材料和试剂

板/插入物/试管/移液器
1. 6孔Falcon深孔板（Corning，目录号：355467）
2. Transwell 3414（直径为24 mm的刀片，孔径为3.0μm，康宁，目录号：3413）
3. 50 ml聚丙烯管（Fisher Scientific，目录号：05-539-8）
4. 25毫升聚苯乙烯移液器（Fisher Scientific，目录号13-678-11）
5. 10毫升聚苯乙烯移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11E）
6. 9英寸玻璃巴氏移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
7. 组织包埋盒（Fisher Scientific，目录号：B1000729BL）
8. 镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-132）
9. 75 cm 2 细胞培养瓶（Corning，目录号：430641U）
10. 100毫米培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
细胞
注意：使用刚解冻的液氮小瓶中的细胞。当细胞70-80％融合时进行次培养。开始培养一周后进行亚培养。
1. 成纤维细胞：3T3细胞系（ATCC，目录号：CRL-1658）
2. 上皮细胞：SCC15细胞系（ATCC，目录号：CRL-1623）
常用试剂
1. 10％正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
2. 100％，95％，70％和50％乙醇（EtOH）（Pharmo，目录号：111000200）
3. 30％H 2 O 2 （Sigma-Aldrich，目录号：H1009-100ML）
4. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，康宁，目录号：21-031-CV）
5. 海卫一X-100（西格玛奥德里奇，目录号：T8787）
6. 二甲苯（Fisher Scientific，目录号：X3P-1GAL）
7. 1 N氢氧化钠（NaOH，Sigma-Aldrich，目录号：S2770）
8. 二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，目录号：276855）
9. 0.05％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25300-054）
10. 20x柠檬酸盐缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：005000，请参见食谱）
11. 16％多聚甲醛（电子显微镜科学，目录号：15710，请参见食谱）
成纤维细胞培养基：DMEM-10％FBS-1％Pen / Strep
1. 不含丙酮酸盐的Dulbecco改良型Eagle Medium（DMEM）液体（高葡萄糖）（Gibco，目录号：11965-084）
2. 胎牛血清（FBS，Gibco，目录号：16000044）
3. 青霉素/链霉素（Pen / Strep，Gibco，目录号：15140-122）
上皮细胞培养基
KSFM与牛垂体提取物（BPE）（1管/每瓶），0.2 ng / ml人上皮生长因子（hEGF）（Invitrogen，目录号：17005-042），0.4 mM CaCl 2 （ Sigma-Aldrich，目录号：C-3306）和Pen / Strep（1：100）。
基质和器官型细胞培养基成分
1. I型胶原蛋白（器官发生，目录号：200/50）
2. Matrigel地下室膜基质（BD Biosciences，目录号：354234）
3. 新生小牛血清（HyClone，目录号：SH 3011802）
4. DMEM（-）（Gibco，目录号：11965-084）
5. 火腿F12（Gibco，货号：11765-054）
6. 10x EMEM（BioWhittaker，目录号：12-684F）
7. 7.5％碳酸氢钠（碳酸氢钠，BioWhittaker，目录号：17-613E）
8. FBS（Gibco，目录号：16000044）
9. L-谷氨酰胺（Cellgro，目录号：25-005CI）
10. 庆大霉素50 mg / ml（Cellgro，目录号：MT30-0005-CR）
11. ITES-胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺和硒（BioWhittaker，目录号：17839Z）
12. 氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888，请参见食谱）
13. O -磷酰基乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：P0503，请参见食谱）
14. 腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A9795，请参见食谱）
15. 孕酮（西格玛奥德里奇，目录号：P8783，请参见食谱）
16. Triiodothyronine（Sigma-Aldrich，目录号：T5516，请参见食谱）
17. 5-氟尿嘧啶，5-FU（Sigma-Aldrich，目录号：F6627，参见食谱）
18. 5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷，BrdU（Sigma-Aldrich，目录号：B4252，参见食谱）
所用微生物和微生物培养基
1. 白色念珠菌菌株SN425（参考菌株，源自SC5314，由加利福尼亚大学默塞德分校的Clarissa J. Nobile博士提供）。
2. YPD培养基和琼脂（请参阅食谱）
  1. 酵母提取物（西格玛奥德里奇，目录号：Y1625）
  2. 蛋白ept（BD，货号：211677）
  3. 右旋糖（J.T. Baker，目录号：1616-05）
  4. 琼脂（BD，货号：214530）
免疫荧光染色
1. 科普林染色罐（Thermo Scientific，目录号：19-4）
2. 大鼠抗BrdU单克隆抗体（Abcam，目录号：ab6326）
3. 山羊抗大鼠Alexa Fluor 555共轭二抗（Thermo Fisher science，目录号：A21434）
4. 山羊抗兔抗活性Caspase-3抗体（Abcam，目录号：Ab32042）
5. Alexa面粉568共轭二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11011）
6. 兔FITC缀合的抗白色念珠菌多克隆抗体（Meridian Life Science，目录号：B65411F）
7. Hoechst 33258（10毫克/毫升，赛默飞世尔科技，目录号：H3569）
8. 氟凝胶（电子显微镜科学，目录号：17895-11）

