材料和试剂

注意：“ *”表示对实验成功至关重要的品牌。
材料

通用移液器吸头（USA Scientific TipOne TM ，目录号：1112-1770、1163-1730和1121-3812）
1.5 ml微量离心管（Thermo Scientific，目录号：02-682-002）
无菌血清移液器（Thermo Scientific，目录号：13-678-11D + E）
无菌14 ml培养管（Corning，Falcon TM ，货号：352059）
一次性聚苯乙烯分光光度计比色杯（Thermo Scientific，目录号：14-955-127）
锥形50毫升试管（Thermo Scientific，Nunc TM ，货号：12-565-270）
色谱柱（Bio-Rad，Econo-Pac TM ，目录号：7321010）
环架（Fisher，目录号：11-474-207）
可调式环形支架夹具（United Scientific Supplies，目录号：CLHD03）
截留分子量（MWCO）3 kDa过滤器（Sigma-Aldrich，Amicon Ultra TM ，目录号：UFC900324）
石英10.00毫米比色皿（Hellma Analytics，超微池，目录号105-250-15-40）
移液器（例如，Rainin Pipet-Lite TM XLS，目录号：17014407、17014411、17014412和17014413）
2 L玻璃锥形烧瓶（Corning，Pyrex TM ，货号：49802L）

试剂

抗生物素HRP抗体（杰克逊免疫研究，目录号：200-032-211）
链霉亲和素-HRP（Thermo Scientific，目录号：ENN100）
pET28b（+）_ CoilR [由MSU从OHSU提供，或由公开发行（Doh 等人，2018）]
BL21（DE3） E。大肠杆菌（新英格兰生物实验室，目录号：C2527I）
甘氨酸（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：BP381-500）
SOC增长媒体（新英格兰生物实验室，目录号：C2527I）
Miller Luria-Bertani（LB）琼脂（BD Difco TM ，目录号：244520）
Miller LB汤汁（BD Difco TM ，目录号：BD 244610）
2X YT（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP9743500）
硫酸卡那霉素（Thermo Scientific，Fisher Chemical，目录号：BP906-5）
IPTG（GoldBio，目录号：I2481C5）
* Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：30230）
* Pierce单体抗生物素蛋白琼脂糖（Thermo Scientific Pierce TM ，目录号：20228）
磷酸二氢钠无水（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：BP329-500）
尿素（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：U15 3）
Tris Base（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP152 5）
Tris HCl（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP153 1）
NaCl（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：BP358-1）
甘油（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP229-1）
咪唑（ACROS Organics，目录号：AC39674-1000）
考马斯亮蓝R-250（Thermo Scientific，目录号：20278）
甲醇（Thermo Scientific，Fisher Chemical，目录号：A412）
丙酮（Thermo Scientific，Fisher Chemical，目录号：A18）
氮气
硫酸铵（EMD Millipore，目录号：AX1385-1）
TCEP-HCl（GoldBio，目录号：TCEP10）
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Scientific，Molecular Probes TM ，货号：D1532）
TC级DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650-5X10ML）
*磺基-Cy5-马来酰亚胺（Lumiprobe，目录号：23380）
*生物素-PEG2-马来酰亚胺（Thermo Scientific，目录号：21901BID）
D-生物素（方舟制药，目录号：AK-44010）
Pierce BCA化验试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
12％Bis-Tris聚丙烯酰胺蛋白质凝胶（Bio-Rad Criterion TM XT，目录号：3450119）
MES（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP300-100）
NaH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S3139-250G）
丽春红（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：BP103-10）
NaOH（Thermo Scientific，Fisher BioReagents TM ，货号：BP359-500）
缓冲液B（Ni-NTA肽纯化）（请参见食谱）
缓冲液C（Ni-NTA肽纯化）（请参阅食谱）
缓冲液E（Ni-NTA肽纯化）（请参阅食谱）
MES运行缓冲区（请参阅食谱）
TCEP / SDS上染染料（5x）（请参阅配方）
考马斯染色（见食谱）
脱色溶液（请参阅食谱）
Tris缓冲盐水（TBS）（请参阅食谱）
TBS尿素（请参阅食谱）
0.5 M TCEP（请参阅食谱）
TBS尿素结合缓冲液（请参阅配方）
固态标记（SSL）缓冲液，pH 7.5（请参见食谱）
1 M DTT（请参阅食谱）
TBS尿素咪唑（请参阅食谱）
生物素缓冲液（请参阅食谱）
再生缓冲液（请参见配方）

