材料和试剂

带有铝阳极氧化金属蓝盖的无菌直颈培养瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2177124）（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2903124）
50毫升无菌猎鹰管（SARSTEDT，目录号： 62.657.254 ）
2毫升无菌Eppendorf管（Greiner Bio One International，目录号： 623201 ）
1.5 ml无菌Eppendorf管（Greiner Bio One International，目录号： 616201 ）
一次性移液器吸头200 µl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号： 739290 ）
一次性移液器吸头1,000 µl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号： 686290 ）
洗瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，货号： 2401-0500 ）
黑色底的玻璃底96孔板（Porvair Sciences，目录号：324002）
黑色透明底96孔黑底塑料板（Greiner Bio One International，目录号： 675096 ）
石英搅拌杯（Hellma，目录号： 119004F-10-40 ）
镜头清洁纸（Fischer Scientific，Fisherbrand TM ，货号： 10605955 ）
注意：该产品已停产。
Filtropur S 0.2 µm过滤器（SARSTEDT，目录号： 83.1826.001 ）
包含sfTq2 ox -mNG FRET对的胞质和周质对照的质粒以及其他信息可在以下网站上找到： https://www.addgene.org/browse/article/28196682/
实验室洗瓶中70％的乙醇（VWR，Technisolv ®，目录号： 83801.360 ）
实验室冲洗瓶中的96％乙醇（VWR，Technisolv ®，目录号： 83804.360 ）
实验室洗瓶中的H 2 O
1 Mβ-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Duchefa Biochemie，目录号： I1401 ）
Hellmanex III（Hellma，目录号： 9-307 -011-4-507 ）
Bacto胰蛋白（（Duchefa Biochemie，目录号： T1332 ）
酵母提取物（Duchefa Biochemie，目录号： Y1333 ）
氯化钠（Merck，目录号： 106404 ）
葡萄糖（Duchefa Biochemie，目录号： G0802 ）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号： T4625-25G ）
L-赖氨酸单盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号： L8662 ）
氨苄西林原液100 mg/ml（Sigma-Aldrich，目录号： A9518 ）在50％乙醇中
氯霉素储备溶液25 mg/ml（Duchefa Biochemie，目录号： C0113 ）在50％乙醇中
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ·3H 2 O）（VWR，目录号： 26932.290 ）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Merck，目录号： 104873 ）
硫酸铵，（NH 4 ） 2 SO 4 （Sigma-Aldrich，目录号： A4418 ）
七水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Carl Roth，目录号： T888.1 ）
六水合硫酸亚铁（FeSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号： 215422 ）
四水合硝酸钙Ca（NO 3 ） 2 ·4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号： C1396 ）
L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号： A8094 ）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号： G8540 ）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号： T1895 ）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号： U1128 ）
氯化钾（VCl，目录号： 71003-522 ）
磷酸氢二钠二水合物（Na 2 HPO 4 ·2H 2 O）（Merck，目录号： 106580 ）
戊二醛25％（默克，目录号： 1042390250 ）
甲醛≥36.0％（Sigma-Aldrich，目录号： 47608 ）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号： L8662 ）
PBS缓冲液（pH 7.2）
TY介质（请参阅食谱）
20％葡萄糖溶液（请参阅食谱）
GB1介质（请参阅食谱）
储备液（请参阅食谱）
1. MM1-10x
2. MM2-10x
3. MM3-100x
4. MM4-100x
5. 维生素B1储备溶液（4 mg·ml -1 ）
6. 赖氨酸原液（20 mg·ml -1 ）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 1x）（请参阅食谱）
甲醛和戊二醛（FAGA）（请参阅食谱）

