材料和试剂

注意： + 多个供应商提供的商品示例。

微量离心管
T-75培养瓶（ + Corning，目录号：430641U）
25毫米普通玻璃盖玻片
6孔板（ + Corning，货号：CLS 3516）
24孔板（ + Corning，目录号：CLS 3524）
培养皿（ + Corning，目录号：CLS 430166）
血清移液管（5、10、25毫升）（ + Corning，目录号：CLS 4487、4488、4489）
标本罐（ + Sardstedt，目录号：SAR75.9922.534）
Falcon TM 细胞过滤器（ + Fischer Scientific）
冷冻小瓶/低温小瓶/冷冻管（ + Fisher Scientific，目录号：12-565-169N）
玻璃底盘（Cellvis，货号：D35-10-0-N）
羊股骨（屠夫新鲜）
在当前协议中测试的单元格
1. C3H / 10T1 / 2小鼠胚胎间充质祖细胞系（CCL-226，ATCC）
2. 大鼠神经母细胞瘤B35细胞系（Tpm3.1神经母细胞瘤）（Bryce等人，2003; Bach等人，2010; Jalilian等人。，2015年）
3. PDSCs，原发于骨膜的间充质干细胞（根据Knothe Tate，2011； Evans等，2013； Chang等，2014）
4. BMSC，骨髓源间充质干细胞（Lonza，目录号：PT 2501，批号0000636886）
胎牛血清（ + Gibco，目录号：26400044）
L-谷氨酰胺（Sigma，目录号：G7513-100ML）
青霉素/链霉素（ + Sigma，目录号：P4333-100ML）
DMSO（ + Sigma，目录号：472301-100ML）
胰蛋白酶-EDTA（ + Sigma，目录号：T4049-500ml）
Cellular Lights TM 肌动蛋白GFP（CellLight ®肌动蛋白RFP，BacMam 2.0，分子探针/生命技术，目录号：C10583）。
CellLight ®微管蛋白GFP，BacMam 2.0（分子探针/生命技术，目录号：C10613）
PBS（磷酸盐缓冲盐水）（新南威尔士大学上层校园商店，货号：UCS-BIO-0040）
汉克斯缓冲液（Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物）（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
胶原酶II（Gibco，目录号：17101015）
具有GlutaMAX的α最小必需培养基（α-MEM）（ + Life Technologies，目录号：32561037）
抗生素-抗真菌药（AMAB）（Gibco，目录号：15240062）
0.4％（wt / vol）台盼蓝盐溶液（ + Sigma，目录号：T8154-100 ML）
液氮
Matrigel ®，无酚红（Corning，目录号：356237）
钙黄绿素-AM（ + Sigma-Aldrich，目录号：17783-1MG）
MTT（噻唑基溴化四氮唑蓝）代谢检测（Sigma-Aldrich，目录号：M5655-100MG）

设备

离心机
加湿培养箱
血细胞计数器
灌注和成像室（ + ProFlow室，Warner仪器，PFC-1）＆nbsp;
Leica SP8 DLS共焦激光扫描显微镜或其他荧光显微镜，激发和发射波长可调
酶标仪（Perkin Elmer Victor 3，570 nm滤光片）

软件

统计和图形分析软件（ + Prism 7软件，GraphPad）
图像分析软件（ + ImageJ，参考36）

第1部分–跟踪细胞/细胞核形状和变化的变化量，细胞骨架转录和机械适应
在这里，我们使用病毒基因传递系统以高分辨率将活细胞中核，肌动蛋白丝和微管中核，肌动蛋白丝和微管的变化进行了多重成像和跟踪，以将所需基因插入宿主的基因组中（Shoji 等人。，1997； Airenne 等，2003； Ho 等，2005； Kost 等，2005； Salminen et al。，2005年）。该技术的主要优点是肌动蛋白和微管蛋白单体都通过细胞转录系统被荧光标记，然后单个单体被细胞掺入细胞骨架结构中。该方法提供了快速，安全，简便的方法，可以将所需基因传递给不同的哺乳动物细胞系，但在某些细胞类型中可能无效，包括原始的绵羊骨膜衍生干细胞，PDSC（Chang和McBride，MechBio团队未发表的数据）。在这里，我们优化了上述C3H / 10T1 / 2小鼠胚胎干细胞系和永生化的Tpm3.1神经母细胞瘤细胞系的方法。之所以选择这两种细胞系，是因为两种不同细胞类型的转导使我们能够以定量且可靠的方式测量转导效率和蛋白质表达的量。

