图1.用于实施VIPER标记细胞蛋白的决策树。程序以其出现的出版物的颜色进行编码。出版物1：Doh等人，2019a;出版物2：Doh等人，2019b;出版物3：本文。

材料和试剂

注意：“ *”表示对实验成功至关重要的品牌。
材料

铝盖玻片架
注意：我们使用了定制的机加工铝板，该板有一个用于22 x 22 mm盖玻片的孔。该板的尺寸为76 x 26 x 1.5毫米，中间有一个直径为12毫米的孔。
*氧化铟锡22 x 22 mm盖玻片（2SPI，目录号：06486-AB）
磁带（Scotch ® Magic TM 磁带）
干燥柜（Thermo Scientific Nalgene TM ，货号：53170070）
干燥剂（Drierite TM ，目录号：D1085）
Kimwipes（Kimtech，目录号：34120）
*导电银漆“ Leitsilber”（Ted Pella，目录号：16035）
* SEM针脚样品支架（Ted Pella，目录号：16144）
*碳纤维线（Leica，货号：16771511116）
LDPE 500毫升挤压洗瓶（Thermo Scientific，目录号：24010500）
转移灯泡移液器（VWR，目录号：16001-182）

试剂

CHO TRVb细胞（由纽约州伊萨卡市康奈尔大学的蒂莫西·麦格劳教授提供）（麦格劳 et al。，1987年）
汉姆（Ham）的F-12培养基（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：11765062）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，不含钙或镁； DPBS（Gibco TM ，目录号：14190144）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：25200056）
胎牛血清（FBS）（GE，Hyclone TM ，货号：SH30910.03）
* Lipofectamine TM 2000（Thermo Scientific，目录号：11668019）
Opti-MEM（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：31985070）
*链霉亲和素-Qdot TM 655偶联物（Invitrogen，目录号：Q10121MP）
无水乙醇（Decon Labs，目录号：2716）
20％（v / v）多聚甲醛（PFA）的库存（电子显微镜科学，目录号：15713S）
活细胞块解决方案（请参阅食谱）
Qdot Block解决方案（请参阅食谱）
Qdot标签解决方案（请参阅食谱）

设备

血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1475）
CO 2 加湿培养箱（New Brunswick Galaxy 170S，目录号：C0170S-120-0000）
组织培养罩（Thermo Scientific，型号：1300 Series A2）
组织培养倒置光学显微镜（卡尔·蔡司，蔡司·普里莫弗特）
细镊子（Ted Pella Dumostar Biology，目录号：525-PS）
镶有钻石的抄写员（Ted Pella，目录号：54468）
不锈钢防皱垫圈（Tousimis垫圈，目录号：8767-01）
轨道振荡器（Stovall Belly Dancer TM ，目录号：BDRAA1158）
旋转盘共聚焦荧光显微镜（FEI CorrSight TM ）
63x物镜（卡尔·蔡司，1.4 NA复消色差M27，目录号420780-9900-000）
5倍物镜（卡尔·蔡司，0.16 NA EC Plan-Neofluar M27，目录号：420330-9901-000）
扫描电子显微镜（FEI Helios Nanolab TM 660 SEM）
临界点干燥机（Leica EM CPD300）
高真空闪光碳涂层机（Leica EM ACE600）

软件

FEI MAPS（FEI版本2.1.38.1199和版本3.0）
FEI Helios Nanolab TM xT显微镜控制（FEI版本5.5.1和版本10.1.7）
Matlab（Mathworks软件版本R2017b）

