材料和试剂

在高通量筛选中对小鼠（野生型和突变型小鼠，通常在C57BL / 6N遗传背景下产生，年龄13-14周进行了测试[Ingham et al。，2019]，可以轻松测试14天以上的实验小鼠）
安塞丹（Atipamezole Hydrochloride 5 mg / ml，Zoetis美国，Parsippany，New Jersery，美国）
Ketaset（盐酸氯胺酮100毫克/毫升，Zoetis美国，Parsippany，New Jersery，美国）
Rompun（盐酸赛拉嗪20 mg / ml； 2％w / v，Bayer plc，英国伯克郡）
Viscotears（液体眼胶2 mg / g卡波姆，与西曲美胺，博士伦，英国萨里）
氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉剂混合物（由材料和试剂＃3和＃4制成；请参见食谱）
Atipamezole混合物（由材料和试剂2制成；请参见食谱）

设备

声音衰减室（MAC1或MAC2工业声学公司；或同等价值的产品，在2,000Hz及更高频率下具有至少37dB的场噪声减小，内部尺寸约为584 x 406 x 356 mm [宽x深x高]或更大，包含射频屏蔽）
加热毯（家用热毯系统； 50-7221F；哈佛大学设备，英国剑桥）
刺激发生和信号采集数字信号处理（DSP）设备（RZ6-A-P1多IO处理器，美国塔克戴维斯技术公司TDT）
麦克风和信号调节器（378C01型，480C02型；美国纽约州PCB Piezoelectronics）
声音转换器（多场扬声器MF1；美国TDT）
BNC和其他连接器电缆
皮下针电极（SD51-426-1 NeuroDart，意大利Spes Medica;直径0.4mm，长度13mm，带有1.5mm防触碰连接器，电缆长度为100cm）
低阻抗录音前置/前置放大器（RA4LI + RA4PA或Medusa4Z；美国TDT）
个人计算机（能够容纳全高PCI接口卡）
“Optibit”接口卡（PO5E，TDT，美国）
数字示波器（TBS1000；英国Tektronix Berkshire）

软件

RPvdsEx驱动程序软件（美国TDT； www.tdt.com / support / downloads ）
ActiveX控制软件（美国TDT； www.tdt.com / support / downloads ）
TeeChart AX软件（Steema软件；西班牙赫罗纳）
定制的”Averager”软件，由Tim Folkard（英国诺丁汉医学研究委员会听力研究学院）和Neil Ingham编写，可应作者要求提供（ neil.ingham@kcl.ac.uk ）
定制的”Traceview”软件，由Tim Folkard（英国诺丁汉医学研究委员会医学研究所理事会）和Neil Ingham编写，可应作者要求提供（ neil.ingham@kcl.ac.uk ）
ABR分析软件（由BN Buran博士编写； https://github.com/bburan/abr ）促进峰值和潜伏期分析

程序

动物准备
1. 从麻醉的对照和突变小鼠中记录听觉脑干反应（ABR）记录。使用腹膜内氯胺酮（100 mg / kg）和赛拉嗪（10 mg / kg）对小鼠进行麻醉，请参见配方1。
2. 注射后，将小鼠保持在温暖的睡眠笼中直至深度镇静（当纠正反射，角膜眨眼反射和踏板撤回反射消失时；注射后可能需要5-10分钟），然后将其放在加热毯上位于消音室的内部，将进行电生理记录。为了加快此过程，反馈探针未正确插入，而是位于鼠标下方的毯子盖内部。橡皮布控制器设置为维持37°C的温度，以确保在录制过程中不会对鼠标核心温度造成不利影响。诱导麻醉剂量通常在记录过程中就足够了，但是如果需要，可以使用30-50％的剂量进行补充。
3. 皮下的针状电极（弯曲成钩形；图1A）穿过颅骨顶点上的一小撮皮肤插入（连接到RA4LI或Medusa4Z头段的活动通道1输入），并覆盖左大疱的腹侧区域（连接到Headstage参考输入）和右Bulla（连接到Headstage地面输入）（请参见图1B和1C）。这种电极排列不会消除伪影电势（例如心电图（ECG），但会使其最小化。钩形形状有助于准确插入点，并确保从有限的解剖区域拾取记录的脑电图（EEG）信号。电极插入之前，需要先进行局部麻醉，因为小鼠已经很镇静并且弯曲。
4. 扬声器以自由场声音（未耦合到耳道）的形式呈现为刺激，扬声器的前缘位于鼠标中耳中耳轴中心20 cm处。此距离提供了足够的空间，可以轻松地将鼠标移入和移出设置，而不会意外移动扬声器的位置，同时保持紧密的距离以确保在鼠标头位置可以达到95 dB的声压级。
  