程序

细胞扩增（请参考针对与您的特定研究相关的特定细胞系推荐的特定详细信息；以下代表当前方案中测试的细胞系）。
1. 在装有10％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素（Invitrogen）的基础培养基中的传代细胞放入T-75培养瓶（Corning）中，并于37°C于5％CO _{2 在潮湿的培养箱中直到第3代（P3）。}
2. 在P3处，将细胞冷冻并保存在-80°C的冷冻小管中，并置于含有40％胎牛血清和10％DMSO的培养基中。
3. 储存后，额外的传代可使细胞增殖，并使所有实验均可在P5细胞上进行。
4. 用PBS洗涤细胞一次，并使用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen，Carlsbad，CA）分离细胞5分钟。
5. 当观察到细胞分离时，将标准培养基添加到烧瓶中，并将该细胞悬浮液转移到猎鹰管中。将细胞在300 xem离心5分钟，然后将细胞重悬于新鲜培养基中，然后接种在玻璃盖玻片上（参见B），放置一张灭菌的25毫米处理过的普通玻璃盖玻片或包被的（ eg （使用明胶或聚L赖氨酸）在6孔板（Becton Dickinson，Frankin Lakes，NJ）的每个孔中盖玻片（Fisher Scientific，Hampton，NH）。
  注意：我们的协作小组以前使用射频辉光放电（RFGD）来改善在不影响细胞生物学和机械结果指标的细胞外基质蛋白的情况下，在普通玻璃盖玻片上的细胞粘附性（Song 等人< ，2010、2012和2013）。
细胞接种，BacMam和病毒转导
1. 在细胞接种时，使用Cellular Lights TM 肌动蛋白-GFP（CellLight ®肌动蛋白-RFP启动细胞肌动蛋白和微管蛋白的荧光标记，BacMam 2.0，Molecular Probes / Life Technologies）和CellLight ® Tubulin-GFP，BacMam 2.0（Molecular Probes / Life Technologies）。在播种细胞之前，将试剂同时添加到生长培养基中。根据制造商的建议，每个电池应使用10-40个颗粒；但是，根据细胞类型和孵育时间，可以增加或减少颗粒数量。可以使用以下公式计算每个细胞中病毒颗粒的比例：
2. 使用血细胞计数器测量所需密度的种子细胞。我们以前的研究采用不同的密度来模仿目标发育环境，例如 eg ，低密度（5,000个细胞/ cm 2 ），高密度（35,000个细胞/ cm 2 < / sup>）和非常高的密度（70,000个细胞/ cm 2 ），以预定密度播种或增殖至目标密度（McBride和Knothe Tate，2008； McBride等）。 >，2008； Zimmerman和Knothe Tate，2011）。
3. 在板的每个孔中加入带有细胞骨架标记剂的生长培养基，并轻轻混合。
4. 放置在37°C和5％CO 2 的培养箱中过夜。然后，从孔中取出溶液，然后用PBS洗涤2次，然后单独添加新鲜培养基（不添加标签剂），持续24-72小时。
活细胞中的核染色
1. 在显微镜下进行实时成像之前45-60分钟，用Hoechst染色剂对活细胞核染色，用Hanks缓冲液（Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物，Thermo Fisher Scientific）稀释1 µl / ml。轻轻地将Hoechst染色剂与生长培养基混合，然后再将板放回培养箱（37°C和5％CO 2 ）中，持续45分钟。
2. 用4 ml无菌PBS（2 x 2 ml）清洗每个孔。
3. 第二次清洗后，除去PBS。
4. 移去接种细胞的盖玻片，并放置在灌注和成像腔室（Warner仪器，PFC-1，ProFlow腔室）或其他实时成像系统中，该系统可提供受控的机械线索，例如在流体-细胞界面处的压力，剪切力和正应力，张力，等。＆nbsp;
荧光显微镜对细胞机械适应的实时成像
1. 使用高分辨率激光扫描共聚焦或多光子显微镜，可以在暴露于流动室内的机械环境变化之前，之中和/或之后，以三个维度对细胞，其细胞核以及它们各自的肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架进行成像（ProFlow，华纳仪器）。我们使用了Leica SP8 DLS共聚焦激光扫描显微镜，针对每种感兴趣的细胞特征所使用的荧光标签调整了各自的激发和发射波长。
2. 对于细胞和细胞核的体积，表面积和形状测量，每张盖玻片（至少在五张盖玻片上成像，以确保通过功率计算确定足够的样本量）对一个或多个随机选择的视野成像，放大倍数为40倍（HCX APO） L UVI 40 x 80 W）。在以前的研究中，测量了细胞和核的体积以及表面积，从而可以计算形状（Zimmerman和Knothe Tate，2011）。为了测量与细胞体积无关的形状，将表面积：体积标准化为具有相同体积的球体的比率。该归一化SA / V给出相比完美的球体（1）与指示平坦，更扩展单元形状较大的值的单元格的形状的度量。细胞的高度还可以作为细胞形状的替代指标，而与体积和表面积的测量无关（Zimmerman和Knothe Tate，2011）。
3. 对于肌动蛋白和微管蛋白机械适应性的研究，以适合感兴趣的时间尺度的时间间隔获取图像（在我们先前的肌动蛋白或微管蛋白适应性单独研究中，间隔为30分钟； Zimmermann和Knothe Tate，2011； Chang和Knothe Tate，2011），使用相应的激发和发射波长的荧光探针。先前的研究以1024 x 1024像素分辨率和焦平面之间的0.2μm间隔获取图像。
4. 荧光标记的微管蛋白和肌动蛋白的强度提供了一种测量肌动蛋白和微管蛋白在空间和时间上的浓度以及细胞骨架对机械环境的适应性的量度。如前所述（Chang and Knothe Tate，2011），荧光强度可以测量骨骨架中矿物质密度的时空分布，从而测量细胞骨架的质量和结构，从而可以测量机械适应性（Knothe等），2011； McBride et al。，2011）。
5. 这样，通过考虑细胞和核的体积和形状以及肌动蛋白和微管蛋白的空间分布，可以响应于由体积和形状变化的应力引起的机械环境的变化来测量细胞的适应性。这些环境变化可以设计成模仿生理上发生的变化，或者也可以在对细胞和/或细胞构建体进行有针对性的机械测试的情况下加以控制，其中施加受控的力或应力并测量细胞的机械响应。