程序

转染细胞系以表达VIPER标签的蛋白
该协议描述了转染组织培养细胞系以表达带有VIPER标签的跨膜受体（即，TfR1-CoilE）的过程。我们之所以使用CHO TRVb细胞系，是因为它不表达TfR1或转铁蛋白受体2（McGraw等，1987）。转染后，所有TfR1受体将编码胞外域的C末端CoilE标签。
＆nbsp;我们建议优化每个细胞系的接种密度和转染条件。有关使用Lipofectamine 2000进行转染的更多信息，请参见Thermo Fisher方案发布号MAN0007824 Rev 1.0（参考23）。在我们的方案中，我们建议第1天传代细胞，第2天转染细胞，第3天VIPER标记细胞（请参阅过程B）。
协议A的建议：
1. 使用活细胞时，使用无菌技术并在组织培养（层流）通风橱中工作。
2. 当用编码CoilE标签的蛋白（例如，pcDNA3.1_TfR1-CoilE）的载体转染细胞时，我们还建议使用未标记的蛋白转染细胞以进行比较标记特异性（例如，pcDNA3.1_TfR1）。未转染的细胞还可以作为标记特异性的对照。
3. TfR1-CoilE的序列可以在序列中找到（补充文件）。
1. 第1天：传代细胞并铺在氧化铟锡（ITO）盖玻片上
  1. 开始之前，请在组织培养显微镜上目视检查细胞，以确认细胞是否粘附，健康且融合度为80-90％。
  2. 将单个22 x 22 mm ITO盖玻片放入无菌6孔聚苯乙烯组织培养板的每个孔中。
    1. ITO盖玻片装在一个小盒子中，导电侧朝上。将盖玻片转移到6孔板上，而不要翻转盖玻片。在转染，标记和加工过程中保持此方向。
    2. 为了将细胞粘附到玻璃上，可能需要用聚-L-赖氨酸或其他细胞表面处理对盖玻片进行预涂。 CHO TRVb细胞无需额外支持即可粘附在玻璃上。
  3. 每孔播种1 x 10 6 细胞（用于CHO TRVb）。在含5％FBS的Ham's F12培养基中培养细胞。介质中不要包括抗生素。
    1. 对于其他细胞系，播种的密度应能在24小时后产生80-90％的融合度。
2. 将细胞在潮湿的组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中孵育过夜。
3. 第2天：准备转染混合物
  1. 将载体DNA稀释到Opti-MEM中：
    1. 对于6孔板，在每孔100μlOpti-MEM中使用2 µg DNA。
    2. DNA质量对于高转染效率至关重要。通过紫外光谱法定量DNA质量，并验证260/280 nm比率在1.8到2.0之间。
    3. 使DNA的体积小于转染混合物总体积的10％。
  2. 将Lipofectamine 2000稀释到Opti-MEM中，并孵育5分钟：对于6孔板，每孔100μlOpti-MEM中使用4 µg Lipofectamine2000。
  3. 合并等体积的Lipofectamine2000和DNA溶液，并通过移液混合。 DNA与Lipofectamine2000的最终比率为1：2。将混合物在室温下孵育至少30分钟。
4. 转染细胞：
  1. 从细胞中吸出培养基。
  2. 将Opti-MEM添加到孔中。对于6孔培养皿，每孔使用800μl。
  3. 向每个孔中添加200μl转染混合物（1：5稀释）。每个孔中的液体总量应为1 ml。
  4. 通过上下移液或摇动板轻轻混合溶液。
  5. 将转染混合物中的细胞在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中培养4小时。
    1. 建议使用此时间范围转染CHO TRVb细胞。
    2. 通过在TC显微镜上观察来监控细胞。转染过程中细胞大小和形状应保持不变。如果细胞收缩或分离，则调整转染条件。
  6. 抽吸以除去转染培养基，并用完全培养基（例如，含FBS的培养基）洗涤一次。
  7. 添加完整的培养基，并在组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）中生长至少24小时。转染后24至48小时内即可使用细胞。
在ITO盖玻片上用Qdot标记VIPER标记的受体
方案B描述了一种用生物素化的探针肽（CoilR-生物素）标记跨膜受体（TfR1-CoilE）的方法。随后用抗生蛋白链菌素-Qdot655缀合物检测生物素化的受体。生物素化的受体可以用其他抗生蛋白链菌素缀合物标记，例如抗生蛋白链菌素-金。我们用TfR1的配体荧光转铁蛋白（Tf-AF488）复染，以便快速鉴定转染的细胞。最后，将活细胞冷却至4°C，以在标记细胞表面受体期间暂停内吞作用。
1. 第3天：在组织培养显微镜上目视检查每个孔，以确认转染的细胞粘附，健康且融合80-90％。
2. 除去培养基，并向每个孔中加入500μl活细胞阻断液（配方1）。返回组织培养箱30分钟。
  1. 使用移液器或转移球形移液器从孔中吸出培养基，注意始终留有足够的培养基以保持细胞和盖玻片的水分。
3. 当细胞处于活细胞阻断溶液中时，准备CoilR标记溶液。
  1. 将CoilR-生物素探针肽和50μg/ ml Tf-AF488稀释到不含血清的预冷Ham's F12培养基中。每孔准备500μl标记溶液。
  2. 我们建议测试一定范围的探针肽浓度，以获得最佳的信噪比（例如，100 nM至500 nM）。对于表达TfR1-CoilE的CHO TRVb细胞，我们建议在Ham的F12培养基中使用100 nM CoilR-生物素。
  3. 此时可以添加其他标记试剂。
  注意：Qdot与Hoechst 33342具有光谱重叠，因此在这些研究中我们不使用这种核染色。
4. 从每个孔中除去封闭液1。
5. 向每个孔中添加500μl标记溶液。标记细胞在4°C下30分钟，避光。
  1. 标记是在4°C的预冷培养基中进行的，以限制VIPER标记的受体的内吞作用。受体在细胞表面的可及性对于随后用链霉亲和素-Qdots进行的CoilR-生物素的SEM检测至关重要。
6. 用冰冷的DPBS清洗每孔三遍。
7. 在DPBS中使用冰冷的4％v / v PFA固定细胞。将细胞在固定液中于4°C孵育15分钟。
8. 用DPBS清洗每个孔两次，以去除固定剂。
9. 在室温下用800μlQdot封闭溶液（配方2）封闭ITO盖玻片1小时。
10. 当单元格处于Qdot Block Solution中时，准备Qdot标记溶液：
  1. Qdot由Invitrogen提供，为1μM储备液。使用前，将链霉亲和素-Qdot655共轭物离心分离（17,000 x g ，5分钟）以从溶液中去除聚集的Qdot。
  2. 应测试一定范围的浓度以确保最佳标记。
  3. 我们在Qdot标记溶液（配方3）中使用了10 nM的链霉亲和素-Qdot655用于转染了TfR1-CoilE的CHO TRVb。
  4. 每孔准备500μl标记溶液（例如，用于6个样品的3 ml溶液）。
11. 从每个孔中删除Qdot Block Solution。
12. 向每个孔中加入500μl的链霉亲和素-Qdot655标记溶液，并在室温下标记1小时。在此步骤中保护样品避光。
13. Qdot标记后，用DPBS洗涤3次。
14. 在处理CLEM的样品之前，通过共聚焦FM（例如，使用FEI CorrSight TM ）对ITO盖玻片进行图像和地图绘制，然后再处理CLEM（过程C和D）的样品。
安装用于CLEM成像的ITO盖玻片
此过程描述了处理过程B中准备的ITO盖玻片的方法。此过程使用定制加工的铝玻片在成像过程中固定ITO盖玻片。这张幻灯片是由Ingo Gestmann（FEI）创建的。幻灯片的尺寸为76 x 26 x 1.5毫米。该孔的直径为12毫米，与22 x 22毫米的ITO盖玻片兼容。可能有商业上可用的盖玻片支架，但我们尚未测试任何盖玻片支架。定制加工的铝滑片（图2）在一侧（B面）有一块用环氧树脂粘合的盖玻片。另一侧保持打开状态，带有圆形腔室（A侧）。