设备

荧光显微镜（Zeiss Axio Imager M1）
物镜（EC Plan-Neofluar 20x / 0.5）
组织培养培养箱（Thermo Forma，货号：3110）
生物安全柜（Thermo Forma，目录号：1284）
高压釜
轨道振荡器（新不伦瑞克科学公司，目录号：C1A88IC-C1）
离心机（Thermo Scientific，目录号：CL2）
血细胞计数器（Hausser Scientific，Fisher Scientific，目录号：0267110）

软件

AxioVision LE64（蔡司）

程序

器官型构建体（OTC）
先前已经描述了器官型口腔粘膜模型（Dongari-Bagtzoglou和Kashleva，2006a; Dongari-Bagtzoglou和Kashleva，2006b; Sobue等人，2016）。该协议最近根据Nakagawa及其同事的工作进行了修改（Nakagawa et al。，2015年）。器官型模型由人类永生化口腔角质形成细胞（鳞状细胞癌）SCC15和I型胶原基质包埋的小鼠成纤维细胞3T3组成。粘膜构建体大约需要2周的时间形成，从而形成非角化的多层鳞状上皮，然后将其暴露于化学治疗剂5-FU（图1）。
1. 提前一周：开始生长3T3细胞
  1. 在9 ml的DMEM中用50 ml管中的10％FBS 1％Pen / Strep解冻冷冻的小瓶。
  2. 在离心机中用670 x g 将试管离心3分钟。
  3. 从管中吸出上清液。
  4. 将10 ml含10％FBS 1％Pen / Strep的DMEM加入50 ml管中，轻轻重悬。
  5. 在75 cm 2 细胞培养瓶中接种10 ml细胞悬液，并在培养箱中于37°C和5％CO 2 孵育。
  6. 每2至3天更换培养基。
  7. 成长，直到在DMEM中用10％FBS和1％Pen / Strep达到汇合度为止。
2. 第0天：在4°C下解冻Matrigel过夜（一个小瓶装2.5 OTC板）。
3. 第1天：基质制备
  制备基质前15-30分钟：
  1. 将FBS，L-谷氨酰胺，10x EMEM和7.5％碳酸氢钠，Matrigel和I型胶原蛋白置于冰上。
  2. 将Transwell插入物放入6孔Falcon深孔板中的每个孔中。
  形成无细胞层
  1. 在冰上的50 ml管中按此顺序添加10x EMEM，FBS，L-谷氨酰胺，碳酸氢钠和I型胶原（表1）。
  2. 用25毫升移液器在50毫升冰试管中轻轻混合。
    注意：在制作无细胞层和细胞层时，将成分在冰上轻轻混合以避免气泡。
  3. 使用10毫升移液管倒入每个插件1毫升。
  4. 准备成纤维细胞和细胞层时，请留在组织培养罩内。
    