设备

P20，P200和 P1,000 Pipetman移液器（Gilson，目录号： F167300 ）
G76型Gyrotory水浴振荡器（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：G76或GFL-GesellschaftfürLabortechnik，目录号：1092），带有用于培养烧瓶的支架。
光谱仪（Biochrom，型号：天秤座S22 ）
压缩空气源
水净化系统（Purelab flex和ELGA LabWater的ELGA LC197-Biofilter，英国Laner End，HP14 3BY，英国）
注意：协议中所有H2O均表示来自水净化系统的水至少为18.0MΩ。
离心50毫升Falcon离心管（Eppendorf，型号： 5804 R ）
离心1.5和2.0 ml Eppendorf管（Eppendorf，型号： 5424 R ）
荧光分光光度计Quantamaster 2000-4（新泽西州光子技术国际公司），具有红色优化设置：R928P PMT管（185-900 nm），激发和发射光栅均为500 nm火焰（1200线/mm）
注意：光电倍增管（PMT）可以可靠地检测直至700 nm的荧光光谱，适用于上述方案。
光学滤镜
500/10 nm BrightLine ®单带通滤波器（Semrock，目录号： FF01-500/10 ）
ET510LP（色度，目录号： ET510lp ）
435/40 nm BrightLine ®单带通滤波器（Semrock，目录号： FF02-435/40 ）
458LP EdgeBasic™最有价值的长通边缘滤波器（Semrock，目录号： BLP01-458R ）
荧光扫描板阅读器（BioTek Instruments，型号： Synergy TM Mx ，目录号：SMATBC）
高压釜（三洋，目录号：MLS-3780）

软件

荧光分光光度计软件（PTI采集软件FeliX32 1.2版Build 56）
微孔板读取器软件Gen5版本2.00（Biotek）
Excel（Microsoft）

程序

FRET方法从头到尾包含几个步骤，每个主题都将对此进行讨论。图1中概述了该过程和部分。此协议描述了使用sfTq2 ox 和mNG的FRET分析，有关A和B部分的完整说明，请参见 https://bio-protocol.org/e2697。

图1.基于细菌光谱的FRET方法的工作流程。面板的标签对应于描述特定协议的部分。A.选择合适的FRET对并产生表达质粒。B.测试构建的质粒的功能。C.使培养物稳定生长，诱导FRET构建体的表达并收获细胞。D.样品制备和数据采集。E.数据分析。

为实验选择合适的FRET对并创建FP融合
1. 为实验选择合适的FRET对
  在开始FRET实验之前，应选择最合适的FRET对。迄今为止，FRET对在E的细胞质和周质中产生最高的能量转移速率。coli 是超级文件夹mTurquoise2 ox（sfTq2 ox ）（Meiresonne 等人，，2019年）-mNeonGreen（mNG）（Shaner 等人。< ，2013）。sfTq2 ox -mNG对的高FRET效率与它们各自的发射光谱和激发光谱的大量重叠以及它们的相当大的量子产率和消光系数有关（图2，表1）。可以想象，需要具有较低固有背景荧光的FRET对。为此，可以尝试单体Kusabira-Orange（mKO）（Karasawa等，2004）-mCherry（mCh）（Shaner等，2004）。 https://bio-protocol.org/e2697中介绍了mKO-mCh FRET协议以及其他替代性FRET对。
  
  图2. mTq2-mNG FRET对的光谱重叠和Forster距离。在左侧，mTq2的发射光谱与mNG的吸收光谱之间的光谱重叠。迄今为止，尚未隔离SfTq2 ox ，因此其光谱不可用。但是，由于细胞中mTq2和sfTq2 ox 的光谱特性相同，因此显示的mTq2光谱与sfTq2 ox 相同。在右侧，使用表1中的光谱特性绘制了mTq2-mNG，FRET对的理论FRET效率与生色团距离的函数关系，其中显示了mNG-mCh FRET对以作比较。R 0 是将产生50％能量转移的荧光团之间的距离。
  
