材料和试剂

带过滤帽的细胞培养瓶，25 cm2（Thermo Fisher Scientific，目录号：156367）
细胞培养烧瓶，塞子密封盖，25 cm2（Greiner Bio-One，目录号：690160）
细胞刮板（Sarstedt，目录号：83.1830）
方形玻璃罩（VWR，目录号：6311570）
Falcon®圆底试管，5 ml（Corning，目录号：352008）
96孔平底组织培养板（Sarstedt，目录号：83.3924.005）
24孔平底组织培养板（Sarstedt，目录号：83.3922.005）
移液器吸头：0.5-10μl，10-200μl，200-1,000μl（Greiner Bio-One，目录号：771291、739290、740290）
褶状滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1201150）
1.5 ml反应管（Greiner Bio-One，目录号：616201）
血清移液管2 ml，5 ml，10 ml（Sarstedt，目录号：86.1252.001，86.1253.001，86.1254.001）
无菌注射器过滤器0.22μm（Millipore，目录号：SLGVV255F）
注射器5毫升（Terumo，货号：SS + 05S21381）
细胞提升器（Corning，目录号：3008）
婴儿利什曼原虫前鞭毛体（zymodeme GH8，菌株MHOM / GR / 2001 / GH8）
利什曼原虫主要前鞭毛体（zymodeme LV39，菌株MRHO / SU / 59 / P）
永生化巨噬细胞系J774A.1（ATCC；美国罗克维尔/ ATCC编号：TIB-67）
总酚含量（源自希腊克里特岛扎罗斯地区农业合作社的特级初榨橄榄油）
RPMI-1640（无）L-谷氨酰胺（Biowest，目录号：L0501）
胎牛血清（Biowest，目录号：S181B）
L-谷氨酰胺（Biosera，目录号：LM-R1641）
HEPES缓冲液1 M（Biowest，目录号：L0180）
青霉素-链霉素溶液10,000 U / ml（Biowest，目录号：L0022）
二甲基亚砜（DMSO）细胞培养等级（PanReac Applichem，目录号：A3672,0050）
无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32205-M）
福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：R04586-82）
台盼蓝染料用于重要染色（BDH，目录号：34078）
Milteforan®20 mg / ml（十六烷基磷酸胆碱，[HePC]，Virbac SA）
1 M盐酸（HCl）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：150696）
氯化钠99.9％（NaCl）（Applichem，目录号：381659）
氯化钾（KCl），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：746336）
磷酸氢二钠（Na2HPO4），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：795410）
磷酸二氢钾（KH2PO4），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
氢氧化钠（NaOH）溶液，1 M（Sigma-Aldrich，目录号：79724）
Carboxy-H2DCFDA（Thermo Fisher Scientific，目录号：C400）
过氧化氢溶液30％（w / w）（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
85％的正磷酸（AppliChem，目录号：A0989）
磺胺（Sigma-Aldrich，目录号：S9251-100G）
N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：222488）
亚硝酸钠（NaNO2）（Sigma-Aldrich，目录号：237213）
完整的RPMI-1640培养基（请参阅食谱）
胎牛血清溶液（FBS）（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲液（PBS），10x，pH 7.2-7.4（请参阅食谱）
0.4％（w / v）台盼蓝拒染染料（请参阅配方）
亚硝酸钠（NaNO2）溶液（请参阅食谱）
格里斯试剂（请参阅食谱）
H2O2解决方案（请参阅食谱）
设备
1. 新型BrunswickTMGalaxy®170 S二氧化碳培养箱（Eppendorf，目录号：Galaxy 170 S）
2. 冷藏培养箱26°C（Sanyo，目录号：MIR-253）
3. BD FACSCalibur流式细胞仪：3色（BD FACSCaliburTM，货号：342973）
4. ELISA酶标仪（Dynatech Laboratories，目录号：MRX）
5. 光学显微镜（奥林巴斯，货号：BHB）
6. 无菌生物安全柜（Telstar，目录号：Bio-II-A）
7. 吉尔森移液器（吉尔森，目录号：PIPETMAN Classic P-10，P-20，P-200，P-1000）
8. Malassez计数室（Paul Marienfeld GmbH＆amp; Co.，目录号：0640610）
9. 多通道移液器（品牌，目录号：703710）
10. pH计（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-644-928）
11. 移液器控制器（品牌，目录号：Accu-jet®pro 26300）
12. 蒸馏水机（Sartorius，目录号：H2O-I-1-UV-T）
  软件
  1. Microsoft®Office Excel 2010（Microsoft）
  2. FlowJo，版本10（BD）
    程序
    1. TPF浓度升高处理的利什曼原虫感染J774A.1巨噬细胞对一氧化氮产生的体外定量
      1. 使用适当的溶剂制备已知浓度的植物提取物。TPF溶于62.5％的纯乙醇，31.25％的无菌蒸馏水和6.25％的DMSO。
        注：特级初榨橄榄油中的TPF的回收是通过离心分离萃取（CPE）技术进行的，这是一种创新的无固体载体分离技术，源自离心分离色谱（CPC）。简而言之，使用实验室规模的离心式分区萃取器FCPE300®进行液-液色谱分析，该仪器配备了一个由7个堆叠的分隔盘组成的转子，上面刻有总共231个分隔池，而色谱柱的总体积为300 ml（ Angelis等人，2017； Koutsoni等人，2018）。 
      2. 在装有10 ml完整RPMI-1640培养基（配方1）的滤帽的25 cm2细胞培养瓶中，在37°C和5％CO2湿润的空气中培养J774A.1巨噬细胞。
      3. 使巨噬细胞达到约70％汇合的高密度种群。
        注意：J774A.1巨噬细胞在RPMI-1640完全培养基中于37°C，5％CO2湿润的空气中培养，通常在3到4天内达到70％融合。
      4. 然后，用无菌的一次性移液管移出大部分培养基，并在烧瓶中保留约2 ml培养基，并通过用细胞刮刀以45°角轻轻和缓慢地刮擦细胞来分离巨噬细胞单层。
      5. 通过在光学显微镜下在Malassez计数室中使用锥虫蓝排除染料（配方4）对死活细胞进行差异计数来确定每毫升巨噬细胞的数量。
        注：巨噬细胞在台盼蓝染料中的最终稀释取决于培养物的密度。通常，在体外培养的第3天或第4天，最终稀释度为1:20的巨噬细胞是合适的。
      6. 在无菌生物安全柜下的96孔平底组织培养板中，每孔播种5 x 104 J774A.1巨噬细胞，最终体积为100μl完整RPMI-1640培养基。
      7. 在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板18 h，以实现细胞粘附。
      8. 确定利什曼原虫属的数量。通过在光学显微镜下在Malassez计数室中使用锥虫蓝排除染料对死者和活寄生虫进行差异计数来确定每毫升中的前鞭毛体（前鞭毛体必须处于生长的固定阶段）。
        注意：
        
