材料和试剂

铝箔
吸管
JA-17或JA-19离心管（Beckman Coulter，目录号：357000-357007）
JA-17或JA-19转子（Beckman Coulter，目录号：369691，325632）
SW28超透明管（25 x 89毫米，Beckman Coulter，目录号344058）
SW40超透明管（14 x 95 mm，Beckman Coulter，货号：344060）
细胞培养瓶175 cm 2 ，75 cm 2 （来自任何合格的供应商）
6和12孔细胞培养板（来自任何合格的供应商）
细胞刮板（SARSTEDT，目录号：83.1830）
允许细胞的例子
1. BHK-21细胞系（婴儿仓鼠肾脏，ATCC ® CCL-10 TM ）
2. Vero细胞系（非洲绿猴肾，ATCC ® CCL-81 TM ）＆nbsp;
3. HeLa（人类宫颈癌，ATCC ® CCL-2 TM ）
HSV-1（17 + ）Lox（Snijder等，2012）或HSV-1株17 + CMV-GFP / UL43（ BioVex； Coffin等人，1996年和1998年）
在这些报告株中，由CMV启动子控制的GFP表达盒已插入到基因座UL55和UL56之间或UL43基因座中。HSV-1属于临床分离株的生物安全级别L2，而基因工程菌株属于S2，因此任何工作都必须在经过认证和政府注册的L2或S2实验室中进行。
胎牛血清（FCS，用于生产病毒的细胞系的最佳批次；例如，例如，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号：F7524）
牛血清白蛋白组分V（BSA，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号：10735094001）
牛血清白蛋白，级分V，pH 7.0（摩ri座科学公司，目录号：BSA-1S）
合并的人免疫球蛋白G（IgG，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号：＃I4506）
α-HSV-gD抗体（小鼠单克隆，圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-21719）
山羊α-小鼠IgG-碱性磷酸酶二抗（目录号：115-055-166； Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）
DMEM细胞培养基（Lonza，目录号：AMF4300）
RPMI 1640细胞培养基（Lonza，目录号：12-167F）
PBS（Lonza，目录号：17-512F）
不依赖CO 2 的培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：18045-054）
HEPES（来自任何合格的供应商）
青霉素-链霉素混合物（来自任何合格的供应商）
L-谷氨酰胺（来自任何合格的供应商）
胰蛋白酶-EDTA（来自任何合格的供应商）
MEM非必需氨基酸（来自任何合格的供应商）
Nycodenz（Axis-Shield PoC，目录号：1002424）
甲醇（来自任何合格的供应商）
乙醇（来自任何合格的供应商）
CaCl 2 （来自任何合格的供应商）
NaOH（来自任何合格的供应商）
Tris（来自任何合格的供应商）
盐酸（pH 9.5）
NaCl（来自任何合格的供应商）
2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号：M5287）
台盼蓝溶液0.4％（来自任何合格的供应商）
液态N 2
碧绿的水
DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole，来自任何合格的供应商）
NP-40（来自任何合格的供应商）
DMSO（二甲亚砜，来自任何合格的供应商）
硝基蓝四唑氯化物（来自任何合格的供应商）
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（来自任何合格的供应商）
MgCl 2 （来自任何合格的供应商）
细胞培养基（见食谱）
福尔马林（请参阅食谱）
TSM（请参阅食谱）
接种培养基（1）（请参阅食谱）
接种培养基（2）（请参阅食谱）
MNT缓冲区（请参阅食谱）
紫水晶（来自任何合格的供应商，请参阅食谱）
多聚甲醛（PFA；来自任何合格的供应商，请参见食谱）
核染色原液（请参阅食谱）

设备

Beckman Optima L-90K超速离心机（Beckman Coulter，目录号：COL11F05）
Megafuge 2.0 RS（Heraeus，目录号：75015505）
摇摆平台wt 15（Biometra，目录号：042-590）
细胞成像系统（ eg ，EVOS FL AMG / Life Technologies，目录号：AMF4300）
Perfect Spin 24R冷冻微量离心机（Peqlab，目录号：C2500R-PL-230）
HERAcell 150i CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026282）
Neubauer室（来自任何合格的供应商）
超声波浴Sonorex RK 100（Bandelin Elektronik GmbH＆amp; Co.，目录号：66253）
杯声发生器Sonopuls UW 3200（Bandelin Elektronik GmbH＆amp; Co.，目录号：364000064495003）
Biocomp梯度主模型106（BioComp Instruments，目录号：613; http://biocompinstruments.com/our -approach / gradient-forming ）通风柜

