材料和试剂

SW60转子的开口管。例如，敞口式透明管7 / 16x2-3 / 8“（塞顿，目录号：7010）
过滤的移液器吸头（任何可商购的都合适，括号中的示例）
1. 10μl滤嘴（STARLAB，目录号：S1121-3810）
2. 20μl滤嘴（STARLAB，目录号：S1120-1810）
3. 200μl滤嘴（STARLAB，目录号：S1120-8810）
4. 1000μl过滤嘴（STARLAB，目录号：S1122-1830）
15 ml试管（任何市售产品均适用，例如，，Greiner Bio-One，目录号：188271）
50 ml管（任何可商购的产品都是合适的，例如，，Greiner Bio-One，目录号：227261）
6孔组织培养板（任何可商购的产品都是合适的，例如，，TPP目录号：92006）
Protein LoBind管1.5 ml（Eppendorf，目录号：0030108116）
可分装的250μl96孔PCR板（Eppendorf，目录号：0030133374）
N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sarkosyl，Sigma，目录号：L5125-100G）
盐酸Trizma ？（Tris-HCl，Sigma，目录号：T3253-1KG）
氯化钠（NaCl，Sigma，目录号：71380）
EDTA二钠二水合物盐（Amresco，目录号：0105-1KG）
DL-二硫苏糖醇（DTT，Thermo Scientific，目录号：R0861）
磷酸酶抑制剂。例如，PhosSTOP（罗氏，目录号：4906387001）
完整的不含EDTA的迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，目录号：11836170001）
用于组织均质化CKMix的裂解试剂盒（Precellys，目录号：P000918-LYSK0-A）
氯化镁（MgCl 2 ，Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G）
苯并酶核酸酶HC，纯度＞ 1。 90％25KU（Merck，货号：71205-3）
细胞培养级磷酸盐缓冲盐水（PBS Gibco，目录号：10010015）
蔗糖（Millipore，目录号：84100）
OptiPrep TM 密度梯度介质（Sigma-Aldrich，目录号：D1556）
干冰
蒸馏水（Invitrogen，目录号：10977035）
2个均质化增溶（HS）缓冲液（请参阅食谱）
1个HS缓冲区（请参阅食谱）
Benzonase混合物（请参阅食谱）
2x HS缓冲液4％Sarkosyl（w / v）（请参阅食谱）
1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl（w / v）（请参阅食谱）
用于细胞的苯佐生酶混合物（请参见食谱）
蔗糖垫（请参阅食谱）
8x HS缓冲液4％Sarkosyl（w / v）（请参阅食谱）
2x HS缓冲液1％Sarkosyl（w / v）（请参阅食谱）

设备

镊子（任何商用产品均适用，例如，，VWR，目录号232-1221）
手术刀（任何可商购的产品都是合适的，例如，，VWR，目录号233-5363）
-80°C的冷冻室用于匀浆等分试样的储存（任何商用冷冻室均适用）
最小化均质机（P000673-MLYS0-A，Bertin Technologies）
干冰桶（任何市售产品均适用，例如，Fisher Scientific，目录号11324085）
带1.5毫升SmartBlock的Thermo Mixer C（Eppendorf，目录号：5382000015）（Eppendorf，目录号：5360000038）
台式离心机。例如，Prism TM 微量离心机（Labnet International，C2500）
渐变主底座单元（BioComp，＃108），带有7/16英寸（11毫米）Magnabase TM 支架和标记块，用于SW60转子短帽（BioComp，＃105-911A-R）
超速离心机。例如，OPTIMATM XPN-100超速离心机（贝克曼库尔特公司，A99846）
SW 60 Ti摆桶式转子（Beckman Coulter，335649）
Vortex（适用于任何市售的冷冻机；例如，Scientific Industries，SI-0236）
微量移液器（任何可商购的都适用，括号中的示例）
P10（Eppendorf，货号：3120000020）
P20（Eppendorf，货号：3120000038）
P200（Eppendorf，货号：3120000054）
P1000（Eppendorf，货号：3120000062）
活塞梯度分馏仪（BioComp，152）
馏分收集器（Gilson，FC203B）