        利什曼原虫spp。前鞭毛体通常在3到5天后进入稳定生长阶段，具体取决于利什曼原虫的株系。例如，当达到3.5 x 107寄生虫/ ml的数量时，常用菌株大肠埃希菌大约在第4天进入静止生长期（Nasiri等，2013）。
        
        在锥虫蓝染料中前鞭毛体的最终稀释取决于体外寄生虫培养物的密度。通常，在体外培养的第3天或第4天适合1:20的前鞭毛体最终稀释度。另外，计数前，前鞭毛体必须用2％v / v福尔马林固定。
        
        种子7.5 x 105利什曼原虫。每个孔中的早期固定相前鞭毛体（即15：1寄生虫/巨噬细胞的比例）的最终终体积为200μl完全RPMI-1640培养基。
        
        在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板48小时。
        
        然后，通过在37°C下预热的RPMI-1640培养基洗涤三次，去除未内在化的前鞭毛体。
        
        一式三份添加各种浓度的TPF（5-400μg/ ml），并用完整的RPMI-1640培养基填充孔中，直到每孔最终体积为200μl。
        注意：植物提取物的浓度可能因天然产物而异。
        
        以适当的50％抑制浓度（IC50）一式三份添加一种参考药物（即，一种目前用于利什曼病化学疗法的药物）。如前所述（Koutsoni et al。，2018），十六烷基磷酸胆碱（HePC）的浓度分别为婴儿乳杆菌和大乳杆菌0.6μg/ ml和3.2μg/ ml。
        注意：还必须包括当量TPF溶剂的对照一式三份。
        
        阴性对照组也必须一式三份。更具体地，仅在完全RPMI-1640培养基的存在下培养而没有任何药物影响的三重三次利什曼原虫感染的J774A.1巨噬细胞作为阴性对照组。
        
        在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板48小时。
        
        收集培养上清液，并将每个样品50μl转移到新的96孔平底组织培养板中，如图1所示。建议对每个样品再次使用三份。
        注意：培养上清液含有分泌的活性氮中间体。
        