程序

病毒传播
1. 接种前三天，将BHK-21细胞接种到30 ml细胞培养基（10％FCS；配方1）中的五个细胞培养瓶（T 175 ）中，两天后融合（= 1天）感染之前）。
2. 接种前一天，将约1：3的BHK-21细胞在30 ml新鲜细胞培养基（10％FCS）中分成16个细胞培养瓶（T 175 ），以达到约90至95次日合计百分比。或者，在接种前三天以较低的细胞密度（1:10至1:20）接种种子细胞，以在接种当天达到约90％至95％的融合度。但是，为了促进达到适当的细胞密度，我们建议在接种前一天以更高的密度播种细胞。
  注意：使用15个细胞培养瓶进行病毒接种，并使用一个细胞培养瓶确定细胞密度，以计算HSV-1接种物的量。后一个烧瓶可用于进一步的细胞培养。
  1. 接种前一天，吸出细胞培养基并用10 ml PBS /细胞培养瓶洗涤细胞。
  2. 吸出PBS，立即加入3 ml的胰蛋白酶/ EDTA，确保在细胞层上完全分布，并在37°C下孵育3-4分钟。
  3. 同时，准备16个T 175 细胞培养瓶，每个培养瓶包含27 ml预热的细胞培养基。
  4. 显微镜下验证细胞的胰蛋白酶消化。当细胞从细胞培养瓶底部脱离时，加入7 ml细胞培养基/烧瓶，并通过上下移液重悬细胞。
  5. 将来自五个细胞培养瓶中每一个的10 ml细胞悬液汇集到一个50 ml管中。
  6. 轻轻地将3 ml细胞悬液添加到16个细胞培养瓶中，使最终体积达到30 ml /瓶。
  7. 通过垂直，水平和对角线轻轻移动细胞培养瓶来混合细胞悬液。
  8. 将细胞培养瓶放入37°C和5％CO 2 的加湿培养箱中。
    注意：如果培养箱的架子不平坦，请将细胞培养瓶放在平坦的工作台上10分钟，以实现更均匀的细胞接种。不要将细胞放在培养箱外面太久，因为在没有其他缓冲物质或CO 2 。
  9. 生长细胞一天，直到达到约90％到95％的融合度为止（图1）。
    注意：最佳培养细胞的密度会影响病毒产量，因为亚融合细胞比融合细胞更易感染HSV-1。如果以低密度接种，则某些细胞系趋向于生长成小的融合细胞胰岛。由于主要的HSV-1受体nectin-1被隔离在细胞与细胞之间的粘附接触中，并且无法与病毒结合（Schelhaas 等。，2003； Marozin 等。，2004； Snijder 等。，2012）。
    
    图1。用于HSV-1接种的亚汇合BHK-21细胞。比例尺= 0.4毫米。
3. 在病毒繁殖的当天，分别用HSV-1株或突变株接种BHK-21细胞。
  1. 按照步骤A2b中的描述，用10 ml PBS洗涤一个T 175 细胞培养瓶，吸出，并用3 ml胰蛋白酶/ EDTA胰蛋白酶消化。
  2. 将细胞重悬于25 ml培养基中，并使用Neubauer室或其他方法对细胞计数。
    注意：通常，每个T 175 细胞培养瓶的细胞量约为1.5 x 10 7 到3 x 10 7 单元格。将这些细胞用于进一步的细胞培养。
  3. 使用以下公式计算感染15个T 175 细胞培养瓶（感染复数（MOI）为0.01 pfu /细胞）所需的第2代病毒库存量：
    公式：
    