设备

电子移液器（Eppendorf Easypet TM ，目录号：4430000018）
-20°C冷冻机（Thermo Scientific，Revco TM ，货号：13990206）
孵化器和振荡器（New Brunswick Excella TM E24，目录号：M1352-0010）
分光光度计（Eppendorf，Biophotometer Plus，目录号：6132）
烤肉店（Thermo Scientific，目录号：400110Q）
Sonifier（Branson Ultrasonics TM ，目录号：101063198R）
Sonifier 1/8英寸微尖端（Branson Ultrasonics TM ，目录号：22-309796）
冷冻离心机（Thermo Scientific，Sorvall Legend XTR离心机，目录号：75211731）
微量离心机（Eppendorf，目录号：022620304）
加热块（Fisher，Isotemp TM ，货号：88-860-022）
电泳池（Bio-Rad Criterion TM ，目录号：165-6001）
电源（Bio-Rad PowerPac TM HC，目录号：1645052）
酶标仪（Tecan Infinite M200 Pro，目录号：30050303）
（可选）荧光和蛋白质印迹成像仪（即，GE Healthcare Amersham TM Typhoon 5多模式扫描仪，目录号：29187191或Protein Simple，FluorChem Q）

程序

重组CoilR的表达
CoilR是通过在 E中重组表达而产生的。大肠杆菌。 CoilR的生长和纯化遵循在诱导表达下制备和纯化组氨酸标签肽的标准方案。有关详细的背景，协议和疑难解答，建议您参考 Qiaexpressionist 手册（Qiagen）（Morimoto-Tomita 等人，，2003年）。
1. 获取或生成编码CoilR肽的质粒（ i.e。，pET28b（+）_ CoilR）（Doh et al。，2018）。表1提供了由pET28b（+）_ CoilR表达的CoilR的氨基酸序列。
  注意：pET28b（+）_ CoilR质粒编码卡那霉素抗性。
2. 将质粒转化为 E。请按照NEB关于产品C2527的说明进行大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的处理。
  1. 将细胞置于LB /琼脂/卡那霉素（50μg/ ml）上，并在37°C下生长过夜。
  2. 挑选单个菌落，并在无菌的14 ml培养管中，在补充有卡那霉素（50μg/ ml）的LB中接种5 ml起始培养物（每5 ml培养物一个菌落）。
  3. 在振荡培养箱（225 rpm，37°C）中过夜生长。在观察到生长变化的情况下，我们会生长几种发酵剂文化（例如，一种文化生长缓慢）。
3. 使用一夜培养液在补充有卡那霉素（50μg/ ml）的2 L锥形瓶中接种（2.5 ml，1：200稀释）500 ml 2X YT无菌培养基。在225 rpm和37°C下生长，直到OD 600 达到0.8至1.0。
  1. 通过在分光光度计上的一次性比色皿中测量培养物的OD 600 来监控生长。
  2. 培养物达到此OD 600 大约需要2-4小时。
  3. 诱导前，取1 ml未诱导培养物样品，用于通过SDS-PAGE进行肽表达分析。
    1. 对于每个样品：在微量离心管中沉淀1 ml细菌培养物（10,000 x g ，2分钟）。
    2. 将沉淀重悬在缓冲液B中（配方1）。通过向颗粒中加入缓冲液B来标准化样品。使用等式：volume = OD 600 x 100μl缓冲液B。