    表1.无细胞层培养基
  形成蜂窝层
  1. 从细胞培养瓶中吸出条件培养基。
  2. 用10 ml PBS和吸出PBS洗涤细胞。再重复一次。
  3. 向细胞培养瓶中加入1 ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA。轻拍烧瓶，并在培养箱中放置2分钟。
  4. 一旦细胞从烧瓶底部脱离，请加入9 ml DMEM和10％FBS 1％Pen / Strep，并用10 ml移液管将细胞悬浮。
  5. 收集细胞悬液并放入新的50 ml管中。
  6. 在离心机中用670 x g 将试管离心3分钟。
  7. 吸出上清液，并用10 ml DMEM和10％FBS 1％Pen / Strep重悬细胞沉淀。
  8. 用血球计数器计数细胞数并准备细胞悬液（6 x 10 5 / ml，每块板2 ml）。
  9. 按顺序将10x EMEM，FBS，L-谷氨酰胺，碳酸氢钠，I型胶原蛋白，基质胶和成纤维细胞添加到新的50 ml冰试管中（表2）。
  10. 使用25 ml移液器在50 ml冰试管中轻轻混合。
  注意：制作无细胞层和细胞层时，请在冰上轻轻混合各成分，以免产生气泡。
  1. 用10毫升移液器倒入每个插件3毫升。
  2. 在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育30-45分钟。
  3. 将DMEM-10％FBS-1％钢笔/链球菌加入：将10毫升倒入孔的底部，将2毫升倒入插入的孔中。
    
    表2.细胞层介质
  开始培养SCC15细胞
  1. 在50 ml管中的9 ml KSFM中，用BPE，0.2 ng / ml hEGF，0.4 mM和1％Pen / Strep解冻冷冻小瓶。
  2. 在室温下，在离心机中用670 x g 将试管离心3分钟。
  3. 从管中吸出上清液。
  4. 在50 ml试管中加入10 ml含BPE的KSFM，0.2 ng / ml hEGF，0.4 mM和1％Pen / Strep，然后轻轻重悬。
  5. 在75 cm 2 细胞培养瓶中接种10 ml细胞悬液，并在培养箱中于37°C和5％CO 2 孵育。
  6. 每2至3天更换培养基。
  7. 生长直至它们在BFM，0.2 ng / ml hEGF，0.4 mM和1％Pen / Strep的KSFM中达到80％汇合度。
4. 第2天：移出基质并将2 ml DMEM-10％FBS-1％Pen / Strep添加到插入物中。
  1. 用无菌的巴斯德玻璃移液管沿着插入物的内壁绕行基质（2-3次）。感觉到穿孔膜尖端的摩擦，但尽量不要刺穿。
    注意：矩阵将在接下来的几天内收缩。另外需要2毫升才能浸没OTC。
  2. 无需更换培养基。等待至少4天，然后再接种上皮细胞。
5. 第5天或以后（直到第7天）：播种上皮细胞
  1. 使DMEM（-）/ F12（表3）预饱和OTC矩阵。
  2. 从OTC板/插入物中取出旧介质。
    注意：建议轻柔抽吸以减少分散OTC的风险。
  3. 添加DMEM（-）/ F12。在底部孔中加入10毫升，在插入物中加入2毫升。
  4. 在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育1小时以平衡基质。
  5. 从SCC15细胞培养瓶中吸出条件培养基。
  6. 用10 ml PBS和吸出PBS洗涤细胞。再重复一次。
  7. 向细胞培养瓶中加入1 ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA。轻轻敲击烧瓶，并在培养箱（37°C，5％CO 2 ）中放置2分钟。
  8. 一旦细胞从烧瓶底部脱离，请加入9 ml含10％FBS 1％Pen / Strep的DMEM，并用10 ml移液管将细胞悬浮。
  9. 收集细胞悬液并放入新的50 ml管中。用血细胞计数器计数细胞数。
  10. 在室温下，用离心机在670 x g 中离心3分钟。
  11. 抽吸上清液，并用含BPE，0.2 ng / ml hEGF，0.4 mM和1％Pen / Strep的KSFM重悬细胞沉淀。需要根据步骤A5i中的计数细胞数来调整培养基的体积。
    注意：准备1 x 10 7 / ml上皮细胞悬液（每板300 µl）。每插入/孔接种5 x 10 5 上皮细胞。一个约80％融合的75 cm 2 烧瓶的产量约为2-3 x 10 6 SCC15细胞。
  12. 从OTC板/插入物中取出DMEM（-）/ F12。
  13. 通过将每孔50μl（5 x 10 5 ）细胞悬浮液添加到收缩基质表面的中心来接种上皮细胞。
  14. 在无培养基的组织培养箱中孵育2小时。
  15. 制作EP2媒体。混合表4中所示的所有细胞培养基成分，并储存在4°C下。
  16. 将EP2培养基添加到平板中-底部孔10 ml，插入件2 ml。并在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育平板。
    