  图1.皮下电极的形状和放置。（A）使用持针器将单个针状电极弯曲成方形钩形，每侧长约2 mm。钩子穿过一小撮皮肤插入，使得与皮下层的接触位于电极的其余直轴上。将接地电极放在右耳后方的大疱上方的皮肤中（B）。低阻抗生物放大器的有源电极放置在中线上的rostro-caudal位置，并与2个pinnae的前缘对齐（C）。生物放大器的参比电极插入到左耳（D）的后方，与接地电极的位置相同（根据Ingham et al。，2011年修改）。
刺激产生
1. 在”Averager”软件包的控制下生成刺激。多种激励参数是用户定义的，或者可以从先前保存的配置中轻松快速地加载。
2. 声音传输系统的频率响应使用系统非均衡输出的频谱分析进行均衡。PCB麦克风的位置与扬声器的前边缘（随后将放置鼠标头的位置）相距20厘米，并指向扬声器。在软件的控制下，扬声器会呈现宽带噪声突发（由随机数序列生成）。麦克风记录的信号被放大40 dB，并以大约200 kHz的采样率记录在RA6-A-P1处理器上。该软件计算麦克风信号的快速傅立叶变换，以生成代表扬声器在整个频率上的最大输出的频率响应。该频率响应随后将被软件用来计算以期望的dB声压级（SPL）呈现每个激励频率所需的dB衰减级。此步骤需要在麻醉鼠标并将其放入声音衰减室中的实验装置之前执行。
3. 使用”Averager”软件控制RZ6-A-P1处理器在一定范围内提供滴答声（持续时间0.01毫秒）和音调点（持续时间5毫秒的3-42 kHz可变频率，1毫秒上升/下降时间）以5 dB为步长从0-95 dB声压级（SPL，re。5μPa）的强度级进行测量。在衰减，放大并传递到声音换能器以在鼠标头位置产生所需的SPL之前，以大约100 kHz 的采样率生成刺激。
4. 一旦触发开始，”Averager”软件和RZ6-A-P1处理器将同步控制刺激信号的显示和响应记录。相同的数字触发器用于启动每个刺激的演示以及该刺激引起的响应片段的记录。
响应记录
1. 记录电生理反应的过程由用于生成和呈现刺激的同一”Averager”软件控制。用户可以定义多种记录参数，或者可以从以前保存的配置中加载。
2. 皮下电极检测到的活动在以光学方式传递到RZ6-A-P1处理器的生物放大器输入之前，以大约25 kHz的采样率（RA4PA / Medusa4Z）被数字化。
3. 在”Averager”软件的控制下，捕获数字化的电极信号，对其进行带通滤波（300 Hz-3 kHz；用户可自定义）并放大（用户自定义），然后再上采样至大约100 kHz。响应的片段（持续时间为20毫秒）被存储在数字平均缓冲区中，然后由软件检索，并以逗号分隔的变量（csv）文本格式保存到输出文件中。
4. 记录平均响应，以42.6 / s（用户可定义）的形式呈现每种刺激（用户可定义）的256个呈现。
刺激参数空间和响应记录协议
1. 首先记录测试ABR迹线，以确保系统正常运行，并使用70 dB SPL的点击声。如果需要对实验装置进行故障排除，则可以轻松重复此记录。除了如果预期/已知鼠标严重受损的情况下没有记录任何响应，还可能有许多其他简单的原因导致看不到诱发的响应。例如，操作员应检查a）扬声器是否正确连接； b）电极是否正确连接到鼠标和头架； c）电极头架和前置放大器已连接并已打开； d）端子是否过多？记录轨迹上的电子噪声，以及e）鼠标仍然存在。
2. 然后记录一系列单击诱发的ABR，范围为0至95 dB SPL，间隔为5 dB。
3. 音调诱发的ABR以固定频率记录（通常为6、12、18、24 和30 kHz，尽管可以轻松扩展数据收集以捕获对3、36和42 kHz音调尖峰的响应）范围为0至95 dB SPL，间隔为5 dB。从最低的刺激水平开始，以递减的频率顺序将响应记录在阵列中，然后逐步提高到下一个（更高5 dB）刺激水平。
4. 图2显示了通过单击和音调刺激在0-95 dB SPL上诱发的示例ABR轨迹，对于野生型对照小鼠（听力正常），该小鼠携带Ywhae 突变等位基因（会诱发中等程度的听力障碍）和携带Minar2 突变等位基因的小鼠（会诱发严重的听力障碍，因此即使在高刺激水平下也不会诱发ABR）。
5. 记录最终测试轨迹，再次使用70 dB的喀哒声，以确保看到与初始测试轨迹等效的ABR。这可能是确定记录过程中鼠标是否生理恶化的有用措施。
恢复协议
1. 记录完成后，将电极从皮肤上取下，并在每只眼睛上滴一滴粘胶，以在恢复过程中润滑角膜，并有助于小鼠的整体健康。
2. 给小鼠腹膜内注射阿司他咪唑（1 mg / kg，见配方2）以促进麻醉后更快的恢复时间。
3. 应当将小鼠养在温暖的笼子中，直到它们恢复活动能力，并判断其已充分康复以返回家中。

