P7小鼠为23 G，1英寸（哈佛仪器，目录号：722349），用于P14和成年小鼠的21 G（由21 G注射器针头定制）（均来自英国Harvard Apparatus）
24孔板（Corning ® Costar ® TC处理的多孔板）（Sigma-Aldrich，CLS3527-100EA）
96孔板（Thermo Fisher，货号：249952）
伊比迪（Ibidi）24孔μ板（未涂覆）（伊比迪（Ibidi），目录号：82401）
Transwell（0.4 µm孔，12 mm，聚酯膜）（Corning，目录号：3460）
显微镜载玻片，SuperFrost ®，MenzelGläser（VWR，目录号：631-1318）
非无菌丝绸黑色编织缝合线轴，22.9 m，尺寸5-0（英国哈佛仪器公司，目录号：517607）
BD Micro-Fine + 29 G，1 ml胰岛素注射器（MediSuuplies，目录号：PMC3743）
5毫升注射器（VWR International，目录号：SART16644-E）
Thermo Scientific TM Nunc TM 细胞培养/培养皿，100毫米（Fisher Scientific，目录号：10508921）
Swann-Morton手术刀，第22号（MediSupplies，目录号：PMC0105）
湿冰和冰盒
查尔斯河实验室的C57BL / 6雄性和雌性小鼠
EpCAM-FITC（CD326）单克隆抗体（eBioscience，目录号：11-5791-80;克隆G8.8）
Alexa-647偶联的PECAM抗体（CD31-Alexa 647）（Biolegend，目录号：102416;克隆390）
实验室薄页纸（蓝色卷）
金属平垫圈（重量1.66克）（M8-5 / 16 th 英寸直径）（英国B＆amp; Q）
绝对乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：34852-M）
戊巴比妥（Pentoject，Animalcare，目录号：XVD 132）
低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（1x）（Life Technologies，目录号：14025-050）
HEPES 1 M（Life Technologies，Gibco，目录号：15630080）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco，目录号：20012068）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco，目录号：31966-021），在食谱中也称为“ DMEM基础培养基”
青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Life Technologies，Gibco，目录号：15140122）
MTT试剂（噻唑基溴化四氮唑蓝）（Sigma-Aldrich，目录号：M2128）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
10％中性福尔马林缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）
DAPI（原料浓度10 mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
LIVE / DEAD ®活力/细胞毒性试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：L3224）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
ProLong ®防锈金贴剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36930）
罗丹明硅远红外荧光团缀合的DNA小沟结合剂双苯甲酰亚胺（SiR-DNA）（tebu-bio Ltd，目录号：SC007）
配方中含有HEPES的不含酚红DMEM（生命技术，目录号：21063029），在配方中也称为“含HEPES基础培养基的不含酚红DMEM”
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
（可选）对硝基硝基苄青霉素（开曼化学公司，目录号：13891）
（可选）细胞松弛素D（Sigma-Aldrich，目录号：C8273）
HBSS / HEPES冰冷缓冲液（请参阅食谱）
琼脂糖溶液（请参阅食谱）
SF-DMEM（请参阅食谱）
图像媒体（请参阅食谱）
MTT工作解决方案（请参阅食谱）
70％乙醇（请参阅食谱）
70％甲醇（请参阅食谱）

设备

弯曲解剖钳，10厘米，Serr / C（世界精密仪器有限公司，目录号：15915）
细尖解剖剪刀，直，10厘米（World Precision Instruments Ltd，目录号：14393）
14厘米直形手术剪刀（World Precision Instruments Ltd，目录号：14192）
弹簧剪刀，直12厘米，超细刀片12毫米（World Precision Instruments Ltd，目录号：14125）
用于振动刀的不锈钢刀片（Campden Instruments LTD，目录号：7550-1-SS）
自动化振动刀（Compresstome ® VF-300-0Z；美国精密仪器有限责任公司）
保温箱（加湿器，37°C，5％CO 2 ）
-20°C冷冻室
GFP滤光片，激发450-490 nm，发射500-550 nm（用于EpCAM-FITC）
Cy-5滤光片，激发625-655 nm，发射665-715 nm（用于SiR-DNA和PECAM）
酶标仪（Tecan; Sunrise TM ，INSTSUN-1）
蔡司Axio Observer倒置宽视野显微镜，配备Lumencor Spectra X LED光源和Hamamatsu Flash 4.0相机（德国蔡司）
蔡司LSM-510倒置共焦显微镜（德国蔡司，型号：LSM 510）
Leica DM2500宽视野显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM2500）