程序

组织的均质化（图1A）

图1. SarkoSpin协议的示意图。 A.将脑部解剖组织机械均质化，并分为一次性使用的等分试样，将其速冻以备将来使用。 B.将等分的匀浆溶解在基于Sarkosyl的缓冲液中，并用核酸酶处理，以破坏主要的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA复合物，然后再将C.大量的不溶性病理性TDP-43分离一次即可。（D，E）或者，可以通过不同的分析离心方法分析不溶性病理TDP-43的生化特性。
1. 将患者样品从-80°C冰箱中取出放入盛有干冰的盒子中，以免在处理时解冻组织。
2. 将大脑样本放在纸上的天平上，使其稍微融化。
3. 用无菌手术刀和高压灭菌的镊子从脑样本中切出最大重量为300 mg的一块。
4. 将剩余的样品倒入干冰中，以避免进一步解冻和损坏组织。
5. 用无菌手术刀将天平上的脑样本切成较小的部分。
6. 为了均质化，将组织碎片从裂解试剂盒转移到2 ml试管中，其中包含直径为1.4和2.8？mm的陶瓷珠的混合物。
7. 添加HS缓冲液的比例为5：1的组织。例如，对于每管最大300 mg，添加1.5 ml 1x HS缓冲液（配方2）。
8. 将样品在Minilys设备中均质化3次，每次均以最大速度进行30 s。两轮之间在冰上冷却样品。
9. 让样品放下，使泡沫消失。在台式微量离心机中短暂旋转离心管会有所帮助。
10. 低速快速涡旋，同时避免产生新的泡沫。
11. 在低蛋白结合的1.5 ml管中将匀浆分成150μl的等分试样。
12. 保留10μl来自原始匀浆的等分试样，以通过Western印迹检查样品中磷酸化TDP-43的水平，并以5μl进行蛋白质浓度测定（直接添加至45μl1x HS缓冲液中进行稀释）。此步骤将允许确定匀浆是否确实具有可比较的起始蛋白质浓度，因此来自不同脑样本的SarkoSpin on匀浆将具有可比性。
13. 将150μl等分试样在干冰上速冻，并储存在-80°C下。如果在-80°C下正确储存，匀浆等分试样可将SarkoSpin纯化数月至数年。
增溶（图1B）
1. 在冰上解冻匀浆等分试样（来自步骤A13）。
2. 向每个样品中加入50μl苯并酶混合物（配方3）。
3. 在室温下孵育5分钟。
4. 向每个样品中加入200μl2x HS缓冲液4％Sarkosyl（配方4）。
5. 在38°C的Thermo Mixer中孵育，并以600 rpm摇动45分钟。
当从培养的细胞样品中进行SarkoSpin时，细胞裂解和增溶按以下组合步骤进行：
1. 每孔6孔板，在100μl1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl中裂解细胞。
2. 加入5微升苯并酶混合物的细胞（食谱3）。
3. 在室温下孵育5分钟。
4. 刮擦细胞，将裂解液转移至低蛋白结合的1.5 ml试管中。
5. 用另外的100μl1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl洗涤孔，然后转移到试管中。
6. 涡旋均匀化。
7. 将170μl的裂解物转移到一个新的低蛋白结合的1.5 ml试管中，剩下5μl用于蛋白浓度测定，剩下30μl用于总裂解物的Western blot分析。
8. 将178μl2x HS 4％Sarkosyl和1x HS添加到170μl裂解物中，最终浓度为400μl中2％Sarkosyl的最终浓度（就像脑匀浆溶解一样）。
9. 在冰上孵育45分钟，每10分钟振荡一次。
10. 继续进行其余步骤，如脑匀浆。
隔离（图1C）
1. 向每个样品中加入200μl冰冷的1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl（配方5）。
2. 在台式离心机中于室温（RT）以21,200 x g 的速度离心30分钟。
3. 用样品名称和“上清液/沉淀”标记低蛋白结合的1.5 ml管。
4. 离心后，除去最多500μl的上清液，并将其放在标有“ Supernatant”的试管中。
5. 小心地用凝胶加载尖端除去残留的上清液并丢弃。
6. 让样品静置一分钟，然后重复步骤C5以确保除去所有上清液。
7. 用100μl细胞培养级PBS小心洗涤沉淀物（棕色）和管壁。脂质可以在蛋白质沉淀上方以白色层的形式出现，可以用PBS小心冲洗掉（要完全去除样品中的脂质，请参见下文）。
8. 重复步骤C5和C6，除去所有PBS痕迹。
9. 用所需量的1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl重悬沉淀，然后转移到预先标记为“ Pellet”的试管中。
  如果样品不会立即用于分析，请勿将其重新悬浮在沉淀物中。将样品速冻在干冰上，并储存在-80°C下。
10. 继续通过SDS-PAGE，天然PAGE或点印迹和Western blot进行沉淀分析（数据分析，图2）。
  