图2.铝盖玻片支架图。 A面显示一个圆形孔。 B面有一块矩形的盖玻片，用胶水覆盖圆形孔。这种设置允许用户通过将ITO盖玻片粘贴到A面来创建一个封闭的缓冲腔。
1. 使用菱形划痕，在ITO盖玻片的中央划一个小“ F”，以创建基准标记。进行大约1厘米长的笔触。基准点较大时，在SEM后期会产生更好的相关性，但通过铝制滑板上的孔仍应完全可见（请参见图3）。在此过程中，可以用细镊子将盖玻片压下以使其稳定。
  1. 对于多个样品，请使用划线员进行其他标记，以快速区分样品。一个示例方案是：
  1. 示例1：仅“ F”；没有缺口，
  2. 范例2：在“ F”以下切迹，
  3. 范例3：在“ F”上方切入，
  4. 样本4：在“ F”左侧的缺口，
  5. 样本5：在“ F”右侧的缺口，
  6. 样本6：在“ F”上方和下方划痕。
  图3.在22 x 22 mm ITO盖玻片的中心刻有一个“ F”。请注意，相对于盖玻片的尺寸，“ F”的尺寸。
2. 将铝玻片放在A面朝上的实验室工作台上。
3. 滴加DPBS到圆形腔体中，直到腔体充满为止。再添加一滴以创建凸起的半月形（图4）。
  
  图4.盖玻片架的圆形腔体装有缓冲液
4. 使用细镊子从6孔板上取下标记的ITO盖玻片。
5. 让过量的DPBS滴落，但不要让盖玻片变干。下一步应将ITO盖玻片弄湿。
6. 将湿ITO盖玻片的一侧边缘靠着铝盖玻片架，电池朝下朝向A面（图5）。
  
  图5.将ITO盖玻片放置在铝盖玻片支架上。 ITO盖玻片的侧面与附着的电池面向腔。
7. 使用镊子将ITO盖玻片小心地放到A面。ITO盖玻片应漂浮在薄薄的流体层上（图6）。迅速执行此操作，以避免将空气滞留在腔室内。
  1. ITO盖玻片和玻片B侧的玻璃之间的腔室内不应有气泡。气泡会使细胞干燥。如果在翻转玻片时不接触ITO盖玻片，则允许有小气泡。
  2. 如果ITO盖玻片下面有大气泡，请使用镊子将ITO盖玻片以较小的角度提起，然后再将ITO盖玻片再次放到DPBS上。
  3. 也可以用镊子轻轻地将盖玻片从载玻片上移开，以从盖玻片的侧面释放气泡。
  4. 只要盖玻片可以自由浮动，就可以在此位置进行调整。
  5. 确保您可以通过腔孔看到整个基准标记（“ F”）。
  图6. ITO盖玻片漂浮在铝盖玻片支架A侧圆形腔上方的DPBS薄层上
8. 吸去载玻片上多余的液体。将Kimwipe折成两半，然后将折叠的边缘触摸盖玻片的一侧，以吸干多余的液体（图7）。重复所有四个方面，直到干燥。如果盖玻片上有液体，您可以在盖玻片上铺一块纸巾，以吸干其余部分。仅在弄脏侧面后执行此步骤。
  1. 这会将盖玻片“密封”到幻灯片上。此时移动或重新放置ITO盖玻片可能会损坏电池。
  2. 如果在此步骤后圆形腔室中有气泡或ITO盖玻片放置不当，则可以将DPBS轻轻地添加到盖玻片的侧面。等待DPBS在盖玻片下面流动，然后将其从载玻片上提起。
  图7.用Kimwipe印迹从铝盖玻片架上去除多余的DPBS
9. 将一条透明胶带（例如，例如，3M Scotch TM 胶带）撕成两半，然后通过在侧面贴上胶带将盖玻片固定到幻灯片上。重复所有步骤（图8）。
  注意：避免使用过多的胶带，因为在荧光成像后需要将其除去。
  