数据分析

代表性数据和协议验证
鉴于细胞骨架在细胞行为中无处不在的作用，我们首先检查了每种细胞系的转导效率以及BacMam病毒颗粒对其各自生长速率的影响，同时实施了先前测试的方案（Song et al。，2010年； 2012年和2013年； Chang和Knothe Tate，2011年； Zimmermann和Knothe Tate，2011年）。细胞骨架，特别是肌动蛋白丝，控制硬度，从而调节细胞的机械适应。由于杆状病毒使用肌动蛋白丝进行细胞内运输，因此重要的是检查病毒转导对细胞硬度的潜在影响。为了评估病毒转导对细胞机械性能的影响，按照我们以前的方法，使用原子力显微镜（AFM）检查了细胞的刚度（Jalilian et al。，2015）。 br /> ＆nbsp; 细胞骨架标记剂的转导在质量上很明显（图3）。转导的效率与生长速率成正比，表明在具有较低生长速率的细胞中，应增加有效转导的孵育时间。例如，在相同条件下，神经胶质瘤细胞的病毒转导效率高于C3H细胞，因为它们具有更高的生长速度（神经胶质瘤细胞48小时，而C3H细胞为72小时）（图4）。 >

图3.用肌动蛋白和微管蛋白BacMam颗粒（每个细胞20-30个颗粒）转导C3H / 10T1 / 2和神经母细胞瘤细胞。（A）合并的高分辨率活细胞共聚焦图像（B）的结果显示两种细胞系中的肌动蛋白和微管结构均不同，细胞核呈蓝色。

图4。转导的C3H / 10T1 / 2（左）和成神经细胞瘤细胞（右）的代表性生长曲线。将转导的细胞培养7天，并根据其相对对照测量其增殖率；n = 3个独立实验。

在转导细胞的生长速率与对照之间没有观察到显着差异，表明BacMam病毒转导对转导细胞的生理生长速率没有显着影响（图4）。此外，与对照相比，转导细胞的杨氏模量没有显着差异，表明BacMam病毒转导在研究的时间段内对细胞的机械性能没有显着影响（图5）。

图5.转导的C3H / 10T1 / 2（左）和神经母细胞瘤（右）细胞以及基线对照的杨氏模量。每个点代表一个唯一的单个细胞的测量值。通过n = 3个独立实验检查了每个细胞系的15至20个细胞。

第2部分：实时成像和跟踪干细胞从种子表面到理想组织模板内部的侵入
第1部分允许对细胞和细胞构建体进行时空适应的机械测试，而该协议的第2部分着重于细胞在时空中的运动。这提供了一种测量细胞运动的能量或功率（随时间推移使用的能量）的方法。该协议描述了实时成像和跟踪干细胞从种子表面进入理想组织模板内部的过程，并根据细胞代谢情况对其进行跟踪，从而能够评估机电一体化的能量。该方法测量细胞随时间（功率）消耗的代谢能，其是运动细胞覆盖的距离的函数。