    表3. DMEM / F12介质
    
    表4. EP2媒体
6. 第7天（或上皮细胞接种后2天）：使用EP2培养基更换培养基。
  1. 从OTC板/插入物中取出旧介质。
  2. 添加EP2介质：将10毫升添加到底部孔中，将2毫升添加到插入物中。
  3. 在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育平板。
7. 第9天（或上皮细胞播种后4天，气举）：用EP3培养基替换EP2培养基。
  1. 制作EP3媒体。混合表5中所示的所有细胞培养基成分，并储存在4°C下。
  2. 从插入物和底部孔中清除旧介质。
  3. 仅将7.5 ml EP3培养基添加到底部孔中。
  4. 在组织培养箱中（37°C，5％CO 2 ）孵育平板。
    
    表5. EP3媒体
8. 第11天（或上皮细胞接种后6天）：在第9天用EP3培养基更换培养基。
  1. 从插入件和底部孔中清除旧介质。
    注意：抬起空气后，将会看到进一步的明显收缩。在培养基更换期间可以更好地评估收缩。
  2. 仅将7.5 ml EP3培养基添加到底部孔中。
  3. 在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育平板。
9. 第13天（或上皮细胞播种后8天）：在第9天用EP3培养基更换培养基。
  1. 从插入物和底部孔中清除旧介质。
  2. 仅将7.5 ml EP3培养基添加到底部孔中。
  3. 在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育平板。
10. 第14天（或上皮细胞播种后9天）：现在，可以将三维粘膜器官型培养物用于5-FU处理，然后进行微生物接种。
5-FU处理器官型构建体并确认药物对细胞增殖的影响
1. 用10μM5-FU（每个孔2 ml）准备EP3培养基。
2. 将插入物转移到带有消毒镊子的新的6孔培养皿中。
3. 向基底外侧添加2 ml含5-FU的EP3介质，仅使粘膜下隔室暴露于药物。
4. 加入1 ml不含5-FU的新鲜细胞培养基至根尖黏膜表面。
5. 在根尖粘膜表面（100μl）和基底外侧（200μl）两侧添加100x浓缩BrdU（最终浓度：10μM）。
  注意：需要BrdU标记以确认5-FU的抗增殖作用。由于大多数上皮细胞在多层构建体形成后会缓慢增殖，因此应允许掺入至少16 h。
6. 在37°C和5％CO 2 下于Transwell板中孵育粘膜组织16小时。
5-FU处理过的器官型构建体的白色念珠菌感染
1. 将白色念珠菌（ C。albicans ）从YPD琼脂平板上生长的菌落中接种到10 ml YPD肉汤中，并在室温下在摇床上轻柔搅拌下进行有氧培养。
2. 与5-FU孵育16小时后，从transwell的两侧（顶端和基底外侧）移走所有细胞培养基。
3. 将EP3培养基添加到transwell的两侧，并在37°C下与5％CO 2 一起孵育1小时。总共重复3小时再重复两次，以从粘膜组织中冲洗掉5-FU。
  注意：在微生物接种之前必须去除5-FU，因为它对大多数生物都有毒。
4. 计算 C的单元格数目。用血细胞计数器测量白色念珠菌并制备细胞悬液（每孔在20 µl EP3培养基中加入10 6 真菌细胞）。
5. 从transwell板的两侧移去所有细胞培养基。
6. 添加 C的接种物。粘膜表面的白色念珠，在室温下放置45分钟。
  注意：将接种物轻轻放在粘膜表面的中央；为避免液体介质过度散布到侧面，应使用小体积（最大20μl），并确保将微生物接种在表面。
7. 仅向基底外侧添加1.5 ml EP3培养基，并在5％CO 2 下于37°C孵育2小时。
8. 在粘膜表面添加0.5 ml EP3培养基，并在5％CO 2 下于37°C孵育平板16小时。
  