  图8.使用透明胶带将盖玻片附着到铝盖玻片支架上
10. 对每个ITO盖玻片重复此过程。
11. 将准备好的样品在倒置共聚焦荧光显微镜上成像。我们在以下过程D中对FEI CorrSight TM 进行了成像。
  注意：我们建议在制备样品后尽快成像，因为可能会发生一些蒸发。
在FEI CorrSight TM 系统上进行荧光成像和标测细胞
此过程介绍了如何使用FEI CorrSight TM 成像系统收集标记细胞的显微照片。首先通过共聚焦FM对步骤A-C中制备的样品进行成像，以鉴定荧光细胞。共聚焦FM用于在细胞表面成像VIPER荧光（Qdot655）和Tf-AF488。在FM成像期间，FEI MAPS软件使用户能够通过扫描EM（SEM）选择和“映射”细胞以进行后续的高分辨率成像。图9概述了FEI MAPS软件。
注意：将幻灯片放到舞台上并开始成像后，幻灯片必须保持在原位，直到完全贴图。即使对幻灯片的位置进行很小的调整，也会使幻灯片移动并导致地图不准确，从而难以为SEM成像重新放置细胞。

图9. FEI MAPS 2.1.38软件的带注释的屏幕截图
1. 将浸油涂在63倍物镜上。然后切换到5倍物镜。可以在标有“目标”的面板中进行控制。从那时起，请参阅图9以获得软件控制。可以在FEI CorrSight TM 用户手册（参考9）中找到其他信息。
  注意：这是关键步骤。在进行5倍成像后卸下载玻片以在63倍物镜上加油，这将抵消映射。这将使扫描电镜难以重新定位细胞。
2. 将铝盖玻片架放在显微镜载物台上，使ITO盖玻片（A面）朝下朝向物镜。
3. 通过取消选中该面板中的所有框，使用标记为“成像通道”的面板关闭所有荧光通道。使用透射光使样品成像。
  1. 在标有“成像通道”的面板中，通过选中其复选框来打开“ TLControl”（透射光）通道。
  2. 在标有“焦点控制”的面板中，将焦点设置为20 mm。
  3. 通过单击标记为“实时成像”的按钮开始实时成像。
  4. 用鼠标的滚轮调整焦点，直到细胞和基准标记（“ F”）对准焦点。您可以在标有“焦点控制”的面板中调整聚焦的步长。
    注意：焦平面在盖玻片上会有所不同。因此，重要的是在移动舞台时，使基准“ F”焦点对准。
4. 将载物台驱动到铝盖玻片支架中圆形孔的边缘。
  1. 为此，请在要移动平台的实时图像上单击鼠标左键。
  2. 找到边缘后，单击标有“拍摄快照”的按钮拍摄快照（图10）。 “拍摄快照”功能将数据加载到图层面板中称为“ PreviewImages”的聚合图层中。
    注意：这不是存储图像数据的可行位置。但是，这些预览快照使您可以引用圆形腔室的边缘。为了绘制可捕获整个ITO盖玻片的图块集，需要这些边界。
  3. 继续拍摄快照，直到可以确定圆形腔室的边界为止。通常可以通过在圆的顶部，底部，左侧和右侧放置4个快照来完成此操作。
    
    图10. ITO盖玻片的快照（浅灰色），显示了铝盖玻片支架（黑色）中圆形腔室的边界
5. 左键单击并在滑孔上拖动（使用孔边界的快照指导您），然后右键单击“在此处添加图块”。这将创建一个图块阵列以对整个幻灯片成像，从而捕获基准F。
6. 在“作业队列”面板中执行采集，以通过透射光生成一张盖玻片的拼接平铺图像（图11）。
  