  表1.此生物协议中描述的FRET对的信息
  
  *如原始论文所述（Meiresonne et al。，2017和2019）。
  
  注释：
  1. 对于表1中显示的R0值，最初发布的消光系数为72,000 M -1 cm -1 （Shaner 等人，，2004年）。基于检测准确度和样品条件，FP消光系数的描述会发生变化。FP研究的不断发展的领域表明，mCh的消光系数在85,000 M -1 cm -1 的范围内更大（Cranfill等，2016; Bindels等人，2017）。
  2. sfTq2 ox （和sfTq2）的量子产率通过荧光寿命近似于mTq2（Goedhart等，2012; Meiresonne等，2019）。
  3. 不同的FP对已成功用于细菌FRET。有关更多信息，请参阅 https://bio-protocol.org/e2697。<
2. 创建FP融合
  将编码目的蛋白的细菌基因与编码所述荧光蛋白之一的基因融合，并从诱导型表达载体表达。只要质粒兼容（不同的复制起点和不同的抗生素抗性标记）并且表达水平低（通常为2,000个蛋白质拷贝）以避免非特异性相互作用，则可以使用任何质粒表达系统。为了使FP和目标蛋白具有一定的运动自由度并减少空间位阻，在FP和蛋白之间添加连接子可能很有用。经常使用GGS重复序列，但在ARNNNN和其他氨基酸序列上也能获得良好的结果。另一个考虑因素是选择N端或C端融合。例如，应避免或规避编码信号序列以进行下游运输或加工的蛋白质的N端融合。另外，蛋白质的N末端或C末端可能对于其正常定位或功能至关重要。程序B讨论测试创建的融合。质粒的序列应在进一步实验之前确认。克隆和转换E的描述。质粒的大肠埃希菌超出了本协议的范围，但其他生物协议，如"[BIO101]标准克隆"和"[BIO101]制备和转化感受态E的井上方法"。大肠杆菌："超能力"细胞（He，2011； Im，2011）可能很有用。
测试FP融合
理想情况下，FP融合物应具有充分的功能，并以接近其天然水平的水平表达，同时仍可产生可测量的荧光强度。一旦在质粒上产生融合，就应该测试表达产物对表型，荧光和正确细胞定位的影响。如果未观察到荧光，则可通过蛋白质印迹分析（sfTq2 ox 的抗GFP，Invitrogen A6455 和抗mNG，色原 32F6 ）。融合可能破坏了目的蛋白的正常定位，功能和相互作用。可以通过修改链接器的长度或切换FP的位置来对此进行修改。一些蛋白质可能既不具有N融合功能，也不具有C端融合功能，但可以作为三明治融合蛋白起作用（van der Ploeg等，2015）。FP融合应弥补相同蛋白质缺失或耗竭菌株引起的功能丧失。互补测试将取决于基因的丢失是否导致表型。如果无法进行互补实验，则可以在野生型或缺失背景下进行FRET实验，但应记住，融合蛋白可能无法发挥功能，并且结果可能会被误解。
注意：基于质粒的FP融合蛋白是快速测试目标蛋白质或目标蛋白质相互作用的一种好方法。然而，由于化学计量失衡，基于质粒的互补并非总是可能的。在这种情况下，可以将FP-fusion插入原始位点的染色体中。实际上，对于容易的测定，优选使用成熟的FRET伴侣的染色体插入。但是，这也需要在等基因背景中进行染色体参照，因为细菌可能对质粒和基于染色体的蛋白质表达有不同的反应，这取决于质粒维持的生长差异和可能的自发荧光。

为FRET实验做准备
准备使用FP融合蛋白时，可用表达供体和受体的质粒转化感受态细胞。任何E。大肠杆菌菌株应该是合适的。因为我们对影响形态的蛋白质感兴趣，所以我们更喜欢使用形态同源的野生型菌株，例如MC4100或BW25113。
注意：如果使用缺失菌株，则参考和对照应为野生型。所描述的FRET分析需要至少三个参考样品，这些参考样品在与评估的相互作用具有相同遗传背景的细胞中表达。强烈建议使用阳性和阴性对照，包括表达与mNG融合的sfTq2 ox 的质粒和表达与不相关蛋白融合的sfTq2 ox 或mNG的两个质粒不要互动。最好的对照表达在与蛋白质相互作用发生的同一区域，以评估分子拥挤效应。还值得切换供体和受体的融合体（即蛋白1与sfTq2 ox 或mNG融合，而蛋白2具有相反的FP）。这是为了排除由于质粒拷贝数等导致的表达差异导致的结果偏差，并且发现的FRET值应相似。表2列出了最小的sfTq2 ox -mNG FRET实验的样品清单。