    3. 在-20°C下冷冻。
4. 将培养箱/振荡器的温度降至25°C，并通过添加0.1 mM IPTG诱导2-4小时的肽表达。
  注意：如果在37°C下诱导，肽会降解，从而降低总产量。
  1. 在诱导过程中每小时采集1 ml样品，监控表达。按照步骤A3c中的描述进行归一化。
5. 通过在冷冻离心机（5,000 x g ，15分钟，4°C）中离心收集细胞。
  1. 丢弃上清液。
  2. 将沉淀的细菌转移到去皮重的50 ml锥形管中，以获得湿沉淀的重量。
  3. 储存沉淀（-20°C）。沉淀可以在-20°C下保存几个月。
  注意：如果需要，可以在肽表达的同一天进行细胞裂解（步骤B4）。但是，我们通常先将沉淀物冷冻，然后再进行第二天的纯化。
6. 通过SDS-PAGE分析肽表达。有关CoilR表达和纯化的代表性SDS-PAGE分析，请参见图4。
  1. 从诱导过程中收集的时间点解冻蛋白质样品。在缓冲液B存在下冻结和解冻将部分溶解细胞。
    注意：如果裂解不完全，则将样品冻融数次以破坏开孔细胞。
  2. 颗粒状不溶性碎片（10分钟，10,000 x g ）。
  3. 将澄清的裂解液转移到新的微量离心管中。
  4. 添加5x TCEP-SDS加载染料（配方5）。煮沸样品5分钟，离心沉淀，然后将10-15μl样品/孔上样至蛋白质凝胶。
  5. 通过SDS-PAGE分析肽表达。
    1. 我们建议在恒定电压（180 V）的MES运行缓冲液（配方4）中运行的BioRad Criterion Bis-Tris凝胶（12％； 26孔）上进行分析。
    2. 运行约35分钟，直至负载染料到达凝胶底部。
    3. 电泳后，在成像前用考马斯蓝染色（配方6）对蛋白凝胶染色，然后脱色（去污溶液，配方7）。
    4. CoilR将作为单体（7.5 kDa）和二聚体（15 kDa）在凝胶上迁移。
  图4. E中的肽表达。大肠杆菌和CoilR的变性纯化。从未诱导（UI）和诱导（2 h和4 h）细胞中收集样品，裂解并通过SDS-PAGE分离。在变性条件下，通过IMAC（ i.e。，在Ni-NTA树脂上）从澄清的裂解物中纯化CoilR。 CL =澄清的裂解物； FT =流通量（未结合分数）。洗涤1：用10 mM咪唑缓冲液B（pH 8）。洗涤2-4：用10 mM咪唑缓冲液C（pH 6.8）。洗脱1-3：缓冲液E（pH 4.3）。 CoilR肽（MW = 7502.35 Da）在〜6 kDa处以单体形式迁移，在〜14 kDa处以表观二聚体形式迁移（灰色箭头）。
通过IMAC纯化重组CoilR
1. 在肽纯化之前，测量并调节所有纯化缓冲液的pH。
  1. 缓冲液B：8 M尿素，100 mM NaH 2 PO 4 ，10 mM Tris-Cl，pH 8（配方1）。
  2. 缓冲液C：8 M尿素，100 mM NaH 2 PO 4 ，10 mM Tris-Cl，pH 6.5（配方2）。
  3. 缓冲液E：8 M尿素，100 mM NaH 2 PO 4 ，10 mM Tris-Cl，pH 4.5（配方3）。
注意：除非另有说明，否则所有步骤均应在冰上并使用预先冷却的缓冲液。
1. 解冻 E。冰上的大肠杆菌沉淀（来自步骤A5）。
2. 将沉淀重悬在缓冲液B中。每克湿重使用5 ml缓冲液B。
3. 通过在冰上超声处理来裂解。
  1. 我们使用配有1/8英寸Branson microtip的Branson超声仪来裂解细菌。我们以40％的占空比裂解细胞，输出：4.将样品脉冲处理30 s，然后在冰上静置1分钟，进行8个循环。
  2. 避免样品起泡，否则会造成蛋白质损失。
  3. 或者，可以通过其他方法（例如，冻融或French press）裂解细胞。