  图11.缝合的瓷砖图像，显示了安装在铝盖玻片支架（黑色）上的ITO盖玻片（浅灰色）。请注意，已捕获并用蓝色箭头表示的整个“ F”基准，焦点。还可以看到小的气泡，其中一些用红色箭头表示。
7. 准备通过FM对细胞成像。
  1. “成像通道”面板中“ WF 488 SB”通道上的复选框。此设置在488 nm处激发Tf-AF488，并通过525/50 nm滤光片收集发射。
  2. 选中“ WF Qdot 655 SB”通道上的复选框。此设置在405 nm处激发Qdot655，并通过690/50 nm滤光片收集发射。
  3. 您可以通过单击通道名称在“成像通道”面板中修改每个通道的强度。将强度保持为100％，并通过在这些通道中实时成像来适当设置曝光时间。
    1. “良好”的采集设置所产生的信号占据了16位检测器动态范围的50％以上，并且在任何像素中都没有饱和信号。这可以在标有“信号直方图”的面板中观察到。
  4. 切换到63倍物镜后，可能需要进行一些调整。
8. 现在可以以63倍的放大倍率对细胞进行成像和映射。
  1. 在图像采集过程中，使用5倍物镜以低倍率定位细胞。然后切换到63倍物镜，以收集高分辨率图像。当“映射”细胞时，将获取荧光图像，并自动将图像与坐标位置一起保存。
  2. 我们建议根据Tf-AF488信号选择要成像的细胞，以避免将细胞选择偏向最亮的Qdot655信号（即，最亮的VIPER标记细胞）。
  3. 我们建议拍摄幻灯片的5倍荧光图像。这些图像有助于通过SEM定位映射的单元格。对于具有高细胞密度的样品尤其如此，其中仅根据大小和形状很难找到单个细胞。
  4. 反复在5x和63x之间切换会在浸泡油中产生气泡。这些不会影响63倍的成像，但气泡会出现在5倍的图像中。
9. 要绘制细胞图，请使用实时成像功能将所需细胞以63倍的放大倍数定位。左键单击并在单元格位置上拖动一个图块，然后右键单击“在此处添加图块”。这将创建一个图块以对单元进行成像并注册其位置。
10. 在“作业队列面板”中执行采集。
  注意：FEI MAPS采集软件将记住以63倍成像的细胞相对于以5倍放大倍数绘制的盖玻片的整个尺寸的绝对位置。
11. 为每个单元创建一个新层。您可以通过创建图层组来对样本进行分组。对于每一层，使名称具有描述性（例如，单元格1 VIPER Qdot幻灯片A）。这些名称将成为存储数据的文件夹名称。
  注意：由FEI MAPS软件收集的所有单个图像均自动命名为“ Tile_000_0001”。因此，描述性层名称很重要。
12. 成像和映射后，从FEI CorrSight TM 显微镜中取出载玻片。
13. 用镜头纸彻底清洁滑片，以除去浸油。然后使用70％的乙醇用镜头纸清洁。
14. 轻轻撕下胶带，然后将ITO盖玻片放回6孔板的DPBS中以进行进一步处理（图12）。
  1. ITO盖玻片的方向应使6孔板中的细胞朝上。
  2. 可以用剃须刀划痕胶带，以帮助将其从铝滑轨上取下。
  3. 如果去除胶带后样品被“粘”在铝玻片上，请在玻片边缘上滴几滴DPBS，然后等待液体在盖玻片下移动，将其从玻片上提起。用镊子强行拉下盖玻片可能会破坏盖玻片，或者通过将其滑动到铝滑片上而损坏电池。
  图12.卸下铝盖玻片支架上的ITO盖玻片。 A.朝侧面拉而不是向上拉，以减小施加在盖玻片上的力，从而取下胶带。 B.向ITO盖玻片的边缘添加液体，并等待其渗入盖玻片的下方。 C.用细镊子轻轻地将盖玻片从边缘提起。
加工用于SEM成像的ITO盖玻片
该程序描述了用于在Helios Nanolab TM 660上对用于SEM成像的样品进行脱水的方法。该方法从步骤D的最后一步开始，在将样品通过FM成像并将ITO盖玻片置于6孔板。
1. 准备将用于脱水样品的乙醇溶液。
  1. 应使用无水乙醇和无菌去离子水稀释。
  2. 准备10-15毫升的储备液：25％，50％，75％和90％（v / v）乙醇。未稀释（“ 100％乙醇”）也将用于样品脱水。
    注意：对于SEM成像，脱水时从细胞中完全除去水至关重要，因为残留的水会导致细胞破裂和变形（图13）。每次使用新鲜的无水乙醇瓶可最大程度地降低这种风险。
    
    图13.脱水的CHO TRVb细胞的显微照片，用于SEM成像。 SEM显微照片是在FEI Helios Nanolab TM 660 SEM上以3500倍的放大倍数（水平视场）获得的宽度：119μm）。在此采集模式下，ITO盖玻片显示为亮白色。 A.用旧的乙醇瓶（打开并在数月内重复使用）制备的乙醇梯度脱水的受损细胞的显微照片。细胞为浅灰色，外观类似花边，细胞核明显。从受损的细胞后面可以看到白色的ITO基板，从而导致细胞核周围呈浅灰色的细胞。 B.保存良好的细胞的显微照片，所述细胞用一瓶新的无水乙醇制备的乙醇梯度脱水。与A中的细胞相反，这些细胞是完整的，呈深灰色，并且凸起程度更高。
2. 使用微量移液器或转移移液器从ITO盖玻片上抽出大部分DPBS。在细胞上保留一小部分液体。如果样品在空气中变干，则电池可能会破裂或被SEM损坏。为了最大程度地降低这种风险，切勿让ITO盖玻片变干。当使用快速蒸发的高百分比乙醇时，这一点尤其重要。
3. 用去离子水（1.5 ml /孔）洗涤ITO盖玻片以去除盐分。在室温下轻轻搅拌洗涤5分钟。
  注意：轻柔的搅动可以用手或在摇摆台上进行。
4. 从井中抽出大部分水，再次工作以确保盖玻片保持湿润。
5. 向玻片中加入25％（v / v）乙醇（1.5 ml /孔）以开始脱水梯度。在室温下轻轻搅拌孵育5分钟。
6. 从孔中抽出大多数25％（v / v）乙醇，留下足够的溶液，使载玻片保持覆盖状态。
7. 使用50％，75％，90％和100％乙醇重复步骤E5和E6。
  注意：这种乙醇分步梯度使细胞缓慢脱水，以最大程度减少脱水过程中细胞的收缩和结构破坏。
8. 在100％乙醇中第二次孵育盖玻片，以确保从样品中除去所有水分。
9. 现在已准备好将盖玻片装入临界干燥机。
10. 使用临界点干燥机（Leica EM CPD300）对样品进行脱水。
  1. 打开样品室并加载ITO盖玻片。
    1. 用细镊子转移盖玻片的第一层，细胞朝上。
    2. ITO盖玻片可通过使用不锈钢防皱垫圈彼此堆叠。将垫圈轻轻放在ITO盖玻片的顶部，然后添加下一个盖玻片（图14）。垫圈足够大，以使感兴趣的电池应位于垫圈的孔中，而不与垫圈本身接触。总共4层盖玻片可放入样品室内。
      