  图2.分离自SarkoSpin的上清液和沉淀部分的代表性Western印迹。病理性磷酸化的TDP-43富含FTLD患者样品的沉淀部分，而健康对照组则没有，而大部分生理性TDP-43保持可溶。重要的是，上清液中也保留了丰富的细胞蛋白质，例如SOD1，肌动蛋白和组蛋白H3。
为了避免脂质和蛋白质的共沉淀，可以选择在蔗糖垫上进行SarkoSpin的操作，如下所示（从步骤B5继续）：
1. 将400μl溶解的匀浆物置于400μl的低蛋白结合1.5 ml管中的蔗糖垫（配方7）上。
2. 在台式离心机中于室温（RT）以21,200 x g 的速度离心30分钟。
3. 继续执行步骤C3所述的协议。
速度沉降分析（图1D，从步骤B5继续）
1. 如表1所示准备OptiPrep梯度垫。
  
  表1.速度沉降测定所需的OptiPrep梯度垫配方。对于2x HS缓冲液（1％Sarkosyl），请参见配方9。对于商用OptiPrep溶液（60％），请参见材料和试剂。
2. 使用梯度母粒在4.2 ml SW60转子管中准备线性OptiPrep梯度，如下所示：
  1. 将管子放在SW 60 Ti转子的标记块中，在管子中间画一条线以形成短盖。
  2. 用移液管将10％OptiPrep缓冲液吸到管中，直到高出画线几毫米。
  3. 小心地用提供的钢制套管在管底部注入25％的OptiPrep缓冲垫，从而向上推之前的10％的OptiPrep缓冲垫，直到接口达到管的中间标记。
  4. 用提供的短盖封闭管，除去内部的残留空气。
  5. 使用Gradient Master上的滚动和水平仪以使Magnabase处于水平状态。
  6. 将试管放在Magnabase中，然后转移到Gradient Master板上。
  7. 运行程序：SW60-1 step：// 1分钟10 s // 82o // 20 rpm //。
  8. 完成后，小心地取下管帽，并取下约150μl的梯度上层。
  9. 称量含有梯度的试管，并尽可能精确地平衡它们（以分贝表示）。
3. 小心地将200μl溶解的匀浆液（步骤B5）铺在梯度顶部。
4. 在4°C下以400,000 x g 的速度超速离心45分钟，最大加速度和减速度。
5. 小心地用镊子从离心桶中取出试管，并将其保持在4°C，然后使用与馏分收集器关联的活塞式分馏器进行分馏。
6. 在收集器支架中插入一个可分割的250μlPCR。
7. 在每个梯度之前和之后，通过分装充满水的管并使用“冲洗”按钮冲洗活塞。
8. 在清洗步骤之后，通过打开空气螺钉并按下“空气”按钮使它吹过活塞，对活塞进行空气干燥。干燥后轻轻拧回。
9. 将梯度放置在分液器中，并用瓶盖夹住。
10. 让活塞随着位置滚动而下降，直到液体到达收集器头。
11. 重置位置并输入以下程序：速度：0.5 /距离：2.96 /数字：16
12. 按开始。分馏器将在可分割的96孔PCR板中自动将梯度分为16个馏分。
13. 重复洗涤和干燥（步骤D7和D8），然后分馏另一个梯度。
密度浮选法（图1E，从步骤B5继续）
1. 如表2所示准备OptiPrep梯度垫。
  
  表2.密度浮选测定所需的OptiPrep梯度垫配方。对于8x HS缓冲液4％Sarkosyl，请参见配方8。对于OptiPrep溶液（60％），请参见材料和试剂。 br />
2. 为了准备不连续的OptiPrep梯度，请小心地将OptiPrep垫子放在4.2 ml SW60转子管中，以按以下顺序创建不连续的梯度（底部最高浓度）：
  300μl的纯（60％）OptiPrep溶液
  700μl的50％OptiPrep缓冲垫
  800μl混合物（220μl来自步骤B5的溶解的匀浆+ 680μl50％OptiPrep缓冲液）的最终OptiPrep浓度为40％
  800μl的30％OptiPrep缓冲垫
  800μl的20％OptiPrep缓冲垫
  800μl的10％OptiPrep缓冲垫
  移取每个垫子后称量试管以平衡至分克水平。
3. 在4°C下以125,000 x g 的超速离心力进行17 h的最大加速和减速。
4. 如步骤D5所述进行分馏。