软件

Zen2采集软件，蓝色版本（德国蔡司）
ZEN 2009（黑色版）软件（德国蔡司）
FIJI（ImageJ，版本2.0）
冰冷的开源生物成像分析软件（1.9.8.0版；由法国巴黎巴斯德研究所的定量图像分析部门创建）
惠更斯反卷积软件（Scientific Volume Imaging，SVI，Essential版本17.10）
NIS-Elements（4.50版，英国尼康仪器公司）
GraphPad Prism版本5
Microsoft Excel（Microsoft Office 2011版本）
Microsoft PowerPoint（Microsoft Office 2016版本）

程序

生产精确切割的肺片
1. 小鼠解剖和肺收获
  1. 通过腹膜内注射戊巴比妥（50 mg / kg体重），人道地杀死出生后第3天（P3），P7，P14或成年（6-8周）C57BL / 6小鼠。使用29 G，1 ml胰岛素注射器注射25μlP3戊巴比妥，P7 50μl，P14 75μl和成年小鼠100μl（图1A7）。注射后5至10分钟内小鼠会死亡。通过对股动脉放血确认死亡。
  2. 将鼠标仰卧在解剖盘上。在腹部，胸部和颈部的前部喷洒70％的乙醇。
  3. 用弯曲的镊子（图1A2）从前腹壁捏住皮肤，然后轻轻向上拉，切开一小块皮肤，使内腹膜完好无损。
  4. 使用一把细剪刀（图1A4）沿前腹部和胸壁的中线做一个纵向切口，并将其延伸到下巴（图1B）。
  5. 使用两对弯曲的镊子，使两侧的皮肤缩回，露出腹部，胸壁和颈部的前侧。（图1Ci）（视频1）。
  6. 用弯曲的镊子小心地提起腹部上部腹膜壁，正好位于肋缘以下，并用细剪刀的尖端开一个小开口。
  7. 用细剪刀将开口向左右延伸。这将使隔膜露出。
  8. 轻轻抬起胸骨的下端，并用细剪刀的尖端在隔膜的上部开口。然后将开口沿肋缘的内表面延伸到隔膜的两侧（图1C i，ii，黄色虚线）。在此阶段，您将能够看到浅粉红色的左右折叠肺（图1C iii，箭头）。
  9. 用弯曲的镊子握住胸骨的下端提起胸壁，并小心地做胸骨旁切口（向左和向右），使前胸壁与人体分离（图1C i，iii，黄色虚线）（视频1 ）。
  10. 使用弯曲的镊子和细剪刀，从颈部壁的前侧和外侧去除肌肉和筋膜。
  11. 使用弯曲的镊子，在颈部中点在气管后侧和食道前壁之间开一个开口（视频1）。
  12. 通过开口插入一块无菌缝合线，并将其垂直于气管的中点放置（图1）。
  13. 使用细尖的直形弹簧剪刀在环状软骨下方的气管前壁上开一个小开口（图1A，（6），1C（iii）黄色箭头，图1D（ii）插图）。
  14. 小心地将硬质金属插管25 G（用于P3），23 G（用于P7）和21 G（用于P14和成年小鼠）穿过气管，直到主支气管分叉处高出一毫米，然后用缝合线固定到位（图1C（iv）和一维（ii）插图）。通过施加两个结，将缝合线以适度的紧度绑在气管周围，包括内部的插管。
  15. 插管后，轻轻注入1.5％的低熔点琼脂糖，使之膨胀，该琼脂糖应加温至37°C的HBSS / HEPES缓冲液（请参见食谱）。使用5毫升注射器注入琼脂糖，并将注射器连接到套管，直到琼脂糖固化。给两个肺充气，使它们保持在胸腔内原位，使用P3为0.2 ml，P7为0.275 ml，P14为0.35 ml和成人肺为1 ml。这些体积使肺部完全膨胀，而不会出现过度或次佳的膨胀（图1C和1D）。
  16. 充气后，在裸露的胸壁上放一块双层实验室蓝色卷，然后在蓝色卷上放一些湿冰，使琼脂糖固化。
    注意：根据鼠标的年龄，这将需要1-2分钟。
  17. 从气管中轻轻拔出套管，然后拧紧缝合线结。
  18. 从其上端（嘴）将气管放出来。握住缝合线的自由端提起气管，并从胸腔中轻轻移走整个心脏和肺部（图1C和1D）。
  19. 将整个心脏和肺部浸入50毫升离心管中的无冰冷无血清DMEM（SF-DMEM）中，盖紧盖子并保存在湿冰上直至切片。组织可以在冰上放置2-3小时。
    
