材料和试剂

Sterilin TM 标准90 mm培养皿（Thermo Scientific，目录号：101VIRR），在室温下保存
室温保存的12孔细胞培养板（SPL，目录号：30012）
盖玻片18毫米圈（Thermo-Menzel，目录号：CB00180RA1），在室温下保存
血细胞计数器（HBG，目录号：9010-01），在室温下保存
显微镜载玻片（Thermo Scientific，目录号：6776214），在室温下保存
HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573），存储在液氮中
山羊抗ELMO1抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-21651），在4°C下储存
小鼠抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804），储存在-20°C
兔抗β-微管蛋白抗体（Abcam，目录号：AB6046）
驴抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附的二抗Alexa Fluor 488（Invitrogen，目录号：A21206），在4°C下存储
胎牛血清（HyClone，目录号：SV30160.03），在-20°C下保存
pCMV-Tag2B向量（Aligent，目录号：211172），存储在-20°C
T4 DNA连接酶（1 U /μl）（Thermo Scientific，目录号：15224025），储存在-20°C
BamHI（10 U /μl）（Thermo Scientific，目录号：ER0055），储存在-20°C
XhoI（10 U /μl）（Thermo Scientific，目录号：ER0691），储存在-20°C
TIANprep微型质粒试剂盒（TIANGEN，目录号：DP103），在室温下保存
QuikChange II定点诱变试剂盒（安捷伦，目录号：200523），储存在-20°C下
Phusion高保真PCR试剂盒（Thermo Scientific，目录号：F553S），储存在-20°C
UltraPure TM 琼脂糖（Invitrogen，目录号：16500500），在室温下保存
TAE缓冲液（Tris-acetate-EDTA）（50x）（Thermo Scientific，目录号：B49），在室温下保存
UltraPure TM 溴化乙锭，10 mg / ml（Invitrogen，目录号：15585011），在室温下保存
1 kb Plus DNA梯子（New England Biolabs，目录号：N3200），在-20°C下保存
Luria Broth Base，粉末（Invitrogen，目录号：12795084），在室温下保存
透明指甲油
LB琼脂，粉末（Invitrogen，目录号：22700041），在室温下保存
氨苄西林钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A0166），储存于4°C
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：60615），储存于4°C
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P7280），储存在-20°C
DMEM（HyClone，目录号：SH30021.01），储存在4°C
胰蛋白酶-EDTA 0.05％（Gibco，目录号：25300062），在-20°C下保存
Opti-MEM还原的血清培养基（Gibco，目录号：31985088），在4°C下储存
X-tremeGENE TM 9 DNA转染试剂（Sigma-Aldrich，目录号：6365779001），在4°C下保存
PBS（Gibco，目录号：10010023），在室温下保存
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148），储存于4°C
Triton X-100（Anatrace，目录号：T1001500ML），在室温下保存
Duolink ®原位红色入门套件鼠标/山羊（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92103），在-20°C下存储
1个TAE缓冲区（请参阅食谱）
聚-D-赖氨酸溶液（请参阅食谱）
4％多聚甲醛（新鲜配制）（请参阅食谱）
1个连接缓冲液（请参阅配方）
1x放大红色（请参阅食谱）
洗涤缓冲液A（请参阅食谱）
洗涤缓冲液B（请参见食谱）

设备

水浴（Labnet，型号：W1106）
加热块（Labnet，型号：D1301-230V）
紫外线透射仪（Accuris，型号：E3000）
T100 TM 热循环仪（Bio-rad）＆nbsp;
Heratherm TM 紧凑型微生物培养箱（37°C，Thermo Scientific）
Forma TM 系列II 3110带水套的CO 2 培养箱（37°C，5％CO 2 ，Thermo Scientific）
配备QI2 高分辨率显微镜相机（尼康）的荧光显微镜（尼康，型号：Eclipse Ni-U ）

软件

NIS-Elements基础研究（Nikon）
棱镜（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

ELMO1 1-315 的哺乳动物表达构建体的产生
1. 使用QuikChange II定点诱变试剂盒（图2），进行定点诱变以在pcDNA3-N-Myc-Elmo1中的ELMO1残基315之后引入终止密码子。表1列出了使用的诱变引物。
  