        图1. Griess分析发生的96孔平底板的代表性图示
        
        需要亚硝酸钠标准曲线。如图1所示，将100μlNaNO2溶液（配方5）以75μg/ ml的浓度置于A1和A2孔中。
        
        将50μl蒸馏水放在B1，B2等中，直到H1和H2孔，然后通过使用多通道移液器将50μlNaNO2溶液从A1和A2分别转移到B1和B2直到H1和H2进行系列稀释。
        注意：丢弃从H1和H2孔中获得的过量50μl。
        
        随后在标准液和样品中放入100μlGriess试剂（配方6）。
        注意：
        
        Griess试剂必须是新鲜制备的。制备Griess试剂时，请避免与瓶颈接触，因为该试剂通常包含Griess阳性物质，可增加背景吸收。
        
        NaNO2的最终标准浓度范围为0.195μg/ ml至25μg/ ml。
        
        一式四份，仅包含50μl蒸馏水作为空白。
        
        格里斯试剂必须是新鲜制备的。制备Griess试剂时，请避免与瓶颈接触，因为该试剂通常包含Griess阳性物质，会增加背景吸收。
        
        NaNO2的最终标准浓度范围为0.195μg/ ml至25μg/ ml。
        
        还包括一式四份，其中仅包含50μl用作空白的蒸馏水。
        
        使用在570 nm处激发的吸光度酶标仪读取板。
        注意：颜色立即从透明变为粉红色。亚硝酸盐浓度越高，颜色的强度越大。
        
        TPF浓度升高处理的利什曼原虫感染的J774A.1巨噬细胞对活性氧种类产生的体外定量分析
        
        使用适当的溶剂制备已知浓度的植物提取物。TPF溶于62.5％的纯乙醇，31.25％的无菌蒸馏水和6.25％的DMSO。
        注意：如步骤部分所述，采用离心分离萃取（CPE）技术从特级初榨橄榄油中回收TPF，这是一种创新的无固体载体分离技术，该技术源自离心分离色谱（CPC），步骤A1。
        
        如步骤A2所述，在带过滤帽的25 cm2细胞培养瓶中培养J774A.1巨噬细胞，其中装有10 ml完全RPMI-1640培养基。
        
        使巨噬细胞达到约70％汇合的高密度种群，如步骤A3中所述。
        
        然后，如步骤A4和A5所述，通过在光学显微镜下在Malassez计数室中使用锥虫蓝排除染料对死细胞和活细胞进行差异计数，确定每毫升巨噬细胞的数量。
        
        在无菌生物安全柜下的24孔平底组织培养板中，每孔播种5 x 105 J774A.1巨噬细胞，最终体积为500μl完整RPMI-1640培养基（图2）。
        
        图2. 24孔组织培养板的代表
        
        在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板18 h，以实现细胞粘附。
        
        确定利什曼原虫属的数量。通过在光学显微镜下在Malassez计数室中使用锥虫蓝排除染料对死者和活寄生虫进行差异计数来确定每毫升中的前鞭毛体（前鞭毛体必须处于生长的固定阶段）。
        注意：
        
        利什曼原虫spp。前鞭毛体通常在3到5天后进入稳定生长阶段，具体取决于利什曼原虫的株系。例如，当L. major达到3.5 x 107寄生虫/ ml的数量时，大约在第4天进入稳定生长阶段（Nasiri等，2013）。
        
        在锥虫蓝染料中前鞭毛体的最终稀释取决于体外寄生虫培养物的密度。通常，在体外培养的第3天或第4天适合1:20的前鞭毛体最终稀释度。另外，计数前，前鞭毛体必须用2％v / v福尔马林固定。
        
        种子7.5 x 106利什曼原虫。每个孔中的早期固定相前鞭毛体（即，寄生虫/巨噬细胞的比例为15：1）在总最终体积为1,000μl完整RPMI-1640培养基中。
        注意：包括感染阴性对照组，该组由无前鞭毛的巨噬细胞组成。
        
        在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板48小时。
        
        然后，通过用预热至37°C的RPMI-1640培养基洗涤三次，除去未内在化的前鞭毛体。
        
        添加各种浓度不断增加的TPF（5-400μg/ ml），并用完整的RPMI-1640培养基填充孔中，直至每孔最终体积为1,000μl。
        注意：植物提取物的浓度可能因天然产物而异。
        