  图1.口腔粘膜器官型模型
分析准备
1. 使用4％多聚甲醛将粘膜组织浸入新的6孔细胞培养板中进行固定。将培养板在4°C下放置2小时。
  注意：不要过度固定。它可能掩盖某些抗原。用4％多聚甲醛固定需要两个小时。
2. 室温下用4 ml PBS清洗粘膜组织两次，每次3分钟。
3. 从细胞培养插入物中取出粘膜组织，并将组织放入组织包埋和处理盒中。
4. 按顺序进行脱水和石蜡包埋步骤，并切成5μm厚的切片用于组织学和免疫荧光分析。
免疫荧光分析
1. 通过浸入二甲苯中脱蜡，在二甲苯中冲洗并在一系列乙醇洗涤中重新水化。
2. 在94°C下在Coplin广口瓶中用70 ml pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行抗原提取10分钟。
  注意：要使抗原与抗体的结合最大化，必须进行抗原回收步骤以揭露表位。
3. 将玻片在室温下放置20分钟。
4. 用70 ml PBS洗涤3分钟，再重复两次，在室温下在Coplin广口瓶中共3次。
5. 将玻片在室温下浸入70 ml 0.05％H 2 O 2 的PBS中30分钟。
6. 用70 ml PBS洗涤3分钟，再重复两次，在室温下在Coplin广口瓶中共3次。
7. 将玻片在300 µl 10％正常山羊血清，0.2％Triton X-100的PBS（封闭缓冲液）中于室温孵育30分钟。
8. 将玻片与300 µl抗BrdU抗体（封闭缓冲液中的1:40）或抗活性Caspase-3抗体（封闭缓冲液中的1：100）在4°C下孵育过夜。染色 C。白色念珠菌，与300 µl抗 C一起孵育。白色抗体（PBS中的1:20）在黑暗中于室温下放置2小时。
9. 用70 ml PBS洗涤3分钟，再重复两次，在室温下在Coplin广口瓶中共3次。
10. 对于BrdU和活性Caspase-3染色，在室温下黑暗中与300 µl二抗（BrdU和A11011的A21434，在PBS中为1：100）孵育1小时。
11. 用70 ml PBS洗涤3分钟，再重复两次，在室温下在Coplin广口瓶中共3次。
12. 在室温下于黑暗中用300 µl Hoescht 33258（在PBS中为1：5000）进行30分钟的反染。
13. 分别用70 ml PBS和蒸馏水冲洗3分钟，然后加入几滴含盖玻片的安装液Fluoro-Gel。
14. 可以在带有20倍物镜的荧光显微镜下观察切片，并可以使用AxioVision软件进行进一步分析。

数据分析

还可以在显微镜下在苏木精和曙红（H＆amp; E）染色的有机型构建体中观察到对5-FU处理的组织学响应。尽管未观察到多个上皮层的显着结构变化，但与对照相比，经5-FU处理的组织中上皮细胞间间隙和胞浆空泡的范围广泛扩大（图2A），与人类口腔粘膜炎的组织病理学特征一致（vonBültzingslöwen et al。，2001）。
为了揭示5-FU对细胞增殖的抑制作用，在5-FU处理期间用BrdU标记器官型构建体。在图2B中，BrdU掺入的免疫荧光染色显示未处理的组织在所有上皮层中均包含多个BrdU阳性细胞（S期细胞），与SCC15细胞的鳞癌表型一致。 5-FU处理几乎完全不存在BrdU阳性细胞，表明DNA合成不足（图2B）。
我们还检查了5-FU的治疗是否影响粘膜构建物中的细胞凋亡。活性Caspase-3的免疫荧光染色显示，经5-FU处理的组织中凋亡细胞的数量增加，而未处理的组织中观察到的上皮细胞凋亡最小（图2C）。总的来说，这些结果表明用5-FU处理器官型构建体16 h再现了口腔粘膜炎的主要组织病理学特征。

图2。器官型口腔粘膜模型的5-FU治疗。 A。 H＆amp; E染色显示5-FU处理导致上皮细胞间隙和细胞质空泡的扩大。 B.BrdU掺入的免疫荧光染色显示5-FU处理降低了DNA合成。 C.活性Caspase 3的免疫荧光染色显示5-FU处理增加了细胞凋亡（红色斑点，右图）。条= 50 µm。
我们检查了5-FU处理的粘膜结构是否促进真菌生长。首先将粘膜构建物暴露于5-FU中16小时，然后用白色念珠菌感染。 H＆amp; E染色显示，不论5-FU处理如何，白色念珠菌入侵粘膜结构（图3A）。 5-FU处理增加了粘膜下区域白色念珠菌的侵袭（图3A和3B），这与5-FU处理观察到的细胞间隙增加（图2A）和E-钙粘蛋白溶解（ Sobue et al。，2018年）。