数据分析

Ingham et al。（2019）中详细描述了分析从突变小鼠的高通量表型筛选中获得的小鼠ABR数据的方法。在此，将介绍适用于“二次表型”实验室研究的分析方法。

ABR阈值和听力敏感性
对于所使用的每种刺激（咔嗒声和每个音调频率），在测试的声级范围内记录的ABR被绘制为堆栈，并按dB SPL递增顺序排列（图2）。通过目测检查堆叠的ABR迹线来估算阈值（dB SPL），并将其定义为最低声音水平，其中可以识别ABR波形的任何分量，并与较高声音水平下记录的响应一致，同时考虑到峰值延迟的特征延长接近阈值。绘制每个刺激的阈值，以给出每只小鼠的听力敏感性的概况（图3A）。对照组和突变组的平均阈值（±标准偏差）图用于评估突变组的总体听力状况。在分组均值旁边绘制单个突变和/或对照阈值也很有帮助（图4）。

图2.来自野生型和突变小鼠的ABR反应示例。将ABR绘制成堆栈，以将刺激dB声压级（SPL）从0增大到95 dB。点击会引起A中的响应，而BF，6、12、18、24和30 kHz的音调会引起BF中的响应。每个面板上的粗线表示通过经验丰富的实验人员通过目视检查响应而确定的每个响应集的阈值灵敏度。第1行（黑色）显示了从听力正常的野生型小鼠获得的典型反应。第2行（红色）显示了来自Ywhae 纯合突变型小鼠的听力反应，其反应具有轻度中度升高。第3行（蓝色）显示了来自Minar2 纯合突变小鼠的记录，其中未测量到高达95 dB的可见响应。在这种情况下，将阈值分配为测试的最高dB SPL，以便绘制数据并与其他小鼠进行比较。这些数据先前已发布在Ingham et al。（2019）中。