      图14.在脱水过程中，使用不锈钢起皱垫圈将ITO盖玻片分开。在最终的脱水步骤中，这些垫圈可防止盖玻片彼此粘附。
  2. 使用临界点干燥机使样品脱水。在Leica系统上，我们设定了以下脱水条件：
    搅拌：50％
    自动交换：开启，
    CO 2 注入速度：慢，
    填充物：1个阶段（填充物是放置在室内的固体塑料块，以吸收体积并最小化干燥体积），
    CO 2 注入延迟：120 s，
    CO 2 交换速度：1（满分10），
    CO 2 交换周期数：25，
    CO 2 放气的加热：缓慢，
    CO 2 放气的速度：很慢。
11. 现在可以将干燥的样品安装到存根样品架上（步骤F）。
用于SEM成像的盖玻片和碳涂层的安装
该程序描述了将脱水的ITO盖玻片安装到SEM针脚样品支架（Ted Pella）上的方法，在此称为“ SEM安装针脚”或“针脚”。它还描述了用于碳涂层样品的方法。该过程从过程E中制备的脱水样品开始。
1. 在SEM安装针的边缘上刷少量的导电银漆。
  1. 在将ITO盖玻片放在销钉上时，将其涂抹在ITO盖玻片的轮廓附近。
  2. 银漆必须完全除气并干燥，然后才能将其置于真空镀膜机中。在步骤F3中，将盖玻片的边缘而非中心粘上，使干燥过程更快。
  3. 可以通过在下面写上SEM固定销来标记样品的身份。
2. 当银漆浸湿时，使用细镊子将ITO盖玻片放在SEM安装销上，并使电池朝上（图15）。
  
  图15.使用导电银涂料将ITO盖玻片粘合到SEM安装销上。将涂料稀疏地涂到SEM安装销的边缘。
3. 将销钉安装的ITO盖玻片存放在干燥下，并将银漆干燥过夜。
  注意：我们将销钉固定的盖玻片存储在带有干燥剂（即，Drierite TM ）。
4. 银漆干燥后，将样品转移到高真空快速喷涂机（Leica EM ACE600）：
  1. 对涂层设备的腔室排气。当腔室达到大气压力（100 mbar）时，请打开门。
  2. 通过将销钉固定在转盘支架上，将样品放入室内。不要重叠样品。关门。
  3. 将碳线装入样品室上方的涂层装置中。
  4. 将涂布单元放回涂布机中。
5. 在真空下涂覆样品：
  1. 运行程序“ Pulse sgh coatinger”。使用以下设置：
    涂层厚度：10 nm，
    样品高度：3 nm，
    倾斜：0度。
6. 一旦完成了碳涂层并排空了样品室，就可以取出样品并准备通过EM（步骤G）进行成像。
  注意：可以通过轻轻撬开ITO盖玻片并用100％乙醇清洗引脚来重新使用SEM安装引脚。在添加银漆之前，让针脚完全干燥。

操作FEI Helios Nanolab TM 660 SEM仪器进行SEM成像
此过程使用的是过程F结束时准备的样品。这些样品应包含ITO盖玻片上的单元，该单元已标图，脱水，粘贴到SEM安装销上并进行了碳涂层。