    计算示例：储备量HSV-1 p2的滴度：6 x 10 8 pfu / ml = 6 x 10 5 pfu / µl
    MOI为0.01 pfu /细胞；40个带有2 x 10 7 细胞/瓶的烧瓶
  4. 通过将计算的病毒量稀释到补充有20 mM HEPES的RPMI 1640中（使用5 ml /瓶），为所有烧瓶准备一个接种物。或者，在补充有0.1％（w / v）细胞培养级BSA的CO 2 无关培养基中稀释计算的病毒（使用5 ml /瓶）。两种培养基在随后的CO 2 培养箱外部细胞接种过程中均具有稳定的pH。
    注意：由于CO 2 是气体，因此会从CO 2 培养箱，因此将变得更加基础。虽然细胞可以在碱性较强的培养基中短期孵育后迅速恢复，但HSV-1对较高的pH值非常敏感。在给定的pH值7.6下，给定病毒悬浮液的滴度会明显下降。
  5. 从每个细胞培养瓶中收获细胞培养基。
    注意：为了降低制备病毒的成本，可以将从培养瓶中取出的细胞培养基合并到无菌培养瓶中，置于37°C的培养箱中，并在接种后添加到BHK-21细胞中。
  6. 感染前，用10 ml /细胞培养瓶PBS洗涤细胞一次，吸出，并立即添加5 ml接种物。
    注意：同时清洗并感染多达五个细胞培养瓶。
  7. 在室温（RT）的缓慢移动的摇摆平台上接种细胞1小时。确保细胞完全被接种物覆盖。
  8. 1小时后，添加25 ml /瓶（保存的）细胞培养基。
  9. 将感染HSV-1的BHK-21细胞在37°C和5％CO 2 中孵育三到四天。
4. 收获细胞外HSV-1病毒体。
  注意：每天在显微镜下监视感染的细胞（图2）。在我们手中，收获的时间点至关重要，并且可以从3到4 dpi不等。为了获得高品质的高质量HSV-1细胞外病毒体，当80％至90％的细胞表现出细胞病变作用时，即细胞被弄圆并从烧瓶底部分离时，收获细胞培养上清液。如果过早收获HSV-1，则细胞外病毒的产量会降低。如果HSV-1的采集时间太晚，由于细胞碎片，病毒库的质量将降低。特别是释放的DNA / RNA会交联许多病毒颗粒，从而妨碍聚集的病毒粒子充分重悬浮（请参阅步骤A4d）。
  
  图2.感染HSV-1株17的BHK-21细胞 + CMV-GFP / UL43在1 dpi时（上图））和4 dpi（下面板）。比例尺= 0.4毫米。
  1. 在三或四dpi时，通过敲击细胞培养瓶来分离细胞，从底部冲洗剩余的细胞，然后将细胞-病毒悬浮液收集在50 ml试管中。
  2. 为了沉淀细胞，在1,900-2,850 x g 和4°C下离心10分钟。
  3. 沉积的感染细胞可以随后用于分离核衣壳（Wolfstein等，2006； Bucks等，2007； Radke等。 em>，2010），或通过冻融循环从细胞质中感染的病毒颗粒。为此，将细胞沉淀重悬在适当体积的MNT缓冲液（配方8）中，在液态N 2 中冷冻，并在-80°C下保存。
  4. 将含有HSV-1病毒体的上清液转移至预冷的离心管中。在JA-17转子中以4°C和17,000 rpm（最大39,813 xg ）离心2 h，或者在19型转子中以4°C和12,000 rpm（最大21,500 xg ）持续90分钟。虽然第一个离心设置保证了更高的颗粒状病毒体产量，但是后一个离心分离却使病毒颗粒更容易和更均匀地重悬为单个病毒体。
    注意：离心后，在离心管的外部标记沉淀物的位置。
  5. 将离心管放在冰上，小心吸出上清液，并小心地加入200至500μl/管MNT缓冲液以重悬沉淀。
    注意：我们建议使用MNT缓冲液代替PBS来储存HSV-1储备液，因为磷酸钠盐在冷却时会沉淀，导致pH值发生急剧变化。MES和Tris-HCl在冷冻过程中保持更稳定的pH值（Gómez 等人。，2001）。
  6. 倾斜试管，用MNT缓冲液完全覆盖病毒沉淀，并使病毒沉淀在4°C过夜膨胀。或者，通过移液将沉淀重悬在MNT缓冲液中，但避免形成泡沫或气泡。将重悬的沉淀转移至第二天进行超声处理，移至涂有BSA（馏分V或细胞培养级）的新鲜玻璃小瓶中，以防止由于与玻璃表面的非特异性结合而导致颗粒损失。用石蜡膜紧密密封小瓶，并使病毒颗粒在4°C膨胀24至36 h。该玻璃小瓶将在第二天用于超声处理（请参阅步骤A5b）。
5. 重悬病毒悬浮液。
  1. 在第二天，合并和/或进一步重悬中等沉淀。在冰上工作，避免产生泡沫和气泡。
  2. 我们建议在装有冰水的超声浴中将培养基沉淀进一步均质（脉冲3次30 s，中间间隔30 s）。如有必要，重复步骤A5b 2至3次，直到病毒悬浮液看起来均匀为止。
  3. 将重悬的中等颗粒病毒分装，以小体积（25-100μl，取决于计划的实验）存储在无菌螺帽小瓶中，在液体N 2 中速冻，并在-80°C下存储C。要准备梯度纯化的病毒原种，请跳过此步骤，直接进行纯化操作（请参阅步骤A6）。
    注意：避免重复进行病毒库的冻融循环。始终将库存储存在-80°C，因为它们在-20°C时会不断失去传染性。分装的小瓶应在液态N 2 中快速速冻，快速融化并保持在0至4°C直至使用。
6. 梯度纯化HSV-1库存。
  用于病毒进入或动物实验的病毒原种应进行梯度纯化，以去除可能在感染过程中合成的残留细胞碎片和细胞因子。可以使用蔗糖，Ficoll，nycodenz或碘克沙醇（Opti-prep）梯度纯化HSV-1病毒体（Sathananthan等，1997； Sodeik等，1997； Saltikhan等人，1997）。 Döhner等人，2006年； Marconi和Manservigi，2014年）。在相同密度下，Ficoll，nycodenz和碘克沙醇溶液的渗透压低于蔗糖溶液。当HSV-1病毒体进入蔗糖沉降梯度时，由于在较高的蔗糖浓度下渗透压升高，它们会失水，更重要的是，从其蔗糖级分稀释到MNT或PBS缓冲液中后，它们会突然膨胀。渗透压的这种变化损害了包膜病毒体的物理完整性。因此，我们开发了使用nycodenz进行HSV-1储备液梯度纯化的方案（Döhner et al。，2006）。
  1. 准备线性nycodenz梯度。移液补充了10％nycodenz的MNT缓冲液到超透明试管中，直至一半高度和标签填充水平。使用连接到长针上的注射器小心地在MNT中用40％的nycodenz覆盖，直到相间处于半满线（视频1）。
    