    视频1.鼠标解剖：从皮肤切口到气管动员
    。
    
    图1.解剖小鼠和收集肺部的工作流程。 A.解剖设备：1.缝合线2.弯曲钳3.尖端镊子4.尖端解剖剪刀5.手术剪刀6 。弹簧剪刀，7.注射皮下注射针的1 ml注射器中的戊巴比妥。 B.皮肤切口线。 C.成年小鼠解剖，琼脂糖膨胀和肺部收获。 D.产后第3天（P3）小鼠解剖，琼脂糖充盈和肺部收获。
2. 精确切肺切片
  1. 准备自动振动刀：通过喷雾70％乙醇彻底消毒振动刀的缓冲液托盘，然后晾干（图2A）。使用强力胶将振刀的刀片固定在刀片支架上，然后晾干。使用70％乙醇喷雾消毒样品架和样品管并风干。在使用前，将注射器冷却块放在-20°C的冰箱中15-30分钟以使其冷却（图2B）。
  2. 准备在37°C的温度下用HBSS / HEPES制备约30 ml的1.5％琼脂糖凝胶。准备200 ml无菌冰冷的1x HBSS / HEPES缓冲液，并保持在冰上。用每孔1 ml冰冷的无菌SF-DMEM制备24孔板，并保持在冰上。
  3. 在直径为10 cm的培养皿中，用手术刀刀片将左肺叶与左支气管分开（图2C和2D）。
  4. 使用手术刀刀片从肺根部切除一小部分组织（图2D；切除的组织轮廓用虚线标记）。
    注意：这有助于将瓣垂直放置在样品架上。
  5. 将肺叶放在一块干净的实验室蓝色卷上，以吸收多余的介质（图2D）。
  6. 将一滴超级胶水滴在样品架的切割端上（图2Ei），然后将肺叶的切割端轻轻地放在胶滴上，用弯曲的镊子将其垂直固定，直到肺叶牢固地粘附在样品架上（图2Eii）。
    注意：将肺叶附着在标本支架上需要15到30 s。
  7. 将标本支架插入金属标本管，垂直握住，使肺叶保持在标本管内并垂直面向上（图2Eiii）。
  8. 使用5 ml注射器，将37°C的1.5％温暖的琼脂糖填充到样品管中，以使整个叶浸没在琼脂糖中（图2Eiii）。
  9. 将冷注射器冷却块（图2B）放在样品管周围，并将其固定到位，直到琼脂糖组织块凝固（图2Eiv）。
    注意：凝固琼脂糖大约需要一分钟。
  10. 将标本管插入缓冲液托盘，然后将刀片和琼脂糖组织块的切割端对齐。
  11. 用冰冷的HBSS / HEPES缓冲液填充缓冲液托盘。将所需的组织切片厚度设置为300 µm。将切割速度设置为5，将切割振荡频率设置为5。在“连续模式”下操作振动刀。
  12. 开始收集横向精确切割的肺切片（PCLS）。使用小金属刮刀从缓冲液托盘中取出肺叶的前1/3 rd 个肺片。从叶的中间1/3 rd 收集切片，并将其放在装有冰冷SF-DMEM的24孔板的孔中（图2F）。肺叶的中间三分之一提供几乎相等大小的切片。在每孔1 ml培养基中取1个肺切片。（使用此技术，P3左肺提供12个切片，成年肺提供大约36个切片。）
    注意：使用相等大小的切片进行成像和代谢测定非常重要，其余的切片可用于其他测定，例如例如，免疫染色，蛋白质或RNA提取。
  13. 在5％CO 2 存在下于37°C孵育PCLS 2 h，然后在无菌条件下，在通风橱中，用温热SF-DMEM洗涤两次以除去组织周围多余的琼脂糖。
    注意：一些琼脂糖会残留在肺部的气隙中，这对于在培养过程中保持肺部结构很重要。