        以适当的50％抑制浓度（IC50）一式三份添加一种参考药物（即，一种目前用于利什曼病化学疗法的药物）。如前所述（Koutsoni et al。，2018），十六烷基磷酸胆碱（HePC）的浓度分别为婴儿乳杆菌和大乳杆菌0.6μg/ ml和3.2μg/ ml。
        注意：
        
        还必须包括对TPF溶剂当量的控制。
        
        必须包括三个不同的对照组，即i）利什曼原虫spp。感染性巨噬细胞，将其作为治疗阴性对照，ii）利什曼原虫spp。被感染的巨噬细胞，稍后将作为ROS产生的阳性对照； iii）利什曼原虫。被感染的巨噬细胞，将在以后的流式细胞仪中用作未标记的样品。
        
        在5％CO2湿润的空气中于37°C下孵育平板48小时。
        
        除去培养上清液，并在每个孔中添加500μlPBS 1x溶液（配方3），除了用于产生ROS的阳性对照（在其中添加500μl1 mM H2O2溶液（配方7））。
        注：H2O2是巨噬细胞产生ROS的诱导剂，因此可用作ROS产生的阳性对照（Ogawa等，2004）。
        
        在5％CO2加湿的空气中于37°C孵育平板15分钟。
        
        从阳性对照组中取出培养上清液，并用500μlPBS 1x溶液代替。
        
        在每个孔中添加5μM羧基H2DCFDA。
        注意：在未标记的组中，避免添加羧基H2DCFDA。
        
        在5％CO2 湿润的空气中于37°C孵育平板30分钟。
        
        除去培养上清液，并在每个孔中加入500μlPBS 1x溶液。
        
        使用细胞提升器分离细胞。
        
        逐一收集细胞悬液，然后将它们分别转移到5 ml圆底管中。
        注意：在流式细胞仪数据收集过程中，应将装有细胞悬液的试管放在冰上。
        
        在FACSCalibur中分析样品。
        
        数据分析
        
        TPF浓度升高处理的利什曼原虫感染J774A.1巨噬细胞NO生成的体外定量
        Griess比色亚硝酸盐测定法依赖于样品中一氧化氮转化为稳定的偶氮化合物，该化合物在约540 nm处吸收（Sun等，2003）。将板放入酶标仪中，以获得每个孔的光密度（OD）值。
        
        计算空白一式四份的平均光密度（OD）值，并将其从其他所有OD值中减去。
        
        计算每个标准亚硝酸盐浓度的OD值平均值。
        
        选择与标准亚硝酸盐浓度相对应的所有值，并插入散点图，该散点图在x轴上描述亚硝酸盐浓度，在y轴上描述相应的OD值的平均值。
        
        提取曲线的线性区域。
        
        选择“添加趋势线”并选择“线性”趋势线选项。
        
        在图表中添加趋势线，并提取趋势线的方程式和R平方值（图3.）。
        注意：趋势线的R平方值等于或接近1时最可靠。
        
        图3.具有趋势线的标准曲线的线性区域
        
        计算与每个样品相对应的OD值的平均值。
        
        根据方程式，找到每个样品的亚硝酸盐浓度。
        
        TPF浓度升高处理的利什曼原虫感染J774A.1巨噬细胞对ROS产生的体外定量
        为了进行数据分析，使用了FlowJo软件。
        
        在双参数点图上根据样本的大小（前向散射光/ FSC）和细胞粒度（侧向散射光/ SSC）分析样品，并设置门控区域以排除细胞碎片（图4）。
        注意：作为一般指导，细胞碎片应为FSC含量低的物质。
        
        图4.通过FSC和SSC点图分析的J774A.1巨噬细胞门控示例
        
        在单参数直方图（FL1-H通道）中分析门控细胞群。
        
        为每个样本提取Geo-mean（图5）。
        注：几何平均值代表样品的荧光强度。Geo-mean越大，荧光强度越大，因此细胞中ROS的存在越多（Eruslanov和Kusmartsev，2010）。
        
        图5。流式细胞术分析中代表性的单参数直方图，用于定量ROS产生。FL1直方图显示的是在加载H2DCFDA的J774A.1细胞门控群体中荧光强度（Geo Mean）（A）RPMI-1640培养基和（B）TPF以400 µg / ml刺激。
        
        菜谱
        
        完整的RPMI-1640培养基
        
        加入5 ml的L-谷氨酰胺（储备溶液200 mM，在-20°C下储存），5 ml青霉素-链霉素（储备溶液10,000 U / ml，在-20°C下储存）和5 ml HEPES（储备溶液1 M）至500 ml RPMI-1640培养基
        