    视频1.逐步梯度制备过程中界面形成的可视化。该试管中含有10％的蔗糖（透明）。我们用注射器在40％的蔗糖（蓝色）上铺垫。为了更好地观察中间相的形成，我们在此处用蓝色染料对40％的蔗糖溶液进行了染色。如果准备用于病毒制备的梯度，则不添加任何染料。至关重要的是，要平稳地添加重溶液，而又不要将针头压到管子的底部，也不要太用力地推动柱塞。10％和40％溶液之间的中间相形成并向上迁移。
  2. 如果使用Biocomp梯度仪，请执行以下操作：用相应的盖子封闭试管，调平梯度仪（请参见手册），并使用供应商提供的参数准备线性梯度。将具有渐变梯度的试管放入试管支架中，将试管支架放在梯度母版的磁性平台上并启动程序。平台将倾斜然后旋转。倾斜角（°），速度（rpm）和旋转持续时间（min：s）由用户指定，如下表（表1）所示。为了获得更好的可视化效果，请访问https://www.youtube.com/watch?v=wizxYB5brz8。
    
    表1.梯度主控件的离心设置
    <身体> cellspacing="“0”" cellpadding="“2”" bordercolor="“＃000000”" border="“1”">
    转子*
    
    步骤
    
    时间[min：s]
    