4. 通过在冷冻离心机（10,000 x g ，30分钟，4°C）中离心来澄清裂解物。
  注意：保留澄清的裂解液样品，以通过SDS-PAGE分析。
5. 将澄清的裂解物与Ni-NTA琼脂糖树脂（Qiagen）在烤肉架上于4°C孵育1小时。
  1. 缓冲液B应补充10-20 mM咪唑，以减少非特异性蛋白质与树脂的结合。
  2. 每1克颗粒（湿重）使用1毫升树脂。
  3. 或者，在4°C下过夜。
  注意：如果在流通和初始洗涤过程中观察到CoilR肽，则表明树脂超载。在粘合步骤中使用更多的树脂。
6. 将裂解物-树脂混合物上样到干净的多孔色谱柱上。
7. 收集流通。保存样品以通过SDS-PAGE分析。
8. 用5倍柱体积（CV）的缓冲液B洗涤树脂。
9. 用10-50 CV的缓冲液C洗涤树脂。
  1. CoilR肽将在约pH 6时洗脱。洗涤缓冲液应在pH 6.3和pH 7.0之间。
  2. 保存每个洗涤步骤中的样品以通过SDS-PAGE分析。
  3. 洗涤直至没有其他杂质洗脱。
10. 用缓冲液E洗脱CoilR肽。以5份2 CV洗脱。
  1. 大部分肽会在前3个洗脱液中洗脱。
  2. 如果检测到洗脱不完全，则以其他体积洗脱（请参见图4）。
11. 通过SDS-PAGE监控纯化。从澄清的裂解液，流通液，洗涤液和洗脱液中分析样品。
  1. 凝胶运行条件与步骤A6d-A6e中的条件相同。
12. 根据步骤B12的结果合并含有纯化肽的馏分。
13. 浓缩并使用3 kDa MWCO过滤器将纯化的CoilR交换到所需的缓冲液中。
  1. 我们建议使用MWCO过滤器更换为TBS尿素（配方9）。该缓冲液与硫醇-马来酰亚胺偶联反应兼容（程序C）。
  2. 将肽浓度保持在0.5 mg / ml和2 mg / ml之间，以避免溶解性问题。如果在肽溶液中观察到白色沉淀，则肽浓度过高。
14. 使用Pierce BCA分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）定量肽浓度。
  1. 也可以通过测量280 nm处的吸光度来估算蛋白质浓度。但是，CoilR的消光系数低（2,980 L·mol -1 ·cm -1 ）。因此，如果用BCA分析法测定浓度，则浓度会更准确。
  2. 包括重复和稀释以获得准确的浓度。
15. 将5-10％甘油添加到浓缩肽中，等分试样（200μl/管），然后冷冻（-20°C）。 CoilR肽可以冷冻保存几个月。
溶液中巯基-马来酰亚胺共轭产生CoilR探针肽
VIPER标记在表达CoilE标签蛋白的活细胞和固定细胞中具有特异性和高效性。但是，标记的质量与探针肽的质量直接相关。这是因为未标记的CoilR和标记的CoilR都会与带有CoilE标签的细胞蛋白二聚。我们建议使用> 50％标记有报告分子化学物质。
＆nbsp;我们发现硫醇-马来酰亚胺生物缀合反应的效率是可变的。因此，我们包括了两种修改CoilR的方法：过程C和过程D。我们都成功地使用了两种标记报告基因的CoilR，首选的方案取决于研究者。方法C描述了溶液中的常规硫醇-马来酰亚胺共轭反应；这是我们2018年出版物中描述的用于生成探针肽的方法（Doh et al。，2018）。该方法可用于连接荧光探针，例如磺基-花菁5（Cy5）-马来酰亚胺，或连接生物素化的CoilR。
1. 准备缓冲液，TCEP和反应性马来酰亚胺的储备溶液。如果已经准备好这些库存，请继续执行步骤C2。
  1. 我们建议在TBS尿素中贴标签（第9条）。该反应应在pH 7至pH 7.5之间的无硫醇缓冲液中进行。
  2. 使用前，请给缓冲液脱气。这可以通过使氮气流通过缓冲液鼓泡或通过真空脱气来完成。
  3. 准备0.5 M TCEP（配方10）。