表2.最小FRET实验所需的样品和质粒

a 要检测两个目的蛋白之间的相互作用，至少需要三个参考。建议使用阳性和阴性对照。所描述的协议是针对两个兼容的质粒，它们具有与氯霉素抗性结合的p15复制起点和与氨苄青霉素抗性结合的ColE1复制起点。两种质粒均具有弱的trc 99A启动子和两个终止子。
*用于细胞质和周质表达的几个阳性对照质粒可在 https://www.addgene.org上获得/browse/article/28196682 /。
稳态生长，诱导和收获细胞
在丰富培养基中生长的细菌细胞通常包含高浓度的自发荧光分子，从而降低了信噪比。因此，细胞应在基本培养基中生长，不建议在丰富培养基中进行FRET实验。为了比较表达FRET构建体的各种细菌培养物，在诱导蛋白质表达之前，细胞会在大约20代内生长到稳态（图3）。这样可以确保所有样品中相同的自发荧光背景。在诱导表达至少2倍质量后，将细胞固定并收获。
1. 准备在5 ml TY +氨苄青霉素100 µg/ml +氯霉素25 µg/ml + 0.5％葡萄糖培养基中进行FRET实验所需的所有菌株的起始培养物，并在37°C下摇动直至细菌生长可见（第0天）。
  注意：将葡萄糖加入培养基中以抑制质粒中lacIq调控基因的表达。
2. 使用发酵剂培养液接种25 ml（1：250）的Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素，并在摇动下于28°C继续过夜生长。
3. 第1天。。在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素中稀释过夜培养物1：250，并在摇动下继续在28°C下生长。
  注意：从现在开始，定期测量并记录培养物的OD 450 值，并且不要让其达到0.2以上。当文化接近时，用新鲜的预热培养基稀释该值。
4. 使用提供的Excel工作表' Growth Calculation.xlsx "，并用它来计算稀释倍数，以便在第二天早晨继续进行实验时达到OD 450 值为0.1。
5. 第2天。重复在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素中生长，同时将OD 450 值保持在0.2以下，并在第二天早上稀释，如步骤C4所示。
6. 第3天。重复在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素和氯霉素中生长，同时将OD 450 值保持在0.2以下，并在第二天早晨稀释，如步骤C4所示，但这一次的目的是在35毫升新鲜Gb1 +氨苄青霉素+氯霉素中的OD 450 值为0.025。
7. 第4天。测量培养物的OD 450 值，如果它们在0.03-0.04左右，则通过添加适当浓度的IPTG（eg < ，10-20 µM）并继续增长。
8. 在培养物的OD 450 值达到约0.2之前，请准备足够量的FAGA固定剂（方案5）。
  注意：FAGA的总体积因待固定培养物的总体积而异，固定12.5 ml培养物需要1 ml FAGA。
9. 当细胞的OD 450 值达到0.2时，用FAGA将细胞在28°C的振荡水浴中固定10分钟，其数量取决于剩余的培养物体积。
10. 倒入50 ml Falcon管中的固定培养物，并在室温（Eppendorf 5804 R）下以6,300 x g 离心10分钟以沉淀细胞。
11. 弃去上清液，在1.5 ml Eppendorf管中用1 ml PBS洗涤3次，在台式离心机（Eppendorf 5424 R）中于室温以4,600 x g 离心5分钟。
12. 将最后的沉淀重悬于1 ml PBS中，并将样品在4°C下储存过夜，并在第二天进行测量。
  注意：sfTq2 ox 和mNG折叠快，它们的生色团快速成熟，因此可以考虑直接测量，但是在第二天进行光谱测量更为实用。
  