图3.数据表示和分析方法。 A.为野生型小鼠（黑色），Ywhae 突变小鼠（红色）和野生型小鼠绘制了点击和音调刺激的ABR阈值。图2中显示了一个Minar2 突变小鼠（蓝色）。B.从野生型小鼠（黑色，50 dB感觉水平，SL），Ywhae 突变体记录的单击诱发ABR （红色，50 dB SL）和Minar2 突变体（蓝色95 dB SPL）。灰色区域表示与ABR波1-4相对应的波形部分。波形的正峰值和负峰值分别标记为P1-P4和N1-N4。CG表示从ABR波形测得的参数的量化，并绘制为阈值以上dB级（感觉级，dB SL）的函数。C.为野生型小鼠（黑色）绘制了表示为P1-N1峰峰幅度（P1正峰到N1负峰）与dB SL的函数关系的波1的增长，Ywhae < 突变小鼠（红色）。D.绘制了野生型小鼠（黑色）和Ywhae <的波3的增长，表示为P3-N3峰峰幅度（P3正峰到N3负峰）与dB SL的函数关系。突变小鼠（红色）。E.为野生型小鼠绘制了P1波峰值潜伏期（从0ms刺激开始到P1达到最大振幅的时间点的时间延迟）与dB SL的函数关系图（黑色）和Ywhae 突变小鼠（红色）。F. 针对野生型小鼠（黑色）和Ywhae 突变小鼠（红色）绘制了P3波峰值潜伏期随dB SL的变化。G.为野生型小鼠（黑色）绘制了P1-P3峰间间隔的变化（波P1的最大振幅到波P3的最大振幅的发生之间的时间）作为dB SL的函数。）和Ywhae 突变小鼠（红色）。这些数据先前已发布在Ingham et al。（2019）中。

图4.突变小鼠的听力图分类示例。来自突变小鼠的ABR阈值分类为（A）严重，（B）高频，（C）低频，（D）中度，（E）轻度听力障碍和（F）正常听力敏感性。以灰色绘制的数据表示来自单个突变动物的阈值。以红色绘制的数据表示突变动物的平均（±标准偏差）阈值。以黑色绘制的数据表示与相同图中的突变体在同一周内记录的野生型对照小鼠的平均（±标准偏差）阈值。这些数据是从高通量表型筛选中获得的，从同窝对照小鼠中记录是不可行的。这些数据先前已在Chen et al。，2014年发表；Maguire et al。，2014年；Buniello等人，，2016年和Ingham 等人，，2019年。
鼠标ABR听力图的分类
根据以下标准对ABR阈值升高的模式进行分类：严重-，如果至少2个相邻频率刺激均未检测到响应（最高95 dB SPL），基因型; 高频，如果阈值在30 kHz时升高了（大于30 dB），并且至少一个低频刺激中的阈值没有升高；低频，如果阈值分别在6 kHz和12 kHz时升高，并且对于至少一种高频刺激是正常的（最小平均阈值升高<15 dB）；中等，其中阈值为
在测试的6种刺激中至少有4种显着升高（最小平均阈值升高> 15 dB）; 轻微，其中最多测试3个刺激的平均阈值提高了30 dB或更低；正常听力，其中没有刺激可改变阈值。图4说明了每种听力图分类的一个示例[有关更多示例，请参见Ingham et al。（2019）]。
ABR波形形状比较
通过一致的，可重复的电极放置并以良好的信噪比记录，可以定性和定量地比较刺激诱发的ABR的波形形状。波1被理解为反映听觉神经活动，但是由于响应代表在头皮上单个点处检测到的响应的复杂求和，因此在将特定的大脑位置归因于ABR波形的特定特征方面存在一些不确定性。我们使用的自由场双耳（ie ，两个耳道均打开）刺激条件使情况进一步复杂化，因为整个听觉脑干中存在双耳相互作用，甚至低至耳蜗核。ABR代表当同步动作电位齐射（特别是来自起反应的神经元）横穿中央听觉通道时，电极检测到的总电矢量。由于这些途径既可以是兴奋性的也可以是抑制性的，也可以是上升和下降的，并且分布在3D体积中，因此解释很复杂。
＆nbsp; 绘制了突变小鼠和对照小鼠在固定dB SPL水平或高于阈值（感觉水平，dB SL）的固定水平下记录到咔嗒声和音调波形的波形，以及每种基因型在小鼠之间的ABR振幅平均值。在这些响应中，通常会观察到4个波（正向负偏转；图2、3和5）。鉴于ABR波的潜伏时间和振幅都随刺激水平的变化而变化，因此以固定的dB SL绘制波形（来自单个小鼠和平均波形）是合适的。这考虑到了个体之间的阈值差异，并给出了具有减小的变异性的平均波形，从而便于在对照组和突变组之间进行比较。
＆nbsp; 可以从ABR波形中得出其他指标，例如波分量的半宽度（有关此方法的示例，请参见Harris et al。，2018）。但是，这里不对这些分析进行进一步的讨论。