2. 在无水DMSO中以20-100 mg / ml制备马来酰亚胺探针的浓缩原液。对于Cy5-马来酰亚胺或其他荧光团，请保护溶液避光。
  1. 为了限制反应中DMSO的量，更浓缩的原料是优选的。
  2. 库存可以在-20°C下保存。
  3. 马来酰亚胺会在水中水解，因此建议在DMSO中储存。
3. 在冰上解冻纯化的CoilR肽。浓缩的肽原液应放在TBS尿素中，并用氮气脱气。
  1. 如果肽被浓缩，反应将进行得更好。我们建议使用2 mg / ml（〜270 µM）的储备液。
  2. 典型的标记反应将包括50至200纳摩尔的CoilR肽。
  3. 如果该肽不在适当的缓冲液中，请在此时使用3 kDa MWCO过滤器转移至其他缓冲液中，然后脱气，然后继续进行步骤C4。
4. 通过添加10倍摩尔过量的TCEP来减少肽段。在50°C下孵育30分钟。
5. 通过加入至少20倍摩尔过量的马来酰亚胺探针来引发偶联反应。拌匀在烤肉店中于室温或4°C下孵育2小时。
  1. 对于荧光团标记，请保护反应避光。
6. 标记后，添加TBS尿素结合缓冲液（配方11）至总体积为15 ml。
  1. 保存粗反应混合物的样品，以通过SDS-PAGE分析。
7. 浓缩液和缓冲液在3 kDa MWCO过滤器上交换粗反应物，以除去未反应的探针。将缓冲液更换为与Ni-NTA纯化兼容的TBS尿素结合缓冲液。保存样品以通过SDS-PAGE分析。
  1. 对于CoilR-荧光团，请继续进行缓冲液更换，直到滤液变为无色或停止颜色变化，随后再进行缓冲液更换。然后继续执行过程E。
  2. 对于生物素化的CoilR，40 ml清洗液足以去除大部分游离的生物素部分。然后继续执行程序F。
使用基于固态的标记（SSL）通过硫醇-马来酰亚胺化学生成CoilR探针肽
2008年，Weiss及其同事描述了一种使用硫醇-马来酰亚胺化学修饰蛋白质的新方法（Kim et al。，2008）。在这项工作中，在荧光团偶联之前，先用硫酸铵沉淀蛋白质，然后用DTT还原。他们将这种方法命名为基于固态的标签（SSL）。这种方法的优点是操作简便，效率高（标记为70-90％）且硫醇特异性（Kim et al。，2008）。我们目前同时使用SSL和基于解决方案的标记来生成探针肽。程序D改编自Weiss和同事发表的方法（Kim et al。，2008）。
1. 准备SSL缓冲液（配方12）和还原剂（1 M DTT [配方13]和0.5 M TCEP）。如果已经准备好这些库存，请继续执行步骤D2。
2. 用冰冷的SSL缓冲液洗涤还原的肽浆，以去除DTT。
  1. 通过离心（4分钟，14,000 x g ，4°C）制浆。丢弃上清液。
  2. 加入1 ml SSL缓冲液，并将样品倒置几次。
  3. 重复步骤D6a和D6b 3-5次，以清除所有多余的DTT。
  4. 最后一个离心步骤后，将沉淀重悬于100 µl SSL缓冲液中。
  注意：任何残留的DTT都会与马来酰亚胺探针发生反应，因此多次洗涤肽沉淀至关重要。
3. 在固态还原肽上进行巯基-马来酰亚胺偶联。
  1. 向还原的肽中添加10至30倍摩尔过量的探针。颠倒管数次进行混合。
    1. 在无水DMSO中使用浓缩的马来酰亚胺探针（例如，Cy5-马来酰亚胺）（20-100 mg / ml）。
  2. 在烤肉架上于4°C混合反应15分钟。
  3. 加入5至10倍摩尔过量的TCEP。混合并继续在烤肉架上于4°C孵育45分钟。
    1. 对于荧光标记，请保护管避光。
    2. 反应中马来酰亚胺的量应高于TCEP的量，因为马来酰亚胺探针可能会与TCEP发生副反应（Kim et al。，2008）。
    3. 反应可以孵育过夜。
4. 标记后，我们建议用SSL Buffer洗涤反应混合物以除去过量的马来酰亚胺。