图3. 白色念珠菌在5-FU治疗的器官型口腔粘膜模型上的感染。白色念珠菌在未处理的（Ca）或5-FU处理的（5-FU + Ca）粘膜构建体上生长的生物膜16小时。 A：H＆amp; E污点。 B：白色念珠菌的免疫荧光染色。条= 50 µm。

菜谱

氢化可的松（MW = 362.46 g / mol）
1. 将0.0269克氢化可的松溶于2.5毫升乙醇
2. 加入97.5 ml DMEM（0.74 mM）
3. 过滤灭菌，分装成等分试样（2毫升），然后在-20°C下储存
O -磷酰乙醇胺
1. 将0.705 g O -磷酰乙醇胺溶解在100 ml DMEM（50 mM）中
2. 过滤灭菌，分装成等分试样（2毫升），然后在-20°C下储存
腺嘌呤
1. 将1.55 g腺嘌呤溶于100 ml温暖的（37°C）ddH 2 O（0.09 M）中。
2. 过滤灭菌，分装成等分试样（2毫升），然后在-20°C下储存
孕酮
1. 将1 mg孕酮溶于1 ml乙醇
2. 加入14.7毫升ddH 2 O
3. 在100 ml DMEM（2.0μM）中稀释1ml。
4. 过滤灭菌，分装成等分试样（2毫升），然后在-20°C下储存
三碘甲状腺素
1. 将1 mg三碘甲状腺氨酸溶于1 ml 1 N NaOH中
2. 加入19毫升DMEM（-）
3. 在31 ml普通DMEM（1 nM）中稀释4μl
4. 过滤灭菌，分装成等分试样（2毫升），然后在-20°C下储存
YPD介质
1. 将5 g酵母提取物，10 g蛋白ept溶解在450 ml蒸馏水中
2. 将混合物和YP介质高压灭菌，以进行灭菌（121°C，15 lb /in²20分钟）
3. 将1份20％葡萄糖与9份YP培养基混合，制成YPD培养基
YPD琼脂
1. 将10克酵母提取物，20克蛋白ept，20克琼脂溶解在900毫升蒸馏水中
2. 对混合物进行高压灭菌，以进行灭菌（121°C，15 lb /in²20分钟）
3. 离开YPD琼脂冷却至55度
4. 向混合物中添加100 ml的20％葡萄糖制成YPD琼脂
5. 每个100毫升培养皿中的10毫升差
5-FU（10μM）
1. 储备溶液（50 mg / ml）：将50 mg 5-FU粉末溶于1 ml DMSO中。保持在4°C下3个月
2. 工作溶液（10μM）：在使用前应立即新鲜。用3830μl细胞培养基稀释10μl储备液，制成1 mM 5-FU。用20 ml细胞培养基稀释200μl1 mM 5-FU以制成10μM5-FU补充的细胞培养基
BrdU（1毫米）
1. 储备溶液（10 mg / ml）：在1 ml蒸馏水中溶解10 mg BrdU粉末。保持在-20°C
2. 工作溶液（1 mM）：在使用前立即变新鲜。用100μlEP3培养基稀释3.1μl储备液
柠檬酸盐缓冲液
1. 用95毫升蒸馏水稀释5毫升20倍浓缩柠檬酸盐缓冲液
2. 将缓冲液预热至95°C
4％PFA
1. 用30 ml PBS稀释10 ml 16％PFA
2. 一周内使用4％PFA，并将其保持在4°C

致谢

该协议是根据作者先前发表的研究开发的（Dongari-Bagtzoglou和Kashleva，2006a; Dongari-Bagtzoglou和Kashleva，2006b; Sobue et al。，2018）。资金由美国国立卫生研究院国家牙科和颅面研究所的公共卫生服务拨款DE013986和DE023632提供。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献

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