图5.音调诱发的ABR的波形分析。 [这些数据在Ingham等人（2017）中进行了描述]。黑线和符号表示从12只野生型同窝对照小鼠（EphA2 + / + ）记录的数据。红线和符号表示从23只EphA2 纯合突变小鼠（EphA2 -/- ）记录的数据。A和B.由40 dB SL 18 kHz 音调诱发的单个小鼠记录的ABR 。C.绘制了A和B中所示的野生型和突变体响应的平均幅度。正偏波分量由P1-P4表示。负偏转波分量用N1-N4表示。D.绘制了波1-4的峰峰值幅度的输入/输出函数。将平均（±标准偏差）幅度与高于阈值（dB SL，感觉级别）的声级作图。E.绘制了波P1-P4和N-N4的峰值潜伏期的输入/输出函数。相对于高于阈值（dB SL）的声级绘制了平均（±标准偏差）潜伏期。F.绘制了3个峰值间隔的输入/输出功能。将平均（±标准偏差）间隔时间与高于阈值（dB SL）的声级作图。这些数据表明，单个动物之间的ABR反应可以高度重现。在这种情况下，同窝野生型和EphA2 突变小鼠记录的波形响应特性没有显着差异。
输入输出功能（IOF）
量化ABR波以确定在记录的每种刺激水平下波形的正负峰的幅度和潜伏期（图3）。可以使用BN Buran博士开发的软件例程来执行此操作（Buran et al。，2010年）。通过这些测量，我们可以计算波1-4的峰峰值幅度和延迟以及峰间间隔（例如，P1-P2，P1-P3，P1-P4）。相对于每只鼠标的点击阈值绘制了IOF曲线（ie ，参数针对dB SL绘制）。编译单个小鼠（突变体和同窝对照）的IOF，并绘制每个参数的平均值（±标准差）。
统计分析
从ABR导出的各种参数（例如，阈值或波幅）的数量很少遵循正态分布。因此，研究人员将需要仔细考虑将最适当的统计比较应用于其数据集。许多可能要测试的参数不能被认为是完全独立的（例如，由于沿耳蜗基底膜的机械耦合，相邻音调刺激的阈值不能被认为是独立的）。因此，方差分析（ANOVA）测试被认为更适合比较跨不同刺激测试的阈值范围，而不是对不同刺激进行多次单独比较。非参数测试将需要用于不符合正态分布的数据集。此类测试可在许多软件包中使用（例如SigmaPlot，SPSS，等）。