  1. 通过离心（4分钟，14,000 x g ，4°C）沉淀反应。丢弃上清液。
  2. 重悬于SSL缓冲液（1 ml）中。
  3. 离心沉淀（4分钟，14,000 x g ，4°C）。丢弃上清液。
5. 将步骤D8中的沉淀重悬在缓冲液B中。
  注意：
  1. 高浓度的EDTA将从程序E中使用的Ni-NTA琼脂糖中去除镍。添加足够的缓冲液B以确保EDTA的最终浓度小于1 mM。
  2. 保存粗反应混合物的样品，以进行SDS-PAGE分析。
6. 按照步骤E（对于荧光肽）或步骤F（对于生物素化肽）进行纯化。
CoilR-荧光团探针肽的纯化
该程序从荧光团标记的CoilR（即，CoilR-Cy5）中去除了过量的未反应的游离染料，同时还纯化了肽。本节还介绍了用于定量肽段荧光团标记的方法。
注意：除非另有说明，否则应保护肽避光并保持在冰上。
1. 在4°C下将标记的CoilR肽与Ni-NTA琼脂糖树脂结合1小时。
  1. 对于典型的标记反应（50-200 nmol CoilR），我们建议使用0.5 ml Ni-NTA树脂并在大体积（20-40 ml）的TBS尿素结合缓冲液中结合。
2. 将裂解物-树脂混合物上样到干净的多孔色谱柱上。
3. 收集流通液并保存样品以通过SDS-PAGE分析。
4. 用20柱体积（CV）的TBS尿素结合缓冲液洗涤树脂。
  1. 继续洗涤直至级分无色。
  2. 保存洗涤液以通过SDS-PAGE分析。
5. 可选步骤：用补充有20％乙醇的10 CV TBS尿素结合缓冲液洗涤树脂。添加乙醇可以帮助去除游离的荧光团。
6. 用5-10 CV的TBS尿素咪唑洗脱CoilR肽（方案14）。
  1. Cy5标记的肽级分应为深蓝色。
  2. 继续洗脱直到馏分几乎无色，然后再进行下一步。
  3. 或者，在低pH的缓冲液（例如，缓冲液E）中洗脱。
7. 按照步骤A6d-A6e，通过SDS-PAGE分析纯化。有关代表性分析，请参见图5。
  1. 分析粗反应，纯化样品（流通，洗涤，洗脱）和浓缩洗脱。
  2. 将凝胶在荧光扫描仪上成像，以检测标记的肽。图5A提供了使用Protein Simple成像系统获得的代表性2色扫描图。另外，我们建议使用适当的检测设置（即，Cy5：例如：635 nm，em：670/30 nm）在GE Amersham TM Typhoon多模扫描仪上成像。
  3. 荧光成像后，用考马斯染色对蛋白凝胶染色，脱色并成像以检测总蛋白。
8. 使用3 kDa MWCO过滤器浓缩和缓冲液将含有标记肽的洗脱液交换到所选的存储缓冲液中。
  注意：我们建议将肽储存在TBS尿素中。
9. 确定标记的程度（每摩尔蛋白质的荧光团摩尔数）。我们建议遵循Thermo Scientific发布的协议[技术提示＃31：计算染料：蛋白质（F / P）摩尔比]（参考文献22）。
  1. 通过测量最大荧光团吸光度（Abs max ）的吸收并使用公布的消光系数（ε FL ）（表2），确定溶液中的荧光团数量。
  2. 通过测量280 nm的吸光度确定溶液中肽的量。
    1. 荧光团也将在280 nm处吸收，因此必须使用校正因子（CF）（例如，对于Cy5 = 0.04，CF）。
    2. CoilR肽的消光系数（ε）为2,980 L·mol -1 ·cm -1 （ www.expasy.org ）。
  3. 使用以下公式计算肽的摩尔浓度和标记程度：
  4. 我们提供以下建议：
    1. 吸光度读数仅在分光光度计的线性范围内（0.1到1.0之间）是准确的。
    2. 我们建议准备几种肽的稀释液并复制以获得更准确的结果。
    3. 我们在带有比色皿端口的Tecan Infinite M200 Pro上的石英比色皿中测量了吸光度。
      