程序

骨膜的收获和细胞分离（可使用屠宰场新鲜的羊骨膜完成该过程）
1. 在全关节置换手术后（人类研究伦理委员会（HREC）批准16/203）从人类患者的骨膜外植体组织来源，或从新鲜羊股骨等其他来源（Knothe Tate 等人。，2011； Chang and Knothe Tate 2011和2012； Chang 等人。，2014）。
  注意：在此可行性研究中，PDC捐献者是一名52岁的女性，患有膝盖骨关节炎。
2. 用骨膜升降器将骨膜从下面的骨上抬起，然后立即用双重装袋和冰袋转移到实验室。
3. 要将组织从医院转移到实验室，请将外植体组织保存在标本罐中，然后将其放入装有冰袋的密封运输箱中。
4. 在组织培养实验室中，在生物安全柜内的无菌环境中隔离骨膜。使用骨膜提升器，将骨膜从下面的骨上提起，然后立即将组织块转移到60 x 15 mm的培养皿中。
5. 为了分离PDC（图6），将组织悬浮在培养皿中的3 mg / ml胶原酶II（Gibco）溶液中，并加入含有1％抗生素-抗真菌药（GlutaMAX（Invitrogen）的α-基本培养基（α-MEM））中。（Invitrogen）（以前的协议）过夜（Knothe Tate等人，2011； Chang等人，2014）。
6. 24小时后，在显微镜下观察培养皿上组织周围细胞的存在和生长。PDC的形状为成纤维细胞。可用含有胶原酶II的新鲜培养基代替旧培养基。
7. 当在培养皿上观察到足够的细胞生长时，用3 ml 1x PBS洗涤细胞。然后除去PBS，并加入2 ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA。然后在37°C下孵育细胞5分钟。
8. 当观察到细胞脱落时，添加7 ml标准培养基（含1％AMAB和10％FBS的α-MEM）并将细胞悬液转移至50 ml猎鹰管中。
9. 将试管放入离心机（例如，Thermo Fischer Heraus TM Multifuge TM 离心机）中，并在300 xg < 。
10. 除去上清液，然后将沉淀重悬于10 ml标准培养基中。
11. 为了确定组织的细胞性，取10 µl细胞悬液，并在单独的Eppendorf管中与10 µl 0.4％wt / vol台盼蓝盐溶液混合。在血细胞计数器上准备玻璃盖玻片。将约10 µl的混合物加到血球计数器的小室中。在显微镜下，计数存在于腔室四个象限中的活细胞，以获得每毫升细胞悬液中存在的细胞数。在倒置显微镜下，仅计数亮白色的活细胞。死亡细胞的膜破裂时会呈现蓝色，从而使锥虫蓝染色进入细胞。
12. 要去除未消化的组织，请使用100 µm细胞过滤器将剩余的细胞悬浮液过滤在猎鹰管中。
13. 根据存活细胞的数量，将洗脱的细胞转移到T75培养瓶中以进一步扩增（例如，如果存在1 x 10 6 存活细胞，则细胞悬液可以（分为2个或3个T75烧瓶）。将细胞保持在含有5％CO 2 的培养箱中，温度为37°C。每2-3天更换培养基。
  