图16. FEI Helios Nanolab的带注释的屏幕截图 TM xT Microscope Control软件（版本10.1.7）
1. 有关软件控件的带注释的屏幕截图，请参见图16。可以在FEI Helios Nanolab TM 660用户手册（参考文献10）中找到其他信息。
2. 对FEI Helios Nanolab TM 660 SEM的样品室进行排气。在标有“ EM控制”的面板中找到标有“通风”的按钮。
3. 一旦完全排气，就可以打开腔室，并且可以将样品装载到平台上（由于使用的销钉的大小，最多可以装载2个）。当SEM发出嘶嘶声时，您将知道腔室已完全排气。您也将无法完全打开箱门，直到其完全通风。
4. 使用螺丝刀将样品固定到样品架上。
  1. 摆出摄像头（“ Nav-cam”），并在载有样品的舞台上拍照。这是通过按摄像头上的单个按钮完成的。
  2. 缩回导航摄像头并关闭腔室。
  3. 抽真空以达到最佳真空度。可以通过按“ EM控制”中标有“泵”的按钮来完成。
5. 打开FEI MAPS 3.0软件，并从以前的FEI CorrSight TM 映射会话中加载MAPS文件。
6. 准备运行SEM。 SEM默认设置为在Everhart-Thornley检测器（ETD）上进行采集。
  1. 腔室处于真空状态后，在“ EM控件”中打开电子束。将电子束电压设置为3.0 kV和0.2 nA。这些条件使样品保存与图像质量保持平衡。
  2. 使用载物台的Nav-cam照片（左下，图16），通过双击样品将显微镜驱动到样品。
  3. 在＆gt;上放大功能。放大2000倍，并使用连接到SEM的控制器仪表板聚焦显微镜。单击软件中的“将Z链接到舞台”。
  4. 在准备进行步骤G7的面板中，在标有“ Stage position”的面板中将平台高度设置为4 mm。
7. 在标有“更改检测器”的面板中切换到圆形背向散射（CBS）检测器。舱室的实时摄像机视图应显示电子枪下方的金属探测器臂（CBS探测器）摆动。
  注意：载物台高度不合适会损坏样品和检测器臂（请参阅步骤G6d）。
8. 使用“对齐向导”将SEM与过程D中收集的盖玻片光图像进行全局对齐（图11和图17）。
  1. 左键单击FEI MAPS软件中的“ Global Alignment”。
  2. 将SEM驱动到“ F”基准标记的不同界标。
  3. 右键单击FEI MAPS软件中的中心标记以拍摄快照，然后选择“此处快照”。快照将加载到FEI MAPS中。
  4. 使用全局对齐面板将SEM基准“ F”的特征与ITO盖玻片的透射光图像上的“ F”进行匹配。
  5. 运行alignment命令。如果正确完成，现在收集的SEM图像应与步骤D中收集的透射光图像上的“ F”完全对齐（图18）。
    
    图17.将FEI Helios Nanolab对准 TM 660 SEM平台与FEI CorrSight生成的地图 TM 。基准标记“ F”的反向散射SEM快照通过使用“对齐”标记与相同“ F”的透射光图像对齐。三点对齐。用户手动在SEM和透射光图像之间的“ F”上匹配三个界标。 SEM中以绿色圆圈标记的位置与透射光视图中的绿色圆圈相同。蓝色和粉红色圆圈重复相同的过程。
    
    图18. FEI Helios Nanolab TM 基准标记“ F”的660 SEM快照与来自FEI CorrSight TM 。。将SEM图像与FEI CorrSight TM ，现在将FEI Helios Nanolab TM 600 SEM与FEI MAPS软件对齐。用户现在可以在FM收集的显微照片上的任何位置进行选择，以将SEM工作台驱动到大致相同的位置。然后可以通过SEM以高倍率对同一细胞成像。
9. 完成全局比对后，可以在FEI MAPS中选择来自先前荧光图像的任何细胞，并且SEM将驱动到该细胞的位置以进行高倍SEM成像。
  1. 由于难以对齐高倍率图像，因此该单元可能会偏离所选位置10-100微米。
  2. 使用单元格的形状或5倍荧光图像找到要通过SEM成像的确切单元格。
10. 以3500倍的放大倍率（水平视场宽度：119μm）拍摄图像，以在单个视场中捕获整个细胞。
  1. 与FEI CorrSight TM 操作类似，为每个像元和每个图像集创建一个新层。可以通过创建图层组来对样本进行分组。使层名称具有描述性，因为它们将是保存数据的文件夹名称。 FEI MAPS软件收集的所有单个图像均自动命名为“ Tile_000_0001”，因此描述性层名称很重要。
11. 以65,000倍（水平视场宽度：6.37μm）或100,000x（水平视场宽度：4.14μm）放大图像以捕获细胞表面并分辨单个Qdot。
  1. 电子束具有破坏性，会烧蚀细胞（即，损坏细胞并引入空穴）。在调整成像条件（即，焦点，污点）时，检查与包含将要成像的细胞的区域相邻的区域。这将有助于保留65,000倍或更高放大倍率的SEM成像细胞形态。有关以3,500x，63,000x和100,000x放大倍数获取的显微照片，请参见图19。
  2. 可选地，如“数据分析”中所述，量化SEM显微图中的Qdot。
12. 每个像元获取多个图像，每个条件获取多个像元。我们建议每个单元至少2个图像，至少3个单元。
  1. 瞬时转染在蛋白质表达中产生细胞间差异。因此，重要的是要包括复制品并成像多个细胞以补偿这种可变性。
  2. 为了在SEM显微图中量化Qdot，我们对每个条件成像了6个细胞，每个条件成像了2个图像，每个条件成像了12个图像。
    