      图5.通过SDS-PAGE分析CoilR探针肽。将CoilR标记为磺基花菁3（CoilR-Cy3； 60％标记），AlexaFluor-488（CoilR-AF488； 45％标记），或BODIPY-FL（CoilR-BDPY-FL：标记为40％）。在Ni-NTA树脂上纯化粗反应物（CR）以除去游离染料。通过SDS-PAGE解析样品，并且扫描凝胶的绿色（例如：488nm，em：525 / 50nm）和红色（例如：532nm，em：570 / 20nm）荧光（A）。随后用考马斯（B）对同一凝胶进行总蛋白染色。 CR =稀释的粗反应（柱前），FT =流通液（未结合的蛋白质/荧光团），W =洗涤液（TBS尿素结合缓冲液），E =洗脱液（TBS尿素咪唑）。包括未反应的CoilR肽（15和30 µg）作为参考，并且CoilR用灰色箭头指示。
      
      表2.用Cy5-maleimide量化CoilR标记的值‡
      
      ‡在Lumiprobe网站上提供的值： www.lumiprobe.com 。
10. 将荧光团标记的肽存储在5-10％的甘油中。
  1. 分装（100μl/管）并冷冻（-20°C）。该肽可以保存（冷冻并避光）几个月。
  2. 为了实验方便，最终库存应在1-50μM之间。
  3. 为了最大程度地减少冻融循环，可以将已融化的等分试样分成较小的单次使用体积（例如，，10μl）并重新冷冻。
生物素化探针肽（CoilR-生物素）的纯化
此过程旨在纯化使用过程C或D生物素化的CoilR肽。有关基于亲和素的亲和色谱法和故障排除指南的概述，请参阅Pierce ®亲和力Avidin琼脂糖单体说明，在线可得。（参考文献18）。从单体亲和素树脂纯化和洗脱后，假定CoilR-生物素肽已100％被生物素化。
1. 准备缓冲液并平衡至室温。
  1. TBS：20 mM Tris，150 mM NaCl pH 7（配方8）。
  2. 生物素缓冲液：pH 7.4的DPBS中2 mM生物素（配方15）。
  3. 再生缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.8（配方16）。
2. 将Pierce Monomeric亲和素琼脂糖添加到干净的多孔色谱柱中并沥干。
  1. 对于100 nmole的CoilR肽，请使用1 ml树脂。
3. 阻止树脂上不可逆的生物素结合位点：
  1. 用5倍柱体积（CV）的TBS洗涤。
  2. 用5 CV的生物素缓冲液洗涤，以阻断任何不可逆的生物素结合位点。
  3. 用5 CV的再生缓冲液洗涤，以去除与树脂上可逆生物素结合位点结合的生物素。
  4. 用5 CV的TBS洗涤以重新平衡色谱柱。
  5. 塞住色谱柱以防止流动；现在就可以使用树脂了。
4. 在TBS中将生物素化的肽样品稀释至大约5 ml。应用于列。
5. 将样品与树脂在室温下孵育30分钟。
6. 拔下色谱柱并收集流出物。保存流通液以及所有后续洗涤和洗脱步骤的样品，以通过SDS-PAGE分析。
7. 用5 CV的TBS洗涤树脂两次。
8. 在5 CV的生物素缓冲液中洗脱生物素化的蛋白质。收集1毫升馏分。
9. 在5 CV的再生缓冲液中洗脱。收集1毫升馏分。包括此洗脱步骤，因为某些肽不会被过量的生物素洗脱。
10. 再生树脂。用5 CV的再生缓冲液洗涤。收集并分析以确保该洗涤液不含生物素化肽。
11. 通过SDS-PAGE分析所有馏分（请参阅步骤A6d-A6e）。
  注意：根据我们的经验，CoilR-生物素在生物素缓冲液和再生缓冲液中均被洗脱，而在生物素缓冲液中则洗脱更多。
12. 通过蛋白质印迹法（使用您的首选方法）分析所有级分，以检测生物素化的蛋白质。例如，我们使用抗生物素HRP抗体（杰克逊免疫研究）或链霉亲和素-HRP（Thermo Scientific）检测生物素化蛋白。
13. 根据步骤F11-F12中的分析合并含有生物素化肽的馏分。
14. 使用3 kDa MWCO过滤器浓缩生物素化肽并将其交换为所需的缓冲液。
  1. 我们建议换成TBS尿素。
  2. 保持肽浓度在0.5 mg / ml和2 mg / ml之间。
15. 使用Pierce BCA分析试剂盒定量纯化的蛋白质产量。
  1. 粗反应将包含未修饰的生物素化肽。因此，在基于单抗生物素蛋白的纯化后回收的CoilR-生物素的量预计将小于反应中使用的CoilR的量。
  2. 粗反应混合物中肽的生物素化率（％）可以通过标记反应中用单亲和素纯化得到的CoilR-生物素的纳摩尔除以CoilR的纳摩尔来估算。
  3. 一旦未纯化的CoilR-生物素未反应的肽（即，CoilR）不会与树脂结合，则认为通过该方法获得的CoilR-生物素已100％被生物素化。
16. 将生物素标记的肽储存在5-10％的甘油中。
  1. 分装（100μl/管）并冷冻（-20°C）。该肽可以保存几个月。
  2. 为了实验方便，最终库存应在1μM和50μM之间。
  3. 为了最大程度地减少冻融循环，可以将已融化的等分试样分成较小的单次使用体积（例如，，10μl）并重新冷冻。