  图6.概述方案概述的示意图，第2部分。 A.从接受膝关节置换手术的患者的膝盖组织中分离出骨膜。膝盖组织通常在膝盖的近端或远端有少量骨骼，可以在此处隔离骨膜。可以将组织片放在培养皿上，并悬浮在含有3 mg / ml胶原酶II的培养基中以消化组织。24小时后可以观察到骨膜来源的细胞（PDC）的生长。B.收获膨胀的PDC，并将其接种在厚度1 mm的玻璃底孔中的Matrigel ®上。在预定的时间点，对细胞进行染色，并可以通过共聚焦显微镜观察通过凝胶的迁移。
选择细胞组对照
从Lonza获得的经过验证的BMSC（目录号：PT 2501，批号0000636886）用作对照。
注意：类似于先前发表的研究（Chang et al。，2014），该BMSCs 是从一名44岁的男性供体中分离出来的并在冷冻保存前传代两次。
细胞培养和冷冻保存
1. 在T75烧瓶中培养初级PDC数天，直到80-90％融合为止，然后在使用前将它们扩展并传递1-2次。某些具有早期通过编号的PDC可以冷冻保存以备将来使用。
2. 要传代细胞，请去除培养基并用1x PBS洗涤一次。然后，除去PBS，并加入3 ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA。将烧瓶在37°C的培养箱中放置5分钟，直到观察到细胞脱落。
3. 然后，将7 ml标准培养基添加到烧瓶中，并将细胞悬浮液转移到50 ml猎鹰管中。
4. 以300 x g 离心细胞5分钟。然后，除去上清液，然后将沉淀重悬于10 ml标准培养基中。
5. 对于10份稀释液中的1份，将1毫升该悬浮液转移至新的T75烧瓶中，以进一步扩展，同时添加14毫升标准培养基。
6. 要冷冻保存细胞，请按照第2步中的步骤收获细胞，然后将悬浮液以300 x g g离心5分钟。除去上清液，然后将沉淀重悬于冷冻培养基（含40％FBS和10％二甲基亚砜[DMSO]的α-MEM）中。可以将融合的T75烧瓶分成3个冷冻瓶，每个冷冻瓶的容量为1 ml。
7. 将1 ml细胞悬液在冷冻培养基中转移至冷冻管中，并在-80°C下储存过夜。
8. 将冷冻管转移到-196°C的液氮罐中，以进行长期存储。
9. 在标准培养基中培养所有细胞，然后每2-3天更换培养基。
10. 建立原始培养后，在PDC的第2代进行实验，冷冻保存后在BMSC的第2代进行实验。
基于细胞外基质的水凝胶制备组织模板（ Anlage ）模型
1. 通过用α-MEM，20％FBS和1％AMAB稀释制备浓度为6 mg / ml的Matrigel ®。在制备过程中，将Matrigel ®置于冰上或低于10°C的温度下，因为它会在室温下聚合。
2. 将110 µl如此制备的Matrigel装入玻璃底皿（Cellvis，D35-10-0-N）的孔中，厚度为1.18 mm。
3. 要准备BMSC和PDC进行接种，请用5 ml 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞培养物两次。
4. 用3 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich）孵育细胞5分钟，然后加入7 ml标准培养基以收获细胞。将细胞悬浮液转移到猎鹰管中，并以300 x g 离心5分钟。
5. 将沉淀重悬于10 ml标准培养基中。取10微升此悬浮液，并与10微升0.4％（wt / vol）的台盼蓝混合。将这种混合物的10 µl装入带有盖玻片的血细胞计数器的小室中。计数四个象限上的细胞，以获得每毫升的细胞数。
6. 通过稀释调整细胞数。在装有2 ml FBS还原培养基（包含α-MEM，5％FBS和1％AMAB）的玻璃底培养皿中，将40,000个细胞接种到Matrigel ®上。将细胞放在含有5％CO 2 的培养箱中，置于37°C的温度下，直到指定用于实时成像以评估细胞迁移的预定时间点（在我们的研究中，t = 3天和7天）。每2-3天更换培养基。
活细胞染色
1. 在预定的时间点，用1x PBS仔细洗涤Matrigel /细胞培养物两次。
2. 通过将1 mg的Calcein-AM溶解在0.5 ml DMSO中，制备2 mM的Calcein-AM储备溶液（995 g / mol）（Sigma-Aldrich）。
3. 由此，通过每1 mlα-MEM稀释1 µl钙黄绿素-AM储备液制成2 µM染色液，制成染色液。
4. 用2 ml钙黄绿素-AM溶液在Matrigel上染色细胞，并在黑暗中于37°C孵育30分钟。
5. 除去染色溶液，并用2 ml还原FBS的培养基代替。
6. 成像前，将染色的培养物在黑暗中保持在37°C下。
荧光显微镜和数据分析，用于细胞运动的实时成像
1. 使用荧光显微镜，跟踪各个细胞的时空迁移行为和动力学。我们使用Leica SP8 DLS共聚焦激光扫描显微镜，使用10倍干物镜和488 nm激光对PDC和BMSC的实时迁移进行成像。
2. 使用ImageJ获取光学切片的Z堆栈并进行处理。
3. 使用3D Viewer插件将图像堆栈重建为3D图像，以可视化迁移细胞的动态，或将其压缩为2D图像以观察细胞行为。
4. 通过测量细胞从3D理想组织模板模型的顶部到底部迁移的z位置来量化细胞迁移距离。我们在第3天和第7天在Matrigel的随机位置（n = 6）进行了测量。使用Prism 7软件（GraphPad Software，La Jolla，美国）进行了双向方差分析和Tukey的多重比较测试。平均值±平均值的标准误（SEM），置信区间为99％。
  注意：细胞迁移距离的测量利用Leica SP8共聚焦显微镜的优势，该显微镜可以捕获x，y和z方向的3D样本图像。该显微镜还可以对3D样品进行延时成像（xyzt模式），可以进一步探索该特性以研究细胞迁移的时间方面。为此，应使用更稳定的永久荧光团标记细胞，例如GFP表达构建体。
MTT（噻唑基溴化四氮唑蓝）代谢检测
1. 检索早期传代（直至传代6或更少）中培养的PDC和BMSC。或者，可以从液氮中回收具有早期传代编号的PDC和BMSC。将这些细胞解冻并在标准培养基中生长。解冻后，将细胞传代1-2次，然后用于实验。
2. 用PBS洗涤PDC和BMSC，并在37℃下用3ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化5分钟。观察到细胞脱落后，加入7 ml标准培养基，并将细胞悬浮液转移到Falcon管中。
3. 以1500 rpm或300 x g 的速度离心悬浮液5分钟。然后，除去上清液，然后将沉淀重悬于10 ml标准培养基中。取10 µl细胞悬液，并与10 µl锥虫蓝混合，使用血细胞计数器进行细胞计数。
4. 调节悬浮液中的细胞数，以每孔10,000个细胞的密度（5,000细胞/ cm 2 ）接种到24孔板中，每孔的体积为1 ml。
5. 播种前，通过用含有10％FBS和1％AMAB的标准培养基稀释，以6 mg / ml的浓度制备Matrigel ®。然后，将300微升制备好的Matrigel添加到每个孔中，以覆盖24孔板的孔。
6. 胶衣在室温下聚合后，每个孔中的种子PDC和BMSC的密度为5,000细胞/ cm 2 （n = 4）。在5％CO 2 中，将细胞置于培养箱中的孔板中于37°C。
7. 播种后第3天和第6天检索3D细胞培养物用于MTT分析。
8. 通过在5 ml 1x PBS中稀释5 mg MTT（Sigma-Aldrich）来制备MTT储备溶液。
9. 在8毫升培养基（1：8）中稀释1毫升这种储备溶液。
10. 除去孔板中的培养基，然后用1x PBS洗涤细胞。
11. 向每个孔中加入300μlMTT溶液，并将细胞在黑暗中于37°C孵育1小时。
12. 孵育后，可以观察到紫色的甲maz，这是细胞线粒体脱氢酶代谢MTT的结果。从孔中移出MTT溶液，并使包含紫色甲maz的包被胶溶解在DMSO中（每孔300 µl）。然后将内容物转移到Eppendorf管中。以1500 rpm或300 x g 的速度离心5分钟，以分离凝胶层和液体层。
13. 丢弃液体DMSO层，并再次用DMSO溶解凝胶。
14. 于300 x g 离心以将甲maz溶解在凝胶中，从而使凝胶成为沉淀。
15. 将包含甲an的上层液体转移至孔板，并使用酶标仪（Perkin Elmer Victor 3，570 nm滤光片）读取吸光度。