  14. 在5％CO 2 存在下，将PCLS在SF-DMEM中于37°C孵育1小时。至此，PCLS已准备好进行实时成像和进一步的实验。
    注意：立即将样品用于成像（和迁移分析）；但是切片可以过夜培养，以进行其他实验。
肺泡发生的活细胞成像
1. 无标签的明场实时成像
  为了可视化肺切片随时间变化的总体结构变化，可以按以下方式执行实时明场成像：
  1. 使用不含酚红的DMEM和ibidi 24孔μ板进行实时成像。
  2. 准备用于成像的Transwell：使用剪刀剪下并去除Transwell的边缘，以使Transwell过滤器与孔底部的肺切片接触（图2G）。用HBSS（温热）清洗跨孔，以除去碎屑，并将其放置在没有缓冲液的ibidi 24孔μ板的未使用孔中。
  3. 将50 µl温暖（37°C）的无酚红SF-DMEM加入ibidiμ平板孔的中心。
  4. 使用薄的无菌金属刮刀从上面的步骤A2n中取出PCLS，然后小心地将其放置在ibidiμ平板孔的中心。确保将肺片放在中间并且平坦且没有折叠。
  5. 然后将修饰的transwell轻轻放在PCLS的顶部。
  6. 将500 µl不含酚红的SF-DMEM加入到Transwell的上腔室中，并将300 µl加入到Transwell的下腔室中。
  7. 为了将PCLS固定在适当的位置，请在Transwell外壳顶部放置一个带有中心孔的1.66 g金属平垫圈（图2H和2I）。
    注意：此重量通过可渗透的Transwell膜在组织切片上施加轻微压力，该膜将切片固定在适当的位置，而不会损坏组织。金属平垫圈的重量不应超过3.32克。
  8. 将PCLS在37°C下，在5％CO 2 和95％空气（〜21％O 2 ）存在的潮湿培养箱中孵育2小时。此温育步骤使肺切片在图像采集之前安定下来。
    注意：实时图像后，应分配大小相似的PCLS进行MTT活力测定，如图3所示。
  9. 同时，在以下条件下（37°C，5％CO 2 ）加湿并预先平衡Zeiss Axio Observer宽视野落射荧光显微镜（或类似设备）的培养箱，持续30分钟至1小时。 sub>和室内空气中的氧气水平，大约21％。
  10. 孵育和预平衡后，将包含PCLS的ibidi 24孔板转移至显微镜培养箱，并在整个延时过程中保持上述培养箱条件。
  11. 使用长工作距离40倍（0.7 NA，空气）物镜在强光下开始捕获延时图像（图2I）。
  12. 对于明场成像，请在感兴趣的区域找到最佳聚焦平面，并保持该点为中心，以1 µm的步长选择朝向切片上表面的30个z切片和朝向切片底部表面的30个切片，切片之间的间隙（在组织的60 µm z轴中间总共有60个切片）。
  13. 将延时拍摄图像间隔设置为每15分钟12-19小时。
    注意：每小时四张图像（间隔15分钟）减少了曝光量，从而最大程度地减少了荧光团漂白现象，但可以产生10-12fps的平滑延时视频（请参阅Akram等人的补充电影2,2019）。
  14. 从PCLS的四个象限中选择4个单独的感兴趣的区域，避开气道，进入肺泡区域。
    注意：显微镜培养箱的2µh孵育和预平衡对于在延时图像采集过程中避免焦点平面漂移至关重要。图片每个实验4个单独的PCLS。
    