  图3.稳态增长示例。基于MC4100的E的烧瓶培养生长曲线。大肠埃希菌培养物在表达FP融合蛋白的28°C的Gb1中生长到稳态圆圈代表过夜稀释的时间点。在第4天，用IPTG（箭头）诱导培养物以诱导FP融合物的产生。EV（空向量）文化不表达任何FP并作为对照。X轴在OD 450 中表示指数增长。诱导后至少两次质量加倍后，将细胞固定并收获（星号）。该数字改编自（Meiresonne et al。，2017）。
样品制备和数据采集
1. 如步骤C10所述沉淀细胞，并重悬于1 ml PBS中。
2. 用新鲜的PBS稀释细胞，以制备至少1300 µl OD 450 值为1.00±0.005的样品，并向搅拌的石英比色皿中添加1200 µl。
  注释：
  1. 稀释可以在光谱仪内进行；OD 450 值越相等；结果越可靠。
  2. 不要忘记在测量之前将电磁搅拌器添加到比色杯中。
  3. 从理论上讲，塑料比色杯可用于测量可见波长处的光谱，但是，该协议中未描述的实验并未尝试过，应首先进行测试。每个样本的比色皿应相同，以避免背景差异。
3. 使用表3中指示的设置和光学滤镜测量mNG发射光谱，并在"使用荧光计测量光谱 –荧光计设置和实际设置"中进行说明。
  
  表3.用于荧光计光谱测量的滤波器设置
  
  可以使用具有相似传输属性的 a 过滤器。
4. 使用表3中指示和"使用荧光计测量光谱 –荧光计设置和实际设置"中所述的设置和光学滤光片来测量施主发射光谱。
  注意：建议以相同顺序测量每个样品的mNG和sfTq2 ox 光谱，以防止FP可能存在差异漂白
5. 对每个样品重复步骤D2-D4，并在测量开始和所有测量结束时仅测量空白PBS样品。这使您可以验证仪器响应的任何变化。
6. 将数据保存为可以导出到Microsoft Excel的任何方便的文件格式。
  注释：
  1. 在将新样品装入石英比色杯之前，需要按照以下清洁规程中概述的步骤彻底清洁它。
  2. 通过保存OD 450 = 1.00样品，可以将它们直接用于"使用板读数器测量光谱"中所述的板读数器进行光谱测量。
使用荧光计测量光谱 –荧光计设置和实际设置
发射光谱使用荧光计测量。荧光计应激发窄带波长的样品，然后发出被测量的荧光。荧光计的示意图如图4所示。光源发出白光，该白光通过狭缝到达激发单色仪，在该单色仪中被分成波长分量。光在通过激发滤光镜之前穿过狭缝，并撞击石英比色皿中的样品悬浮液。样品中的细胞将被激发并向各个方向发光，但是激发光也会从它们中散射出来。以90°的角度，散射光被发射滤光器过滤，荧光发射通过进入发射单色仪的狭缝。在此，发射波长被扫描并通过最后一个缝隙，然后进入光电倍增管，在那里将光子的量子转换成可测量的电流。产生的发射光谱是计算FRET所需的原始数据。滤光片和测量设置显示在表3中。缝隙宽度通常设置为6 nm，如果荧光蛋白表达良好，通常会产生良好的结果。较小的狭缝宽度会导致更具体的测量结果，但也会使通过的光更少，因此只有在荧光信号非常高时才应将狭缝闭合。如果荧光信号低，则缝隙可能会变宽，但这会导致信号特异性降低。当背景荧光成为问题时，它会成比例地增加。
注释：
1. 白光源必须先加热，然后才能稳定输出光。打开灯后三十分钟，检查灯泡的功率是否为75 W，如果没有调整。其他荧光计将有不同的要求。
2. 使用其他白光源或设备可能需要不同的准备。
图4.在荧光计中测量样品的示意图。单色仪上的黑色和灰色双圆圈表示可调缝。