        储存在4°C
        
        取适当的体积，将FBS添加至最终浓度的10％（v / v）
        
        胎牛血清溶液（FBS）
        解冻FBS并在不断搅拌下于水浴中于56°C加热灭活30分钟
        储存在-20°C直到使用
        
        磷酸盐缓冲液（PBS），10x，pH 7.2-7.4
        
        将800毫升蒸馏水放在合适的容器中，溶解80克NaCl，2克KCl，11.5克Na2HPO4和2克KH2PO4。搅拌直至盐完全稀释，并根据需要用NaOH（1 M）或HCl（1 M）溶液将溶液调节至所需的pH（通常为7.2-7.4）
        
        ＆nbsp;添加蒸馏水直至最终体积为1,000 ml，然后通过孔径为0.22μm的注射器过滤器单元进行灭菌
        
        通过在450 ml无菌和蒸馏水中稀释50 ml的10x储备溶液来制备1x的工作溶液。储存在4°C
        
        0.4％（w / v）台盼蓝拒染染料
        
        将0.4 g的锥虫蓝溶于100 ml的PBS 1x中。好好搅动
        
        通过打褶的滤纸过滤并通过0.22μm孔径的注射器过滤器单元进行灭菌。室温保存
        
        亚硝酸钠（NaNO2）溶液
        准备75 µg / ml的原液
        将750 µg溶于10 ml去离子水中
        
        格里斯试剂
        Griess试剂由两种独立的溶液（A和B）组成，它们在实验操作时混合在一起（比率1：1）
        格里斯试剂A
        首先，准备3％（v / v）的磷酸溶液。然后，以最终浓度1％（w / v）溶解适量的磺胺盐
        格里斯试剂B
        将适量的N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐溶解在蒸馏水中，以获得0.1％（w / v）的最终浓度
        
        过氧化氢溶液
        
        准备100毫升1 mM的工作溶液
        
        将10μl储备溶液（30％w / w）溶于100 ml去离子水中
        致谢
        
        这项研究工作的一部分得到了希腊研究与创新基金会（HFRI）和HFRI博士学位下的研究与技术总秘书处（GSRT）的支持。助学金（GA。no。6ΝΔΘ46ΨZn2Ν-ΣΣΟ）。此外，这项工作得到了KRHPIS II（MIS 5002486）和EATRIS（MIS 5028091）的支持。
        ＆nbsp; 该协议由Koutsoni等人（2018）和Kyriazis等人（2016）进行了修改和修改。
        
        利益争夺
        
        作者宣称他们没有竞争利益。
        
        参考文献
        
        安吉利斯·A。，哈姆扎伊·M。，阿利吉尼斯·N。，尼古·T。，米凯利迪斯·D。，杰罗利马托斯·P。，特门兹奇·A。，休伯特·J。，哈拉巴拉基·M。，雷诺，JH和Skaltsounis ，AL（2017）。使用不含固体支持物的液体从橄榄油中回收高附加值化合物的综合方法，液体萃取和色谱技术。 J Chromatogr A 1491：126-136。
        
        Bae，YS，Sung，JY，Kim，OS，Kim，YJ，Hur，KC，Kazlauskas，A.和Rhee，SG（2000）。由血小板衍生的生长因子诱导的H2O2产生需要激活磷脂酰肌醇3激酶。 J Biol Chem 275（14）：10527-10531。
        
        Dale，DC，Boxer，L.和Liles，WC（2008）。吞噬细胞：嗜中性粒细胞和单核细胞。血液112（4）：935-945。
        
        Denkers，EY和Butcher，BA（2005）。在被细胞内原生动物寄生的巨噬细胞中的破坏和利用。趋势是parasitol em> 21（1）：35-41。
        
        do Socorro，SRMS，Mendonca-Filho，RR，Bizzo，HR，de Almeida Rodrigues，I.，Soares，RM，Souto-Padron，T.，Alviano，CS和Lopes，AH（2003年）。来自巴豆树汁的富含芳樟醇的精油的抗肠蠕动活性。抗微生物剂Agents Chemother 47（6）：1895-1901。
        