数据分析

根据SarkoSpin分离的应用，可以使用多种技术分析不溶性TDP-43，从Western印迹（SDS-PAGE，天然PAGE或滤膜阻滞分析后，图2）到高分辨率技术（如电子）显微镜或质谱分析法（Laferriere et al。，2019）。

菜谱

2个均质化（HS）缓冲液
20 mM Tris，pH 7.5
300 mM氯化钠
1 mM EDTA
2 mM DTT，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂
在没有抑制剂的情况下于4°C稳定一个月
50毫升：
1 ml的1 M Tris-HCl，pH 7.4（在500 ml H 2 O中的78.8 g Tris-HCl，过滤灭菌并在室温下保存）
6 ml的2.5 M NaCl（在250 ml H 2 O中的36.53 g NaCl，过滤灭菌并在室温下保存）
100μl的0.5 M EDTA，pH 8（在500 ml H 2 O中的93.06 g EDTA二钠二水合物，pH调整至8，过滤，灭菌并在室温下保存）
100μl的1 M DTT（1.5 g DTT溶于8 ml H 2 O中，以单次使用量分装并保存在-20°C下）
加蒸馏水至50毫升（约42.8毫升）
每10毫升2x HS缓冲液，即可获得2片完全不含EDTA的Mini和1片PhosSTOP
1个HS缓冲区
10 mM Tris，pH 7.4，15 mM NaCl，0.5 mM EDTA，1？mM DTT，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂
10 ml：
5 ml 2x HS缓冲液
5毫升蒸馏水
苯甲酸酯酶混合物
具有250 U /样品Benzonase的12 mM MgCl 2 1x HS缓冲液
对于50μl：
1μlBenzonase HC
50μl1x HS缓冲液
1.4μl500 mM MgCl 2 （在50 ml H 2 O中的2.38 g MgCl 2 ，过滤灭菌并保存在4°C下）
2x HS缓冲液4％Sarkosyl（w / v）
每10毫升2x HS缓冲液400毫克Sarkosyl
1x HS缓冲液0.5％Sarkosyl（w / v）
每10毫升1x HS缓冲液50毫克Sarkosyl
苯扎菌酶混合细胞
具有100 U /孔Benzonase的60 mM MgCl 2 1x HS缓冲液
对于6μl：
0.4μlBenzonase HC
5μl1x HS缓冲液
0.6μl500 mM氯化镁 2
蔗糖垫
1x HS缓冲液中40％蔗糖（w / v）
对于400μl：
160毫克蔗糖
用1X HS缓冲液加样至400μl
8x HS缓冲液4％Sarkosyl（w / v）
80 mM Tris，pH 7.5，1.2 M NaCl，4 mM EDTA，8 mM DTT，带有蛋白酶抑制剂和4％Sarkosyl（w / v）。在没有抑制剂的情况下于4°C稳定一个月（f）
4 ml：
320μl1 M Tris-HCl pH 7.4
960μl的2.5 M NaCl
32μl的0.5 M EDTA pH 8
32μl1 M DTT
加蒸馏水至4 ml（约2656μl）
1片cOmplete Mini不含EDTA
160毫克Sarkosyl
2x HS缓冲液1％Sarkosyl（w / v）
每10毫升2x HS缓冲液100毫克Sarkosyl

致谢

MP获得了瑞士国家科学基金会教授奖学金（PP00P3_144862），人类前沿科学计划职业发展奖（CDA-00058 / 2012）以及由UCL的欢迎信托机构战略支持基金投资的UCL / ZNZ神经科学合作补助金。研究人员（105604 / Z / 14 / Z）。 M.P.-B.获得苏黎世大学的坎多克奖（Forschungskredit）。 F.L.由ALS协会的Milton-Safenowitz奖学金（15-IIP-208）和苏黎世大学的博士后奖学金支持。
该协议基于出版物Laferriere et al。，2019。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

伦理

皇后广场神经病学大脑库（UCL神经病学研究所），神经学系（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）或荷兰脑库（荷兰神经科学研究所）提供了脑解剖材料。在所有受试者的书面知情同意下，捐献了脑组织，相应的机构获得了用于研究目的的临床信息。

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