协议清洁石英比色皿
1. 用H 2 O充分冲洗比色皿的内部和外部。
2. 小心地甩掉多余的H 2 O。
3. 用70％乙醇充分冲洗内部和外部。
4. 小心甩掉多余的70％乙醇。
5. 重复步骤ad（协议清洁石英比色杯）三遍。
6. 用96％乙醇充分冲洗内部和外部。
7. 小心地抖掉96％的过量乙醇。
8. 用压缩空气吹干比色杯。
9. 用镜头纸擦亮比色杯，以消除意外的污渍，例如指纹。现在，比色杯已正确清洁，可以容纳样品进行测量。
  注释：
  1. 用相同的漂洗程序在手掌上清洗电磁搅拌器豆。
  2. 最后一次测量后，再洗涤所有比色皿和搅拌器豆，然后浸入2％Hellmanex III中进行保存。如果较长时间不需要比色杯，请将其清洁干燥存放。
  3. 石英比色皿易碎且昂贵，应格外小心。仅用手指靠近开口的地方触摸比色杯，以防止在石英的重要部分上留下指纹。如图5所示，将食杯放在食指和拇指之间，同时用小指或无名指支撑底部。
  图5.如何正确放置石英比色杯的动画片（即，在小指支撑的拇指和食指之间）
使用酶标仪测量光谱
测量样品发射光谱的便捷方法是使用荧光板读数器。请注意，大多数荧光板读取器的灵敏度低于专用荧光计的灵敏度，并且提供较弱的荧光信号。如果荧光强度低，则应使用荧光计。该生物协议描述了BioTek synergy MX读板器的使用，该读板器具有激发和发射单色仪，没有可能进行额外的光学过滤。此外，该读板器具有狭缝，最小开口为9 nm。因此，平均而言，来自印版读取器的较低信噪比和较不具体的信号可能会导致混音问题。因此，建议首先使用荧光计牢固地建立FRET相互作用，然后使用酶标仪确认它们。如果结果可重现，则只能使用酶标仪进行实验。
用于固定细胞的协议板读取器FRET
1. 如步骤D1-D2中所述，准备OD 450 值为1.00±0.005的样品。
2. 在玻璃底的黑壁96孔板中分装200 µl样品。如果进行八次重复，则在96孔板中有11个准备好的样品和1个PBS测量空间。
3. 使用表4中所示的设置测量每个孔的供体和受体发射光谱。
4. 以Excel兼容格式导出排放数据并绘制重复图，以检查明显的外围数据。
5. 根据与其他重复样本的较大且明显的偏差排除可能的异常值，并对受体和供体发射光谱求平均值。这些数据将用于频谱分解和FRET计算。
表4.使用酶标仪进行光谱测量的设置

*实验之间的最佳增益可能会有所不同。最好使信号略低一些，而不要使检测器过饱和。
注意：在光谱测量之前在酶标仪中测量OD 450 值将指示样品之间的相似程度。
数据分析
当通过荧光计或酶标仪测量所有样品的受体和供体发射光谱时，它们可以不混合。光谱解混将根据提供的参考将发射数据分解成其成分。sfTq2 ox 通道由背景发射，仅sfTq2 ox 发射，直接激发的mNG发射以及可能的FRET mNG发射组成（图6）。mNG通道由背景发射和仅mNG发射组成。根据该光谱，可以通过分离使用背景光谱和参考光谱来计算样品中mNG的量。知道了mNG荧光的数量，可以计算出由于包含供体和受体的样品中的供体和受体交叉激发而引起的mNG荧光量。利用参考光谱和关于样品中mNG量的知识，可以将样品的发射光谱分为背景光谱，sfTq2 ox 光谱和mNG光谱。剩下的是与mNG光谱形状相同的光谱，如果未发生敏化发射（能量转移），则无法解释。该额外的mNG信号对应于能量转移的数量。（Alexeeva et al。，2010）的补充数据详细说明了基于生物物理工作的计算，超出了协议的范围（Clegg，1992; Clegg et al。，1992； Wlodarczyk 等人，，2008； Gadella，2009）。在补充信息中，提供了即用型Excel工作表，用于根据使用荧光计或酶标仪' sfTq2ox-mNG.xlsx''sfTq2ox-mNG platereader.xlsx '。