        Eruslanov，E.和Kusmartsev，S.（2010）。使用氧化的DCFDA和流式细胞仪鉴定ROS。方法Mol Biol 594：57 -72。
        
        Georgopoulou，K.，Smirlis，D.，Bisti，S.，Xingi，E.，Skaltsounis，L. and Soteriadou，K.（2007）。 10-去乙酰基浆果赤霉素III对利什曼原虫多鞭毛体前鞭毛体和胞内变形虫的体外活性。 Planta Med 73（10）：1081-1088。
        
        Gupta，G.，Oghumu，S.和Satoskar，AR（2013）。利什曼病中免疫逃逸的机制。 Adv Appl Microbiol 82：155-184。
        
        Horta，MF，Mendes，BP，Roma，EH，Noronha，FS，Macedo，JP，Oliveira，LS，Duarte，MM和Vieira，LQ（2012）。皮肤利什曼病中的活性氧和一氧化氮。 J Parasitol Res < / em> 2012：203818。
        
        Koutsoni，OS，Karampetsou，K.，Kyriazis，ID，Stathopoulos，P.，Aligiannis，N.，Halabalaki，M.，Skaltsounis，LA和Dotsika，E.（2018）。评估从特级初榨橄榄油中提取的总酚类成分的抗衰老活性。 Phytomedicine 47：143-150。
        
        Kumar，R.，Pai，K.和Sundar，S.（2001）。印度内脏利什曼病的活性氧中间体，亚硝酸盐和IFN-γ。 Clin Exp Immunol 124（2）：262-265。
        
        Kyriazis，ID，Koutsoni，OS，Aligiannis，N.，Karampetsou，K.，Skaltsounis，AL和Dotsika，E.（2016）。橄榄苦苷的杀菌作用是通过与炎症和氧化应激相关的基因选择性调节的。 Parasit Vectors 9：441。
        
        Leopold Wager，CM和Wormley，FL，Jr.（2014年）。经典巨噬细胞与其他巨噬细胞激活：在抵抗肺部真菌感染的宿主防御中，杨和杨。 a> 粘膜免疫7（5）：1023-1035。
        
        Nasiri，V.，Karimi，G.，Dalimi，A.，Paykari，H.和Ghaffarifar，F.（2013）。绵羊和小鼠尿液对利什曼原虫主要前鞭毛体生长模式的影响。 Biomed Res Int 2013：748592。
        
        Y.Ogawa，T。小林，A。Nishioka，S.Kariya，T。Ohnishi，S。Hamasato，H.Seguchi和S.Yoshida（2004）。过氧化氢诱导的人外周血T细胞凋亡中活性氧产生部位：溶酶体的参与膜失稳。 Int J Mol Med 13（3）：383-388。
        
        Patricio，FJ，Costa，GC，Pereira，PV，Aragao-Filho，WC，Sousa，SM，Frazao，JB，Pereira，WS，Maciel，MC，Silva，LA，Amaral，FM，Rebelo，JM，Guerra，RN，明尼苏达州里贝罗和法国纳西门托（2008）。用藜芦藜对小鼠体内被亚马逊利什曼原虫感染的病灶内治疗效果。 Ethnopharmacol 115（2）：313-319。
        
        Rodrigues，IA，Mazotto，AM，Cardoso，V.，Alves，RL，Amaral，AC，Silva，JR，Pinheiro，AS和Vermelho，AB（2015）。天然产品：对利什曼病的炎症反应的认识。介体炎症 2015：835910。
        
        Roy，S.，Dutta，D.，Satyavarapu，EM，Yadav，PK，Mandal，C.，Kar，S.和Mandal，C.（2017）。机器通过调节氧化还原稳态来发挥体外和体内的抗衰老活性。 Sci Rep 7（1）：4141。
        
        Sun，J.，Zhang，XJ，Broderick，M.和Fein H.（2003年）。使用格里斯反应测定法测量生物系统中一氧化氮的产生。 Sensors 3（8）：276-284。
        
        Tomiotto-Pellissier，F.，Bortoleti，B.，Assolini，JP，Goncalves，MD，Carloto，ACM，Miranda-Sapla，MM，Conchon-Costa，I.，Bordignon，J. and Pavanelli，WR（2018）。利什曼病中的巨噬细胞极化：开阔了眼界。前免疫9：2529。
        
        托雷斯-桑托斯，EC，莫雷拉，DL，卡普兰，马萨诸塞州，梅雷莱斯，明尼苏达州和罗西-伯格曼，B。（1999年）。从Piper中分离出来的2'，6'-二羟基-4'-甲氧基查尔酮的选择性作用亚马逊利什曼原虫上的白花。抗菌剂化学疗法43（5）：1234-1241。