    角度
    
    速度
    
    温度
    
    SW28
    
    1个
    
    7:00
    
    50度
    
    25转
    
    逆转录
    
    2
    
    0:15
    
    80°
    
    15转
    
    逆转录
    
    SW40
    
    1个
    
    1:11
    
    80°
    
    25转
    
    逆转录 * SW28用于较大体积，SW40用于中等体积。
  3. 替代过程：按照步骤A6a所述准备两步渐变，并紧紧密封。要通过扩散获得线性梯度，请轻轻地将管水平放置，稳定并在室温下保持90分钟。
  4. 如有必要，请从梯度顶部丢弃相应的样品量。随后，分别用1 ml和2-3 ml重悬浮的培养基沉淀物覆盖梯度，分别用于SW40和SW28梯度。
    注意：避免梯度过载。＆nbsp;
  5. 在4°C下在预冷的超速离心机（ eg ，Beckman Optima L-90K）中离心。使用SW28转子时，以20,000 rpm（最大72,128 xg ）离心10 5 min，使用SW40转子时，以20,000 rpm（最大71,142 xg ）120分钟。
    注意：如果使用其他设置或转子，请重新计算速度和时间。根据要进行梯度纯化的病毒悬浮液的体积选择合适的转子。
  6. 将光散射病毒条带标记在渐变中间的下方（图3）。移去上层梯度溶液，并用黄色的移液管收集光散射带，而不会干扰梯度。我们从一管SW28桶中收获1至4 ml梯度纯化病毒。通过移液将收集到的带子转移到一个小瓶中，轻轻地移至一个小瓶中，在带有O形环的高压灭菌0.5 ml螺帽中准备一次性使用的等分试样（10到100 µl，取决于目的），速冻。在液氮中，并储存在-80°C。给定的体积取决于已分层放置在梯度上的体积，以及目标是针对细胞进入实验的高浓缩原液，还是针对以较低MOI进行的实验的完整产量。
  7. 噬菌斑测定
    注意：我们建议为每种病毒库复制技术。在单步生长动力学中比较不同病毒（例如，亲本与突变体或临床分离株）时，应并行进行噬菌斑测定，包括三个生物学重复和两个技术重复样本。
    1. 准备一个装有融合Vero细胞的T75细胞培养瓶，用于6孔或12孔板噬斑测定。
      注意：一个装有融合Vero细胞的T75细胞培养瓶足以接种两个6孔板或三个12孔板。
    2. 接种前一天，将一个融合的T75细胞培养瓶中的Vero细胞以3 x 10 5 到5 x 10 5 细胞/孔的浓度接种到一个6孔板中，或者以每孔1.5 x 10 5 到2.5 x 10 5 细胞的12孔板在第二天达到汇合。
      1. 加入5 ml PBS，轻轻洗涤细胞层并吸出PBS。
      2. 立即加入1.5 ml的胰蛋白酶/ EDTA，确保在整个细胞层上均匀分布，并在37°C下孵育5分钟。
      3. 显微镜下监控细胞舍入。细胞完全分离后，加入8.5 ml预热的培养基，并通过上下移液重悬细胞。
      4. 使用Neubauer室或其他方法对细胞进行计数。
      5. 准备适当体积的培养基，使最终浓度达到0.5 x 10 6 细胞/ ml，然后将2 ml / 6孔或1 ml / 12孔转移到每个孔中。
      6. 将Vero细胞在37°C和5％CO 2 中孵育16至20小时以达到融合。
    3. 在接种当天，准备要滴定的病毒原液的连续10倍稀释液。
      1. 准备30 ml接种培养基（配方6和7）：RPMI 1640补充20 mM HEPES和0.1％（w / v）BSA或CO 2 独立培养基补充0.1％（w / v））细胞培养级BSA。两种培养基都可以在摇动平台上接种CO 2 培养箱外部的细胞时保持稳定的pH值。
        注意：对于未鉴定的病毒原种，请使用10-2至10-9的稀释液（请参见图4）。对于生长曲线的未表征样品，请使用10 -2 到10 -6 范围的稀释液。如果先前的实验允许估算滴度，则只需铺板较少的稀释液即可。不要忘记未感染的模拟控件。
      2. 解冻病毒原液，并通过将10μl原液添加到990μl接种培养基中并充分涡旋来制备10-2稀释液。
      3. 通过用新鲜的移液器吸头将130μl的10-2稀释液转移到1,170μl的接种培养基中来制备10-3稀释液。涡流。
      4. 完成此系列稀释，直至达到所需的最终稀释度（参见图4）。
        