    图2.精确切割的肺切片和实时成像设置。 A.肺切片机：Vibratome，Compresstome ® VF-300-0Z。 B.用于凝固琼脂糖的注射器冷却块。 C.从P3小鼠收获的琼脂糖使肺膨胀。 D.在实验室组织卷上分离左肺叶。 E.显示左肺叶琼脂糖包埋在用于制备PCLS的标本支架上的示意图。 F.精确切割的肺切片在24孔板中。 G.修饰transwell以稳定孔板上的肺切片。 H.精确切割的肺切片使用改良的transwell和金属平垫圈（黑色边框）设置在ibidi 24孔μ板上。 I.示意图显示了倒置显微镜上的金属平垫圈，transwell，肺切片和40倍长工作距离空气物镜的相对位置和对准，用于实时成像。
2. 免疫染色PCLS的实时荧光成像
  用于实时成像的PCLS双重染色
  1. 为了可视化和跟踪PCLS中的上皮细胞，请使用结合FITC的EpCAM抗体（EpCAM-FITC）和SiR-DNA对双色细胞进行染色。（EpCAM选择性标记上皮细胞膜。SiR-DNA是若丹明硅红光荧光团缀合的DNA小沟结合剂双苯甲酰亚胺，可染色细胞核）。
  2. 将PCLS（来自步骤A2n）在37°C下与1：200稀释的EpCAM-FITC抗体和1：300稀释的SiR-DNA在DMEM中孵育（不振摇）。每个PCLS每孔使用500μl抗体/ SF-DMEM培养基。
  3. 为了观察肺泡区域内的上皮细胞和内皮细胞，将PCLS与Alexa-647偶联的PECAM抗体和EpCAM-FITC抗体在37°C下分别以1：200在每孔每个样品500 µl SF-DMEM中孵育1 h。
  4. 孵育后，用温热的SF-DMEM清洗PCLS 3次。
  PCLS的延时荧光成像
  1. 图像介质：通过添加1：500的EpCAM-FITC抗体和1：1000的SiR-DNA用于上皮细胞或添加1：500的PECAM以及EpCAM-FITC（1：500）进行双标记的上皮/每个孔中每个PCLS含800 µl无酚红SF-DMEM的内皮细胞。
    注意：1：1000稀释的SiR-DNA可用作上皮或内皮标记双重标记的细胞的核标记。
  2. 将50 µl图像介质滴放在ibidi 24孔μ板的孔中心，并用薄金属刮刀小心地将双重染色的PCLS放在图像介质上。
  3. 将改良的Transwell放置在PCLS的顶部，将500 µl图像介质添加到上腔室中，并将300 µl图像介质添加到底部腔室中，最后通过如上所述将平坦的金属垫圈放在Transwell上来稳定Transwell。 2I）。
  4. 将PCLS在5％CO 2 和95％空气存在下于37°C的潮湿培养箱中培养2小时。此孵育步骤会增强染色效果，并允许肺片在图像采集之前安定下来。
  5. 按照用于明场成像的说明预先平衡显微镜培养箱（如步骤B1i）。
  6. 孵育和预平衡后，将24孔板转移至倒置的Zeiss Axio Observer宽视野落射荧光显微镜培养箱中，并在整个延时时间内保持上述培养箱条件。
  7. 使用GFP滤光片，使用长工作距离40倍（0.7 NA，空气）物镜开始记录延时图像，激发450-490 nm，发射500-550 nm（对于EpCAM-FITC）和Cy-5，激发625- 655 nm，每片从肺泡区域的4个场发射665-715 nm（用于SiR-DNA和PECAM），持续15-19分钟，持续8-19 h。沿z轴从中间11 µm厚度的组织中捕获11张图像，每个切片之间有1 µm的步距，以从每个PCLS组成z堆栈。注意：
    1. 每个实验一次在四个PCLS上进行延时成像。不要在实验中从同一PCLS捕获明场图像和荧光图像。暴露于强光下会大大削弱荧光染色的强度。请勿使用UV或DAPI滤光片（激发358 nm，发射463 nm）对PCLS进行实时成像，因为这会导致大量细胞死亡。 Zen2采集软件，蓝色版本用于明场和荧光实时成像。
    2. 在活细胞成像过程中，可以通过向图像介质中添加各种因子（例如细胞因子或小分子抑制剂）来操纵细胞动力学或其他行为。所产生的细胞反应可以实时记录。例如，我们最近在PCLS中添加了肌动蛋白细胞骨架修饰剂Blebbistatin和Cychachalasin-D，并使用这种live-PCLS成像技术评估了它们对细胞迁移的影响（Akram et al。，2019）。
    3. 为确保PCLS的生存力，请在每次延时实时成像实验后对PCLS进行生存力分析。对于未标记的PCLS上的明场成像，请进行活/死染色；对于双重染色的PCLS上的荧光成像，请进行MTT分析。
    4. 实验的持续时间p：从解剖小鼠到延时成像的开始需要7-8小时。
活细胞成像实验后在PCLS上进行细胞活力测定
1. MTT测定
  1. 将四个已经过实时成像的PCLS置于ibidi 24孔μ平板中，每孔1片。将四个相似大小的未成像PCLS放置在37°C，5％CO 2 的培养箱中，放置时间与传统24孔板中成像的切片相同，持续时间为1切片每孔加入无酚红SF-DMEM。选择四个相似大小的切片进行MTT分析，以在延时成像实验开始时确定细胞活力（图3）。
  2. 为了评估在实时成像（0小时控制）开始时细胞内的代谢活性，向每个孔中添加500μlSF-DMEM制成的10％MTT溶液（Stock Con。5 mg / ml）。
    注意：此MTT必须在开始实时成像之前完成（图3B）。
  3. 将PCLS在5％CO 2 存在下于37°C孵育1小时（图3C）。
  4. 从孔中取出MTT介质。
  5. 加入等体积的DMSO（500 µl），并在37°C下孵育10分钟，以溶解活细胞内形成的甲maz晶体。
  6. 从每个PCLS中取出200 µl洗脱的甲maz溶液，并将其放入96孔板的各个孔中（图3D）。
  7. 在570 nm下测量吸光度（OD），并使用酶标仪在690 nm下校正。
  8. 要评估延时PCLS内的代谢活性，请在延时成像完成后小心移开transwell。如果PCLS粘附在Transwell PET膜的下表面，请用移液管用温暖的HBSS冲洗，以使其脱离。
  9. 用温暖的HBSS清洗PCLS一次。
  10. 然后，以与上述初始时间点控制PCLS相同的方式，对在常规培养箱中培养的经过延时成像和未成像的PCLS进行MTT分析。
  11. 比较初始时间点（0 h）和延时后（成像和未成像的PCLS）OD值，以评估延时成像后的细胞活力（例如，参见参考Akram等人的图1j等，2019）。
    