笔记

使用正常听力同窝对照小鼠的ABR来比较从听力异常/受损的突变小鼠获得的反应至关重要。这样可以确保所有小鼠在发育过程中都具有相同的体验（例如噪音水平，笼清洁干扰，等）。这也确保了所使用的对照小鼠具有相同的遗传背景。
背景应变在记录的响应上可能有很大差异。例如，C57BL / 6N小鼠携带Cdh23 基因的变体，使它们易于早发高频听力损失，而CBA / CaJ小鼠的听力敏感性却显示出与年龄有关的非常有限的升高。遗传背景的差异也可能导致基因功能的修饰子发生改变，从而使特定菌株的突变体中存在的听觉表型在突变与其他背景菌株杂交后会丢失。
如果研究人员正在比较不同年龄范围的ABR，无论是对同一只动物进行重复测量，还是对不同年龄组的不同动物进行比较，限制每组的年龄差异就很重要。测试2-3周大的小鼠时，建议在准确的年龄进行ABR测试；例如，产后日（P）14±0天或P21±0天。随着小鼠的变老，年龄变化的增加是可以接受的。例如，4周龄（P28±1天），6周龄（P42±2天），8周龄（P56±3天），14周龄（P98±3天），6月龄（P182±4天）），1岁（P365±7天）。当比较小鼠中的ABR数据时，这对于年龄匹配控制和突变组至关重要。在年龄较小的年龄（6-8周龄）以下，听觉系统仍在不断成熟，其阈值敏感度不断提高，直到6-8周龄时响应幅度也有所提高。听力开始于P12左右，直到大约4周大时，这种成熟特别迅速，因此，对于年龄匹配的年轻测试组而言，这一成熟尤为重要。
研究人员应认真考虑对小鼠进行盲目测试，以使实验人员在数据收集或数据分析时不了解单个动物的基因型（或其他参数）。重要的是在数据收集和分析过程中消除潜在的偏差来源。
考虑性别很重要，研究人员可能需要对雄性和雌性对照小鼠和突变型小鼠进行单独的分析，以充分揭示由雄性和雌性小鼠中存在的许多不同因素引起的反应差异。在听觉实验中，将性别视为生物变量（SABV）变得越来越重要。
研究人员应进行一系列试验性实验，以确定其反应和数据的变异性，并进行适当的功效计算，以帮助估计看到给定效应大小可能需要的实验动物数量。根据经验，从这些方法获得的数据很少呈正态分布（例如，由Shaprio-Wilk正态性检验确定），研究人员将需要确定参数统计检验还是非参数统计检验最适合其数据。在我们的研究中，通常情况下，至少需要6只小鼠的数据才能在足够的功效水平下进行统计比较，尽管如果响应变化更大，我们的目标是更大的样本量。
使用恒温加热毯系统以防止小鼠体温下降。麻醉的小鼠会很快变为低温，并且伴随的代谢率下降将严重影响内耳功能的效率，并导致在所有频率（大约20 dB升高），特别是在32 kHz以上（高于30 dB升高）下的人为的高阈值）（Henry and Chole，1984）。
使用消音室减少背景（掩蔽）声噪声。摊位也应接地（并因此充当法拉第笼），以确保较低水平的环境电噪声，这会干扰低阻抗记录系统。
确保将针电极插入皮下，以便与动物保持良好的电接触（较低的阻抗），并减少所记录迹线上的电噪声。此处使用的钩形确保了在许多动物上的准确且可复制的插入点，并有助于提供可复制的ABR波形形状。在插入时，将电极的钩状部分推过皮肤的捏，使皮肤位于电极的其余直轴上。尽管保留在皮肤中的针状电极的区域有限，但仍可实现小于≤的低阻抗。5kΩ（理想情况下为1-3kΩ），通过TDT电极探头进行测试。为了获得更好的记录，重要的是活动输入通道和参考输入通道的阻抗必须在匹配或相似的阻抗范围内。
确保鼠标达到足够的麻醉深度。使用此处建议的氯胺酮/甲苯噻嗪剂量，小鼠将迅速失去其正直和角膜反射。取消踏板后退反射可能需要更长的时间。从福利的角度来看，重要的是动物对针电极的插入无反应。此外，如果鼠标仅保持麻醉状态，它将保持较高的肌肉张力。这会在记录上引入过多的肌电活动，应避免。在示波器上查看电极活动时（而不是平均响应迹线），可以轻松识别此类噪声。可以暂停录制，如有需要，可以给麻醉加注，并在肌源性噪音消失后重新开始。
重要的是最小化这些电噪声源，以防止低振幅ABR波形被掩盖。这种掩盖会产生估计的ABR阈值的人为抬高，因为用于识别是否存在ABR的波形的波峰和波谷特征将在记录的本底噪声中被遮盖，并且仅在较高dB SPL时可见。
用于校准刺激系统的麦克风本身应定期进行校准（例如，每季度/每半年一次），以确保呈现给小鼠的声音水平在长时间内保持一致。如果可以使用适当的专业设备，则可以在用户自己的实验室中完成此操作，或者可以将麦克风退回给制造商进行维修和保养。重新校准。
所述的刺激和记录参数提供了一种可靠且省时的方法来估计高通量表型筛选中的ABR阈值。通过最小化记录环境中的声和电噪声源，使得对每个平均波形有贡献的相对较低数量的扫描记录（256）成为可能。许多其他研究需要使用更多的扫描（通常> 1000）来提供令人满意的波形。在该协议中，刺激以42.6 / s的相对较快速率显示。这有助于使来自英国50 Hz主电源的任何潜在噪声失去同步。许多其他研究使用较慢的呈现速度（<30 / s）。但是，我们使用的较高的刺激呈递率对录音的影响很小，并且可以缩短小鼠从麻醉中恢复之前的时间，从而有助于改善小鼠的健康。
由于在记录系统中没有使用任何伪影，因此平均迹线可能会受到体内其他电活动的显着影响。心电图活动有时可能与刺激重复率同步。动物呼吸节律引起的肌肉活动会影响所记录的短片段活动，轻度镇静动物的肌肉活动会突然爆发（几秒钟）。这些都会在记录的迹线上引入非ABR噪声/干扰。但是，这些是相对罕见的情况，如果需要，一旦完成主要的自动数据收集，就可以手动重复受影响的刺激频率/水平组合。
已经开发出该方法用于实验室小鼠。稍作修改，它就可以用于大多数哺乳动物。但是，这尚未经过测试。如果尝试记录其他物种的ABR，则实验人员应考虑该物种的听觉频率范围，并使用具有适当匹配频率范围的扬声器。TDT RZ6-A-P1多IO处理器既可以驱动电磁扬声器（例如TDT MF1扬声器），也可以驱动静电扬声器（例如TDT EC1或ES1）（如果需要检查对非常高的频率的响应）。