        图4.用于斑块测定的系列稀释液的移液方案
      5. 用1.5 ml /孔的接种培养基轻轻洗一次Vero细胞。
      6. 将10 -5 的500μl/ 6孔或400μl/ 12孔添加到10 -9 稀释液中以滴定病毒原液或10 - 对于到达指定孔的生长曲线样品，将其稀释度为2 到10 -6 。以单样品或一式两份进行，并在室温轻轻摇动的平台上孵育细胞1小时。
      7. 在1 hpi时，吸出接种物并添加2 ml / 6孔或800μl/ 12孔新鲜补充了合并的人IgG的培养基。
        注意：由于中和抗体的效价随人群的不同而不同，我们通过用合并的人IgG储备液的2倍系列稀释液对标准HSV-1储备液进行预处理来滴定每一批。大约10至20μg/ ml的IgG浓度通常足以中和稀释用于噬菌斑测定的病毒原液。它可能需要更高浓度的人IgG，才能以更高的MOI中和同步感染。
      8. 在37°C和5％CO 2 下孵育细胞三天。
    4. 在2 dpi下，用显微镜分析斑块形成（图5）。荧光显微镜可用于监测感染表达荧光蛋白的菌株的细胞。
      
      图5.在2 dpi（左）或3 dpi（右）的Vero细胞单层中的HSV-1斑块。比例尺= 0.4毫米。
    5. 变体1：在3 dpi下，用结晶紫将细胞染色。
      1. 从每个孔中吸出培养基，并在室温下用1 ml / 6孔或400μl/ 12孔的9％福尔马林（配方3）固定细胞。或者，使用预冷（-20°C）100％甲醇将细胞固定3分钟。
        注意：小心地在孔壁上添加固定剂，以避免细胞脱离。
      2. 吸出固定液，如果使用甲醇固定，则将孔风干至少5-10分钟。加入1 ml / 6孔或400μl/ 12孔的0.1％（w / v）结晶紫（配方4）染色溶液，并在室温下孵育10分钟。
      3. 吸出染色溶液，用1 ml /孔Aqua bidest洗涤两次，然后干燥（图6）。
      图6.结晶紫染色的HSV-1噬菌斑测定。将在12孔板中培养的病毒细胞接种10倍系列的病毒悬浮液稀释液，固定在3 dpi并用结晶紫染色。
    6. 变体2，用于6孔板中的小噬菌斑：在2 dpi时，用针对HSV-1包膜糖蛋白D的抗体标记受感染的细胞（gD；Döhner等，2002）。
      1. 从每个孔中吸出培养基，并在室温下用-20°C预冷的甲醇固定细胞3分钟。
        注意：小心地在孔壁上添加固定剂，以避免细胞脱离。
      2. 吸出固定液，风干细胞，并在室温缓慢摇动的平台上与0.5 ml /孔补充有10％FCS（PBS / FCS）的PBS孵育30分钟，以阻断非特异性蛋白质结合。
      3. 用在PBS / FCS中稀释的0.5 ml /孔的一抗α-gD抗体代替PBS / FCS，并在室温下在摇动平台上孵育30分钟。我们使用当前批次的抗gD抗体（mAb DL6）以1：2000的稀释度稀释。由于供应商和批次之间的抗体浓度不同，因此我们建议使用1:50至1：5,000的稀释度滴定每个批次。
      4. 去除一抗并用2 ml /孔PBS洗涤细胞3次，每次10分钟。
      5. 用0.5 ml /孔的次级山羊α-小鼠IgG替代PBS，并与PBS / FCS中的碱性磷酸酶偶联，并在室温下在摇摆平台上孵育30分钟。我们使用当前批次的碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG抗体，稀释比例为1：2000。由于供应商和批次之间的抗体浓度各不相同，因此我们建议使用1：500至1：10,000的稀释度对每批次进行滴定。
      6. 除去二抗，用2 ml /孔PBS洗涤10次，每次3次，然后用2 ml /孔TSM（配方5）洗涤2次，每次5分钟。
      7. 在TSM缓冲液中用0.5 ml /孔的0.2 mM硝化蓝氮四唑氯化物和0.8 mM 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯代替。用铝箔纸避光，并在室温下的摇摆平台上孵育，直到出现深色斑块。
      8. 更换染色溶液，并用Aqua bidest冲洗孔两次，以通过降低pH值并除去底物来终止碱性磷酸酶反应。
      9. 吸水并风干板（图7）。
      图7.α-gD染色的HSV-1噬菌斑测定。用连续稀释的HSV-1悬浮液接种Vero细胞并感染3天。固定细胞，然后用α-gD抗体标记，然后用第二碱性磷酸酶抗体标记。
    7. 计算6孔中包含约20至50个噬菌斑或12孔中包含10至40个噬菌斑的孔中的噬菌斑。
      注意：在斑块过多的孔中，滴度被低估了，因为融合斑块仅记录为一块斑块。相反，在没有斑块的孔中，滴度被高估了，因为它们可能在细胞单层中包含不规则性，这可能被错误地解释为斑块。
    8. 使用以下公式计算滴定度，以pfu / ml为单位：
      6孔板：
      