菜谱

注意：

除非另有说明，否则缓冲液是在高压灭菌的去离子水中制成的。
Tris缓冲液的pH值随温度变化。
使用含尿素的缓冲液（缓冲液B，缓冲液C和缓冲液E）的pH值应在使用前立即进行检查和调整。
DPBS的pH为7.0。

缓冲液B（Ni-NTA肽纯化）
8 M尿素
100 mM NaH 2 PO 4
10毫米Tris-Cl pH 8.0
缓冲液C（Ni-NTA肽纯化）
8 M尿素
100 mM NaH 2 PO 4
10毫米Tris-Cl pH 6.5
缓冲液E（Ni-NTA肽纯化）
8 M尿素
100 mM NaH 2 PO 4
10 mM Tris-Cl pH 4.5
MES运行缓冲区
50 mM MES
50 mM Tris pH 7.3
1毫米EDTA
0.1％（w / v）的SDS
TCEP / SDS上染染料（5x）
300 mM Tris pH 6.8
50毫米TCEP
10％（w / v）SDS
65％（v / v）甘油
0.025％（v / v）丽春红
考马斯染色
45％（v / v）甲醇
0.3％（w / v）考马斯亮蓝R-250
10％v / v乙酸
脱色溶液
20％（v / v）甲醇
10％（v / v）乙酸
Tris缓冲盐水（TBS）
20 mM Tris pH 7.4
150 mM氯化钠
TBS尿素
20 mM Tris pH 7.4
150 mM氯化钠
2 M尿素
0.5 M TCEP
溶解TCEP，然后通过添加10 M NaOH将pH调节至7
注意：TCEP的一次性使用等分试样可以在-20°C下保存。
TBS尿素结合缓冲液
20 mM Tris pH 8.0
150 mM氯化钠
2 M尿素
固态标记（SSL）缓冲液，pH 7.5
125 mM NaH 2 PO 4
200 mM氯化钠
1.25 mM EDTA
4.6 M硫酸铵（75％饱和溶液）
1 M DTT
将DTT溶于高压灭菌的去离子水中
注意：可以准备一次性使用的等分试样，并在-20°C下保存。
TBS尿素咪唑
20 mM Tris pH 7.4
150 mM氯化钠
2 M尿素
500 mM咪唑
生物素缓冲液
DPBS中2 mM生物素
再生缓冲液
0.1 M甘氨酸
pH值2.8

致谢

KEB非常感谢OHSU医学院和国立卫生研究院（R01 GM122854）的支持。 JKD由波特兰大学科学家成就奖章（ARCS）资助。本文描述的协议最初在两个现有出版物中进行了描述（Zane 等人，，2017; Doh 等人，，2018）。我们感谢OHSU的同事，特别是Drs。 Hannah Zane和Jonathan White，为他们对VIP标签的开发做出了贡献。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。 VIP技术正在申请专利（PCT / US17 / 60609）。

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