数据分析

代表性数据和协议验证
在模型组织模板中，观察到PDC的迁移明显快于BMSC，在培养的第3天和第7天分别覆盖了1.4倍和1.5倍的距离（ P ≤0.01）（图7A）。在迁移的PDC和BMSC的模式以及细胞形态和数量上的相对差异在质量上也很明显。虽然PDC表现出长的细胞突起以在Matrigel ®内形成广泛的网络，但迁移的BMSC倾向于形成分散在整个Matrigel中的确定的细胞簇。从第3天到第7天，PDC迁移和形成网络的数量明显增加（图7B PDC B ，PDC C 和BMSC B ，BMSC < sub> C ）与BMSC相比，而BMSC簇的大小在同一时期有所增加（图7B BMSC B 和BMSC C ）。在培养3天和7天后，PDC和BMSC表现出相似的代谢活性（图8）。

图7.人类PDC和BMSC在EMT模型中表现出明显的迁移行为和动力学。 A.在模型的中试测试中，双向方差分析（n = 6）表明单个PDC患者在第3天和第7天进一步迁移并显示出高于单个供体的BMSC迁移率。误差线表示平均值（SEM）的标准误差，星号（*）表示在 P ≤0.01。B和C。第3天的（B）和第7天的（C）的PDC和BMSC的代表性堆栈图像。单个图像代表两种细胞类型所覆盖的距离的不同3D视图，以及细胞行为和分布整个Matrigel ®的厚度。

图8.以MTT吸光度定量并相对于对照的PDC和BMSC的增殖。 PDC和BMSC在培养的10天中显示出相当数量的细胞增加，这表明PDC和BMSC的增殖速率相当。两个细胞系。在第0、3、7或10天，PDC或BMSC的MTT吸光度之间没有观察到统计学显着差异（显着性定义为 P <0.05）。