图6. sfTq2ox-mNG FRET分析的原理。 A. mTq2和mNG的激发和发射光谱，指示用于测量mNG通道（左）或sfTq2 ox <的波长/sup>频道（右）。粗虚线表示所使用的激发波长。蓝色阴影区域表示mTq2发射光谱和mNG激发光谱之间的光谱重叠。灰色阴影区域表示测量发射的波长。B.测量样品以计算周质FRET。需要背景，mNG和sfTq2 ox 的引用来计算它们对样本中FRET的贡献。C.串联FRET样品的混合，测得的光谱显示为黑点（串联），计算的光谱显示为实心红线（分离计算）。mNG通道的测量光谱由背景荧光（未混合的空细胞）和在504 nm激发的样品中存在的mNG（未混合的受体）的量组成。mNG的直接激发用于确定样品中存在的mNG量。然后，该量用于计算在sfTq2 ox 激发的样品中检测到多少多余的mNG（未混合的SE）。sfTq2ox通道的测量光谱包含背景（未混合的空细胞），sfTq2 ox （未混合的供体）和mNG（未混合的受体）荧光以及敏化发射（未混合的SE），这是多余的荧光分解算法不能归因于mNG的直接激发。D.测量光谱与计算光谱之间的差异代表了无法归因于参考成分的信号，并且是解混质量的度量。

使用分解表的协议
图7 显示了分解过程在计算机屏幕上的显示方式。补充数据。
注意：请注意，原始数据可能会根据所使用的设备而具有不同的输出格式，并进行相应的调整。
1. 将光谱数据复制到适当的excel表1"原始数据"中。
2. 从第2张"负PBS"中的所有样品中减去PBS测量值。
3. 将空载体，受体参考和供体参考复制在工作表3"数据"中的指定位置。这将自动从受体和供体参考光谱中减去背景信号。
4. 将样品数据复制到工作表3"数据"中的指定位置，工作表将根据给定的参考取消混合这些光谱。
  注意：参考和样品光谱绘制在第3页的底部以进行检查。
5. 检查第4页"结果"上的拆开概述，如下所述。
6. 将结果复制粘贴到工作表5"摘要"中。
7. 对其余样本重复步骤4-6。
  
  图7.屏幕上显示的FRET效率计算的分解过程。将不直接使用的原始供体和受体解体计算将显示在补充文件的高分辨率屏幕快照中。 'Unmixing screens.pptx'。
什么决定了良好的衡量标准？
光谱解混高度取决于应在相同条件下测量的清晰荧光信号。如"使用解混纸的协议"中所述，通过从它们各自的发射测量值中减去PBS和空细胞数据来获得供体和受体参考光谱。这将产生仅sfTq2 ox 或仅mNG的干净发射光谱。有时可以看到不再类似于测量的FP甚至是负的光谱。这可能是由于空细胞样品中的自发荧光水平高以及参考样品中的FP信号低引起的。如果其中一个参考文献不好，则光谱的混合将不会给出可信赖的结果。可替代地，可以使用先前测量的参考光谱来仍然获得样品的FRET值的粗略指示。不建议将这些值用作确定值，并且需要重复实验以产生可信赖的数据。当实验产生良好的参考时，可以将样本数据混合在一起。不能归因于mNG频谱的发射信号称为解混差。解混差是衡量所测FRET光谱质量的好方法，在理想实验中，它应为零。更实际地，它应该是所测光谱的一小部分，如图6D所示。