    图3. MTT分析工作流程。 A.为MTT分析分配PCLS。 B.将PCLS镀在24孔板中，用MTT溶液处理。 C. PCLS用MTT溶液处理。 D.在96孔板的孔中洗脱甲maz。
2. 活/死分析
  1. 使用LIVE / DEAD ®活力/细胞毒性试剂盒在PCLS上进行细胞活力测定。
  2. 将四个PCLS放入ibidi 24孔μ板中进行延时成像，将四个PCLS放入24孔板中的常规培养箱中，以与不进行成像的延时相同的时间在500 µl酚红中培养。免费的SF-DMEM。将四个PCLS放入普通的24孔板中，进行活/死分析，以评估在初始时间点（0 h）的生存力。
  3. 对于未成像的切片的初始时间点（0 h），除去不含酚红的SF-DMEM，并将PCLS与2 µM Calcein AM和2 µM Ethidium homodimer-1（EthD-1）在250 µl温暖的HBSS中孵育30分钟在37°C下每分钟1 PCLS。
  4. 用HBSS洗涤PCLS两次，并在室温（RT）下用10％中性福尔马林缓冲液固定30分钟。用HBSS清洗两次，并将切片在成像前于4°C的HBSS中保存。
  5. 在延时成像结束时，按照MTT分析所述，从每个孔中移出transwell，并用HBSS清洗一次。然后，对经过延时成像和未成像的PCLS（即）进行活/死检测，如上所述，这些PCLS是在常规培养箱中培养与延时相同的持续时间。
  6. 作为死细胞的阳性对照，如上所述，用70％甲醇在室温下处理PCLS 30分钟，然后与钙黄绿素AM和EthD-1一起孵育。
  7. 用一滴ProLong ®黄金防褪色安装剂将PCLS安装在载玻片上，并盖上玻璃盖玻片。让封固剂在室温下放置1小时。
  8. 使用配备20x 0.8 NA空气物镜的Zeiss LSM-510共焦显微镜和ZEN 2009（黑色版）软件（或同等软件）捕获图像。
使用Icy软件进行细胞跟踪以进行细胞迁移定量
1. 打开Icy软件，然后导入EpCAM-FITC，SiR-DNA标记的原始延时图像序列文件。
2. 在FITC通道中，选择最佳聚焦平面即，它是图像序列z堆栈中的单个切片（图4B）。
3. 选择您希望进行电池跟踪的所需时间（例如 8-16小时）。
4. 使用“斑点检测和跟踪”工具（在“检测/跟踪”选项卡下）来检测EpCAM阳性上皮细胞，并在预定义的时间间隔内跟踪它们。
5. 要检测EpCAM-FITC阳性细胞，请在全帧图像上按以下步骤设置点检测器参数：（a）在深色背景上检测亮点选项；（b）以100％的灵敏度检测7和13像素点的大小；（c）过滤参数设置为100-200（进行相应调整以正确定位单个单元格），（d）在“输出”选项卡下启用游泳池选项。然后点击“开始检测”。检查检测器是否正在识别单个细胞（将用红色圆圈标记）。如有必要，可以通过更改像素大小和过滤参数来正确检测斑点。
6. 优化斑点检测后，单击“运行跟踪”以量化细胞迁移。仅量化细胞在X-Y轴上的迁移。
  注意：在此设置下3D X-Y-Z轴迁移量化无法正确进行。
7. 跟踪之后，通过在跟踪模式下倒回视频序列几次以检查每个图像字段中的每个单元迁移轨迹，以查看是否存在脱靶跟踪。如果存在任何偏离目标的跟踪，请取消选择这些跟踪。如果在不存在迁移单元的情况下错误生成了跟踪，则会发生脱目标跟踪（图4B）。
  注意：手动检查至关重要，因为在此设置下，Icy经常跟踪脱靶对象。对于单元格跟踪，请不要执行批处理，它在此设置下不起作用。通过逐个片段地逐个片段地跟踪每个PCLS的每个场的细胞，并通过跟踪每个视频序列的脱靶后筛选来调整检测参数。
8. 跟踪完成后，在“跟踪管理器”下的“跟踪处理器”选项中添加“运动分析器处理器”。使用真实单位选项（µm / s）从Track Manager进行迁移和速度量化（图4A）。
9. 将数据导出为Excel文件，并将单元格跟踪跟踪导出为图像文件（图4A和4C）。
  注意：有关生成的细胞跟踪数据和细胞迁移数据的示例，请参见参考文献Akram等人于2019年的图2 h，i，j。
  