      12孔板：
      
      计算示例：使用0.5 ml接种物，一式两份在6孔板中滴定。
      假设：用接种物的10-8稀释液处理过的孔显示出的斑块范围为20至50，即28和32。
  8. 单步生长动力学
    注：一次测量至少三个生物学独立实验的样品要比一次测量一次的样品好。我们通常会重复测量至少三个独立实验中的样本。
    1. 感染前一天，将种子易感细胞（ eg ，Vero）以0.25 x 10 6 细胞/孔的浓度放入2毫升培养基中的6孔板中，并于37℃孵育°C和5％CO 2 放置16至20小时。
      注意：接种时，细胞应达到90％至95％的融合度，以实现单步生长动力学。对于每种病毒分离株，病毒突变体，细胞系和时间点，都需要一个孔来监视病毒的传播，而另一孔则需要估计细胞的密度。
    2. 第二天，除去培养基，并用1 ml /孔PBS洗涤细胞3次。
    3. 通过执行DAPI染色，评估6孔板一孔中的细胞密度。
      1. 在室温下用PBS中的1 ml /孔的3％多聚甲醛（PFA）固定细胞20分钟，并用1 ml /孔的PBS洗涤3次。
      2. 在补充有0.1％（v / v）Triton X-100的PBS中制备1：200稀释的核染色原液，并在室温下以1 ml /孔对细胞染色。
      3. 除去染色溶液，并用1 ml /孔PBS小心洗涤细胞3次。通过自动荧光显微镜测量细胞密度。有几种带有专用软件的自动荧光显微镜，可以获取每个细胞的细胞数。目前，我们使用的是Cytation 3成像读取器（BioTek，Agilent，Winnoski，VT，美国）。
    4. 准备病毒接种物。
      1. 计算所有孔的接种量，并用补充有0.1％（w / v）细胞培养级BSA的不依赖CO 2 的培养基稀释病毒原液，使其产量约为5至10 pfu /细胞。准备一种样品，缺乏病毒的CO 2 独立培养基作为模拟处理的对照。
      2. 以1 ml /孔接种或模拟处理细胞，并在室温下在摇动平台上孵育细胞1 h。
      3. 在1 hpi时，用1 ml /孔PBS洗涤细胞3次，并在37°C和5％CO 2 的补充有1％FCS的2 ml /孔培养基中孵育。这是时间刻度的0小时。
    5. 在3至24 hpi的3小时间隔内，确定各个时间点（ eg ）的细胞外和与细胞相关的细胞内病毒的量。
      1. 为了确定细胞外病毒的产量，将上清液从6孔板转移到2 ml置于冰上的试管中。在4°C和150 x g 下离心5分钟以沉淀细胞。
      2. 同时，添加600μl/孔MNT缓冲液以防止细胞干燥。
      3. 离心后，收集上清液，等分试样以进行噬斑测定（6 x 300μl），在液体N 2 中速冻，并储存在-80°C。将所得的细胞沉淀物置于冰上。
      4. 为了确定细胞内病毒产量，刮取每个孔的残留Vero细胞，并与从培养基中收获的细胞合并（步骤C5c）。
      5. 将600μl此细胞悬液转移至新鲜的2 ml管中。
      6. 向每个孔中添加400μlMNT缓冲液，以洗涤孔和刮板，并将其也转移至各自的2 ml管中（步骤C5e），最终体积为1 ml。
      7. 涡旋细胞悬浮液，在液态N 2 中速冻并储存在-80°C。
      8. 为了释放与细胞相关的病毒，对细胞进行三个周期的冻融，或在超声浴中进行超声处理，直到溶液看起来澄清为止。
      9. 将这些悬浮液于4°C和150 xg 离心3分钟，将上清液等分至4x 200μl，在液体N 2 中速冻，并在-80°C下储存C。此外，将2 ml的小瓶存放在200μl的残留物中，其中包含任何可能的沉淀。
    6. 通过噬斑测定法确定细胞内和细胞外病毒产量（请参阅步骤B）。
      注意：此外，可以使用标准诊断探针（ eg ，Engelmann < et al。，2008）。