数据分析

该生物协议描述了如何制备，进行和分析体内细菌FRET实验。在相关部分（程序E），提供了有关数据分析的信息，并提供了有关深入技术信息的参考。如果每次都严格遵守该协议，则结果数据将非常相似。可以使用标准置信区间统计方法来计算获得的FRET值的显着性。由于拥挤，FRET值应明显高于从非相互作用样品获得的值。对于此分析，可以使用标准t检验。

菜谱

TY培养基（1 L）
10克Bacto胰蛋白<< br /> 5克酵母提取物
5克NaCl
加入H 2 O直至1 L，并在121°C高压灭菌15分钟
20％葡萄糖溶液（200毫升）
40克葡萄糖
加入最多200 ml的H 2 O，然后用Filtropur S 0.2 µm过滤器过滤
储备液
1. MM1-10x（1公升）
  63.3 g K 2 HPO 4 ·3H 2 O
  29.5克KH 2 PO 4
  加入H 2 O直至1 L，并在121°C下高压灭菌15分钟
2. MM2-10x（1公升）
  10.5克（NH 4 ） 2 SO 4
  1克MgSO 4 ·7H 2 O
  加入H 2 O直至1 L，并在121°C下高压灭菌15分钟
3. MM3-100x（1升）
  28 mg FeSO 4 ·7H 2 O
  710 mg Ca（NO 3 ） 2 ·4H 2 O
  加入H 2 O直至1 L，并在121°C下高压灭菌15分钟
  注意：灭菌后，MM3将显示红色沉淀，移液时应使其沉淀而不被触摸。
4. MM4-100x（50毫升）
  250毫克L-精氨酸
  250毫克L-谷氨酰胺
  10 mg胸苷
  100毫克尿嘧啶
  加入H 2 O直至50 ml，并用Filtropur S 0.2 µm过滤器过滤
5. 维生素B1储液（4 mg·ml -1 ）（50 ml）
  200毫克盐酸硫胺素
  加入H 2 O直至50 ml，并用Filtropur S 0.2 µm过滤器过滤
6. 赖氨酸原液（20 mg·ml -1 ）（50 ml）
  1克赖氨酸
  加入最多50 ml的H 2 O，然后用Filtropur S 0.2 µm过滤器过滤除菌
Gb1培养基（1 L）（使用无菌技术）
<身体>

100毫升
MM1-10x

100毫升
MM2-10x

10毫升
MM3-100x

10毫升
MM4-100x

注意：对于基于BW25113，TB28和MG1655的大肠杆菌菌株，必须将MM4-100x添加到GB1培养基中。
<身体>

20毫升
20％葡萄糖

1毫升
4 mg/ml盐酸硫胺素

2.5毫升
20 mg/ml L-赖氨酸盐酸盐

1毫升
100 mg/ml氨苄青霉素

1毫升
25 mg/ml氯霉素

添加无菌的H 2 O至1 L
磷酸盐缓冲盐水（PBS 1x）
PBS缓冲液（pH 7.2）
140毫米氯化钠
27 mM氯化钾
10 mM Na 2 HPO 4 ·2H 2 O
2毫米KH 2 PO 4
甲醛和戊二醛（FAGA）固定剂
每1 ml甲醛中添加21 µl戊二醛

致谢

此生物协议是 https：//bio-protocol的sfTq2 ox -mNG专用改编.org/e2697 ，由Svetlana Alexeeva和Renévan der Ploeg共同撰写。在以下出版物中使用了这种生物协议的改编版（Alexeeva et al。，2010年； Frapontont et al。，2011年； van der Ploeg et al ，2013和2015； Meiresonne 等，2017和2019）。NYM得到了NWO，ALW开放计划（822.02.019）和HFSP计划RGP0034/2013的支持。欧洲委员会通过国际培训网络Train2Target（721484）支持EC和LMYM。

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