  图4.通过Icy进行单元跟踪。 A.由Icy Track Manager生成的来自P3 PCLS的原始单元跟踪数据（显示的118个单元跟踪数据中的22个）。 B. Icy Track Manager跟踪的来自P3 PCLS的3个EpCAM-FITC阳性细胞的细胞迁移轨迹，由Icy Track Manager跟踪，显示3个细胞在16小时内从位置1迁移到位置2（原始图像放大）。红色箭头表示线性的“净细胞迁移”。 C.由Icy Track Manager从P3 PCLS归档的1个全帧视觉文件产生的细胞跟踪轨迹。
图像反卷积和电影生成
1. 使用惠更斯反卷积软件进行图像反卷积
  注意：由于宽视野成像的限制以及样品厚度引起的光衍射，通过宽视野显微镜从300 µm厚的PCLS上获得的原始荧光图像模糊且不适合单个细胞观察。反卷积软件使用一种算法来消除散焦光并产生更清晰的图像。（请参见参考Akram 等人，2019年的图1i和补充电影2）。
  1. 将延时荧光图像的广域z堆栈上传到惠更斯反卷积软件（步骤B2k）。每个z堆栈由每个样本11个独立的z切片组成，每个切片之间的间距为1 µm。
    注意：切片之间的最佳步距取决于物镜和解卷积软件的要求。对于用于40倍物镜的惠更斯反卷积软件，最佳步距不超过1 µm。对于其他解卷积软件包，此配置可能有所不同。优化阶跃间隙对于生成类似共焦的，反卷积的图像至关重要。
  2. 使用具有以下参数的内置自动CMLE算法对图像序列进行反卷积：（a）最大迭代次数50，（b）信噪比40，（c）质量阈值0.01，（d）迭代模式已优化。
  3. 将解卷积后的延时图像序列另存为TIFF z堆栈图像序列文件，以生成2D和3D延时视频。
2. 2D和3D以及明场视频生成
  1. 对于2D视频生成，将解卷积的延时z堆栈导入Icy软件（步骤E1c）。选择聚焦最佳的单个z平面，调整亮度和对比度，并裁剪感兴趣的区域。将文件另存为.avi文件格式。
  2. 对于3D视频重建，将解卷积的z堆栈延时文件导入NIS元素，并对齐以校正X-Y漂移（步骤E1c）。使用NIS-Elements的“体积视图”和“电影制作器”模块生成3D视频。
  3. 对于2D明场视频生成，请将原始图像z-tack文件导入斐济（ImageJ）软件。选择聚焦最佳的单个z平面，调整亮度和对比度。将文件另存为.avi视频文件。
    注意：明场图像不需要进行反卷积。
  4. 要在2D荧光和明场视频上添加注释，请在Microsoft PowerPoint（MS Office 2016）上将.avi视频文件作为视频文件插入，调整幻灯片大小以与视频窗口尺寸匹配，然后使用“文本和形状”工具对视频进行注释。将PowerPoint文件导出为高分辨率.mp4电影文件。（请参阅Akram et al。的补充电影，2019年）。