    图19.以3500x（水平视场宽度：118 µm），63,000x（水平视场宽度：6.38 µm）和100,000x放大率（水平视场宽度：4.14 µm）成像的细胞的SEM显微照片。右列显示了每次捕获的5倍数字放大率，突出显示了相应显微照片中绿色框所概述的区域。 Qdots在高倍显微照片中可见为浅灰色圆形颗粒。

数据分析

SEM图像中颗粒的定量
用Qdots标记的VIPER是化学计量的，这意味着每个VIPER标签将有一个Qdot。此功能使标记的蛋白质可以通过算法分割和Qdot计数进行定量。我们建议以高放大倍率（65,000x或100,000x）获取SEM图像，以实现最佳的颗粒检测和分割。
＆nbsp;我们在Matlab（版本R2017b）中开发了一个自定义管道，用于自动检测和定量分析反向散射SEM图像中的颗粒。我们首先使用形态学礼帽过滤在黑暗的背景上检测到感兴趣的明亮物体。使用一系列数学形态学运算执行对象分割。简而言之，执行自动强度阈值检测Qdot。使用种子分水岭变换将聚类的对象从最终侵蚀的结果中分离出来。接下来，我们对分段的单个颗粒（n ＝ 1），二聚体（n ＝ 2）和多聚体（n＞ 2）进行计数。分割前后的代表性显微照片如图20所示。

图20.细胞表面Qdot的算法分割和自动计数。 A.显示了原始的未经处理的SEM显微照片，放大倍数为100,000x。 Qdot在细胞表面上显示为亮白色的点，并显示为深灰色。 B.在Matlab中处理A中的显微照片以生成计数蒙版。红色遮罩（红色轮廓）表示通过形态学礼帽过滤检测到的对象。绿色遮罩（绿色轮廓）指示使用分水岭变换检测到并分离的对象。插图显示指定区域的3倍放大倍率。

在自动图像处理之后，我们目视检查了分割以细化参数并排除了错误标记为Qdots的对象。虚假注释很少见，但通常是由不规则的背景，强度变化，背景伪影或上述自动程序忽略的分割错误引起的。
＆nbsp;优化参数集以量化在FEI Helios Nanolab TM 660 SEM仪器上使用CBS检测器以65,000x-100,000x放大倍数获得的SEM显微照片中的Qdot655。可能需要根据图像质量，分辨率或粒子类型（例如，10 nM金或Qdot555）调整这些参数以识别粒子。 “ VIPER_object_detection.m”代码需要两个输入参数，这些参数涉及：（i）VIPER_object_detection.m中的强度（ ie ，“ int_threshold”）和（ii）对象大小（“ obj_size”，“ obj_size_filter”在VIPER_object_detection.m中），如果图像之间的强度存在差异，则应更改与强度有关的参数；如果检测粒子的物理尺寸不同（例如，大金颗粒）或分辨率变化（即，像素大小）。此外，该代码还包括用于移除小物体的过滤选项。“ obj_size_filter”可以调整为删除尺寸过小的注释，这些是我们用于分析Qdot655粒子的参数：
int_threshold = 60; ％强度参数；
obj_size = 10; ％对象大小参数；
obj_size_filter = 5;小尺寸对象的％过滤器。
这是一个简短的教程，描述了如何运行我们的自定义分析管道来检测和计数粒子（即，Qdots）以及计算分段的粒子：

将文件“ VIPER_object_detection.m 复制到所需文件中计算机目录。
在同一计算机目录中，创建一个名为“ ./img/”的文件夹。
将SEM图片（“ tiff”文件格式）复制到“ ./img/”下。
在以下命令窗口中运行“ VIPER_object_detection.m ”。 Matlab。
该程序将开始分割并计算对象。
输出文件将提供以下信息：
qdot_count.csv：对象数（单个Qdot，二聚体，多聚体，N_total≥N_1 + N_2 x 2 + N_more x 3），
[filename] -PTmask.mat：对象遮罩，
[filename] -Overlay.png：覆盖边界的图像（红色：对象，绿色：分离的对象）。

菜谱

活细胞块解决方案
Ham的F12媒体中10％（v / v）FBS，6％（w / v）BSA
Qdot Block解决方案
DPBS中的10％FBS和6％BSA
Qdot标签解决方案
DPBS中6％（w / v）BSA

致谢

这项工作是由OHSU医学院和国立卫生研究院（R01 GM122854）资助的。 JKD由波特兰大学科学家成就奖章（ARCS）资助。本文描述的协议最初在Doh等人（2018）中进行了描述。 CHO TRVb细胞由Timothy McGraw教授慷慨提供。 EM和CLEM实验是在OHSU的多尺度显微镜核心进行的，并得到OHSU骑士癌症研究所（NIH P30 CA069533）的Advanced Multiscale Microscopy Shared Resource的支持。铝盖玻片架由Ingo Gestmann（FEI）制造。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。 VIP技术正在申请国际专利（PCT / US17 / 60609）。

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