讨论
为了探查机制，即等同于基因组的机制，从而揭示干细胞（SC）的局部机械环境，SC机械适应和谱系承诺之间的关系，我们开发并测试了两个集成的细胞和组织模型培养和成像平台。我们的目标是开发和测试这两个模型平台，以便能够在组织和细胞长度尺度上以及在模拟生理细胞和组织环境的情况下对机械适应和机电工程学进行定量研究（Sorkin et al。，2004年）。）。首先，通过同时实施核和细胞骨架标记，我们整合了以前在单独应用中使用的方法，成功地跟踪了单个贴壁模型胚胎鼠间充质干细胞内的细胞和核体积和形状变化以及细胞骨架肌动蛋白和微管蛋白的结构适应性。然后，在一个平台上开发了组织模板（ Anlage ）模型，该模型可使单层种子细胞进入包含组织模板的三维细胞外基质蛋白。该模型已成功使用包括PDC和BMSC在内的人间充质干细胞进行了测试，并显示出令人鼓舞的初步结果，从而可以比较地衡量运动速率和方向。该模型有助于优化和扩展，以模拟各种研究小组感兴趣的EMT-METs组织和细胞环境。尽管尚未在相关的细胞模型中一起测试这两个模型系统，但这样做将为机械生物学中新兴结构和功能的跨尺度成像提供一个优雅的平台。
＆nbsp; 考虑到单细胞力学生物学的时空复杂性，迫切需要量化生物力学刺激的作用。必须测量物理力对细胞核形状，细胞体积，肌动蛋白丝和微管蛋白的时空组织以及与谱系承诺有关的基因表达的影响；先前在固定细胞和活细胞中均已进行过测量（McBride和Knothe Tate，2008； McBride 等人，2008； Song 等人，2010、2012和2013； Chang和Knothe Tate，2011）。尽管已优化了不同的协议，并分别用于在活细胞中对肌动蛋白和微管进行成像（Wang等，2003； Suresh，2007； Na等，2008）； Mendez等人，2014年），这是我们所知的第一个协议，该协议已展示了活细胞中肌动蛋白，微管蛋白和细胞核的同步，多重成像。该协议在活干细胞上的应用使肌动蛋白和微管蛋白，细胞骨架适应以及细胞核体积和形状的变化能够同时进行多色延时成像。该协议适用于在受控制的机械刺激过程中进行细胞机械适应的延时研究，例如在测试过程中对生物材料进行机械测试（适应结构和/或机械特性和/或生物学表型）。该协议已针对干细胞和神经母细胞瘤细胞进行了测试和优化，证明其可用于不同类型的细胞。此外，该协议可用于以前所未有的实时方式对迁移细胞中肌动蛋白和微管蛋白的组织进行成像。
＆nbsp; 从发育过程中的组织模板到产后组织愈合，可以进一步调整模型组织 Analage ，使其包含特定组织典型的细胞外基质成分。可以磨练实验设计以包括特定于感兴趣的机械途径的分子梯度。在这项首次可行性研究中，特别令人感兴趣的是，我们想确定是否可以在标准化的背景下测量侵入率，将其作为再生医学和常驻干细胞群体内在治愈能力中目前未被充分认识的因素（Yu et al。，2017； Ni et al。，2019）。该模型系统也非常适合于未来的研究，旨在阐明对干细胞生态位静态的调控（Yu等，2017; Ni等，2019）。 br /> ＆nbsp; 系统生物学方法与工程创新相结合的方法正越来越多地用于跨越不同组织，器官，生物体甚至王国的常见范式的量化和机械解释。在机电工程学中，细胞形状和命运是形式和功能的内在表达（Song等，2012和2013； Wang等，2014； Knothe Tate等）等，2011年和2016年）。通过多尺度成像和力学建模的耦合，并在SC适应和区分时对它们进行力学测试，可能有可能开始制定第一生物学定律，为应力分布之间的关系建立定量基础和预测模型。细胞和细胞命运的展现。

与其他方法的比较
大量研究使用了不同的方案来可视化活细胞中的细胞骨架解聚/聚合，尤其是肌动蛋白丝。一些人将荧光标记的肌动蛋白直接注射到活细胞中（Riedl et al。，2008和2010）。另外，通过肌动蛋白-GFP融合或通过荧光标记的肌动蛋白相关蛋白直接观察肌动蛋白动力学的成功有限，这主要是由于标记的蛋白干扰了肌动蛋白的聚合和解聚过程，从而影响了长丝的自然行为。据报道，由于未结合的G-肌动蛋白，荧光背景过多也是一个主要问题（Riedl等人，2008年和2010年）。尽管有这些限制，方法已经开发成功的标签肌动蛋白丝没有任何显著影响肌动蛋白动力学和组件（里德尔的等的，2008; Lukinavi č 。IUS的等的，2014）。新技术可以在活细胞中以高分辨率对肌动蛋白丝和微管蛋白进行成像。然而，肌动蛋白丝和微管蛋白的同时成像尚未被我们所知。在我们以前的研究中，我们已经开发了一种活细胞成像技术来观察干细胞分化过程中以及近实时地细胞骨架的时空组织和细胞机械适应（Zimmermann和Knothe Tate，2011； Chang和Knothe Tate，2011）。但是，这些实验是分别对肌动蛋白和微管蛋白以及细胞及其细胞核进行的。