数据分析

量化细胞行为
1. 为了量化PCLS产后肺泡生成过程中的细胞事件，例如细胞聚集，凹陷，分隔和细胞扩展，请仔细检查屏幕上已解卷积的明场延时视频文件（使用40倍物镜）。记录视频文件在单个视野中观察到每个事件的次数。检查来自不同PCLS和至少3个独立实验的至少4个不同领域的视频。
2. 将数据表示为每种细胞行为的频率，作为每场对该行为观察的总数。（有关结果的示例，请参阅《结果》部分，Akram等人的第4-7页，，2019年）
定量细胞迁移
1. Icy中的跟踪管理器会从跟踪数据中生成一系列单元迁移信息，包括：净单元迁移，总位移，迁移速度（图4A）。
2. 为了量化和比较不同出生后年龄组（例如，P3，P7，P14和成人）之间的上皮细胞迁移或不同的治疗条件，确定（a）净细胞迁移和（b）净迁移距离在指定的时间段内的单个单元格。净细胞迁移是计算得出的平均值，以表示细胞在X-Y轴（起始点A到端点B）之间迁移了多少线性距离。来自每个场的细胞总数的迁移距离的平均值表示为平均净细胞迁移。（有关结果的示例，请参见Akram et al。中的图2 h，i，j，2019年）。
  注意：要进行迁移分析，请使用单元格跟踪记录中的“净位移”而不是“总位移”数据（图4A，黄色突出显示）。
3. 肺切片中存在两组上皮细胞：一组细胞是无柄的，另一组细胞是高度运动的。为了区分这两组，并在不同的出生年龄组和治疗条件之间进行比较，请确定各个细胞的净移动距离。对它们进行排名并以迁移排名距离的细胞百分比或比例表示（请参见Akram et al。，2019年的图2 h-j和图6 k-n）。

菜谱

HBSS / HEPES冰冷缓冲液
1个HBSS
1％HEPES 1 M
琼脂糖溶液
1.5克低熔点琼脂糖粉
100 ml HBSS / HEPES缓冲液
将琼脂糖溶于微波的HBSS / HEPES缓冲液中。准备30毫升琼脂糖以处理1肺
SF-DMEM
DMEM基础培养基
1％青霉素-链霉素
图像媒体
具有HEPES基础培养基的无酚红DMEM
1％青霉素-链霉素
EpCAM-FITC抗体1：500
PECAM抗体1：500或SiR-DNA 1：1,000
MTT工作解决方案
DMEM基础培养基
10％MTT储备溶液（在DMSO中储备浓度为5 mg / ml）
注意：储存溶液在-20°C的黑暗容器中保存时，可以稳定保存1年。
70％乙醇
70毫升无水乙醇
30毫升蒸馏水
70％甲醇
70毫升甲醇
30毫升PBS

致谢

该项目由Leverhulme Trust向CHD拨款（RPG-2015-226）资助。伦敦帝国学院的光学显微镜成像设备（FILM）由惠康基金会（Wellcome Trust）（拨款104931 / Z / 14 / Z）和BBSRC（拨款BB / L015129 / 1）的部分支持。该协议改编自Akram et al。，2019年发布的方法。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

所有动物的维护和程序均按照1986年《动物（科学程序）法》的要求进行。动物工作得到伦敦帝国学院南肯辛顿和圣玛丽AWERB委员会的批准。

参考文献

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