菜谱

氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉剂
1 ml氯胺酮HCl（Ketaset 100 mg / ml氯胺酮HCl或等价物）
0.5 ml盐酸赛拉嗪（Rompun，20 mg / ml盐酸赛拉嗪）
8.5毫升H 2 O
阿替咪唑混合物
0.2毫升安必妥（盐酸阿替美唑5毫克/毫升，辉瑞）
9.8毫升H 2 O

注意：混合物在室温下长期稳定。使用前，应将储存在冰箱中的任何稀释液温热至室温。多余的稀释溶液或溢出物可以通过焚化处理（与Clan Uni-Safe化学溢出剂结合后； Fisher Scientific）。打开后，库存瓶将在室温下保存，并使用授权的本地协议在28天后将未使用的内容物丢弃。

致谢

Wellcome和医学研究委员会对Karen P. Steel教授（伦敦国王学院和Wellcome Sanger研究所）的资助促进了这些方法的开发。这种方法的早期版本已在Ingham等（2011）中发表。Ingham 等人（2019）已发表了用于突变小鼠高通量筛选的完整实验方法和分析。Tim Folkard（英国诺丁汉医学研究委员会听力研究所）对此处使用的定制”Averager”和”Traceview”软件进行了早期开发。Brad N. Buran开发了确定波形峰值幅度和等待时间的软件（ https://github.com/bburan/abr）。在开发数据收集和分析方法时，Karen P. Steel教授和Selina A. Pearson博士（威康桑格研究所）提出了有益的建议。伦敦国王学院的Uwe Drescher教授提供了用于说明该方法的EphA2 突变小鼠（另请参见Ingham et al。，2017）。这里显示的一些数据是由Wellcome Sanger研究所的老鼠遗传学项目记录的，并已发表在Ingham等人（2019）中。

利益争夺

作者声明没有任何竞争性的金融或非金融利益。

伦理

根据英国内政部的规定和英国内政部颁发的1986年《英国动物（科学程序）法》（ASPA）进行研究，该研究得到伦敦国王学院和惠康·桑格研究所道德审查委员会的批准。使用这些许可下批准的方法对小鼠进行扑杀，以最大程度地减少遭受痛苦的可能性。

参考文献

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