限制和上下文
已证明BacMam方案对于两种细胞系（模型鼠鼠间充质干细胞系和永生化成神经细胞瘤细胞）是有效的，但对绵羊PDCs的转导无效[未发表的数据，MechBio Team]。类似地，尽管组织模板模型平台与人PDC和BMSC很好地结合在一起，但还需要针对其他细胞类型和细胞外基质成分进行验证。尽管每项改进都需要额外的时间投入，但以当前形式介绍这些方法是为了简化流程。此外，模型系统需要对感兴趣的不同系统和/或单元类型进行附加验证。
＆nbsp; 本手稿中介绍的两种模型系统都代表了活生物体中实际干细胞生物学原位的理想化。尽管如此，它们为量化细胞内适应性反应提供了有价值的工具，以响应受控的机械提示和干细胞侵入的实时成像。从工程的角度来看，模型平台提供了定义的控制量，在其中设定了边界和初始条件，因此为研究人员所知，从而能够使用传统的工程问题求解规则对机电工程进行定量的时空研究，并实现控制方程感兴趣的结果度量。该系统旨在在工程学，系统生物学和细胞生物学方法之间相交，从而能够在同一系统中同时进行机械特性和生物学行为的机械研究。该平台可专门用于类似于微流体的各种生物学或生理学感兴趣的系统（Shemesh等人，2015年）和片上器官方法，但专门设计用于模拟基本事件，例如进入或远离组织模板（如MET-EMT）的进入，这些模板被假定在干细胞命运决定中起关键作用。

结论
干细胞固有的适应机械刺激能力的机制以及机械适应在血统承诺中的作用尚不清楚。对SC机械适应的理解是在产前发育，产后伤口愈合和组织工程过程中破译血统承诺的关键。细胞的形状和命运是组织最基本的建筑要素中形式和功能的固有表达。正如实验和理论力学的发展（包括可视化和测量结构元件的表面和内部的位移和力的工具）导致对材料力学的基本了解一样，用于细胞运动动态成像的机械学工具的开发也适用于细胞机械适应预期将定义摩尔定律承诺圆的等价物（在本文中称为映射力学图，图1）。

致谢

作者要感谢生物医学工程研究生院MechBio团队和基础设施的合作，以及Mark Wainwright分析中心的合作，特别是新南威尔士大学的生物医学成像设施。

作者贡献
IJ用MLKT改进并测试了多路活细胞骨架跟踪方法，并在RW的成像建议下进行了相关实验。VP和MC在MLKT和KP和RW的指导下开发了组织模板模型系统，并利用FT的成像专业知识进行了相关实验。我们感激地感谢MechBio小组成员和合作者及其出版物所开发的广泛的先前方法和规程，并以此为基础对当前规程进行了开发和测试（Sorkin et al。，2004； Anderson 等人，，2006； 2007a和2007b； Knothe Tate等，2008； 2010和2016； McBride和Knothe Tate，2008； McBride等。，2008； Song等，2010； 2012和2013； Chang和Knothe Tate，2011； Zimmerman和Knothe Tate，2011； Evans等，2013； Erics等。贾利莲（Jalilian）等人，，2015年；普特拉（emtra）等人，，2019年）。
＆nbsp; 如上所述，该协议的某些部分已用于以前的出版物中（Putra 等，2019; Ng等，2019）。具有肌动蛋白和微管蛋白标签控制负荷的方案也分别在以前的出版物中使用（Zimmerman和Knothe Tate，2011； Chang和Knothe Tate，2011）。

利益争夺

在全面披露的情况下，使用Knothe Tate教授的MechBio团队开发的成像和灌注室进行了核形状和体积变化以及细胞骨架适应性的实时成像研究，随后通过与哈佛仪器，华纳仪器（Warner Instruments）的非专有许可协议进行了商业化（ https://www.warneronline.com/proflow-shear-flow-chamber -pfc-1 ）。研究设计和结果无需经过华纳仪器公司的咨询或参与即可进行，其他灌注室和/或基于微流控的平台可通过这些方案实施（Shemesh et al。，2015）。
＆nbsp; 这些研究是在美国国立卫生研究院（DD和MLKT），美国国立卫生研究院培训补助金（收件人：SM-G，MJS），美国国立科学基金会（MLKT），澳大利亚国立卫生研究院的慷慨支持下得以实现的以及医学研究理事会（MLKT），Paul Trainor基金会（MLKT）以及UNSW的金银星奖助学金，用于“澳大利亚研究理事会”资助计划的“近乎错过的资助”。

伦理

新南威尔士大学人类伦理委员会批准了上述实验。获得所有受试者的知情同意。

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