  图2. ELMO1片段构建体的示意图。进行定点诱变，在pcDNA3-N-Myc-Elmo1中的ELMO1残基315之后产生终止密码子，从而生成ELMO1 1-315 < / sup>片段。通过PCR从pcDNA3-N-Myc-Elmo1中扩增出ELMO1 315-727 的cDNA，并将该产物插入pCMV-Tag2B中以表达N端FLAG标记的蛋白。星号表示突变位点。数字表示ELMO1中的氨基酸残基编号。
  
  表1。用于产生ELMO1片段构建体的引物。引物1和2用于定点诱变，将终止密码子引入pcDNA3-N-Myc-Elmo1。以pcDNA3-N-Myc-Elmo1为模板，使用引物3和4扩增ELMO1 315-727 片段。
2. 将诱变产物转化为DH5α感受态 E。42°C通过热休克1分钟来培养大肠杆菌细胞。
3. 用100μg/ ml氨苄青霉素将转化体接种在LB琼脂平板上。
4. 将板在37°C的培养箱中孵育过夜。
5. 用100μg/ ml氨苄青霉素在5 ml LB中接种分离的菌落，并在37°C下生长过夜。
6. 使用TIANprep Mini Plasmid Kit分离质粒DNA。
7. 进行DNA测序以确认终止密码子的引入。
FLAG-ELMO1 315-727 的哺乳动物表达构建体的产生
1. 以pcDNA3-N-Myc-Elmo1为模板，通过Phusion高保真PCR试剂盒进行聚合酶链反应（PCR），以获得编码为ELMO1 315-727 片段的cDNA。表1列出了使用的引物。
2. 通过在1x TAE缓冲液中的含0.2μg/ ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶解析PCR产物。
3. 电泳后，使用紫外线透射仪观察PCR产物，并用剃须刀切除PCR产物（〜1.2 kb）。
4. 使用MEGAquick-spin TM Plus总片段DNA纯化试剂盒从凝胶中纯化PCR产物。
5. 在37°C水浴中，将纯化的ELMO1 315-727 PCR产物和pCMV-Tag2B（带有N端FLAG标签的载体）与BamHI和XhoI一起消化2小时。
6. 使用MEGAquick-spin TM Plus总片段DNA纯化试剂盒纯化消化产物。
7. 在16°C水浴中，用T4 DNA连接酶将消化的ELMO1 315-727 片段和线性化的pCMV-Tag2B载体连接过夜。
8. 按照步骤A2-A6所述转化连接产物。选择应使用50μg/ ml卡那霉素。
9. 进行DNA测序以确认将ELMO1 315-727 编码cDNA成功插入pCMV-Tag2B。
细胞制备和转染
1. 在37℃培养箱中，在12孔细胞培养板中用5μg/ ml聚D-赖氨酸溶液涂覆18 mm盖玻片过夜。
  注意：使用前要消毒盖玻片。
2. 用蒸馏水清洗盖玻片一次。
3. 在预涂的18毫米盖玻片上以0.4 x 105个细胞的密度将HEK293细胞接种在补充有10％FBS的1 ml DMEM培养基中。
4. 24小时后，将myc-ELMO1 1-315 和FLAG-ELMO1 315-727 的哺乳动物表达构建体与空载体（EV），FE65或FE65一起转染细胞。根据制造商的说明，在Opti-MEM还原的血清培养基中使用X-tremeGENE TM 9 DNA转染试剂对FE65 K48A / R51A（FE65m，ELMO1结合缺陷型FE65突变体）进行了稀释（表2）。 >
  表2转染组合用于研究FE65在ELMO1分子内相互作用中的作用。将HEK293细胞与EV，FE65或FE65m以及ELMO1 1-315 和ELMO1共转染 315-727 以1：1：1的比例构建。所有转染均接受相同量的DNA。”+”表示质粒的存在，而“-”表示质粒的不存在。
细胞固定和邻近连接测定
注：洗涤缓冲液A，洗涤缓冲液B，PLA探针抗山羊MINUS，PLA探针抗小鼠PLUS，抗体稀释剂，连接酶，5x连接缓冲液，聚合酶，5x扩增红色和带有DAPI的Duolink原位安装介质是在Duolink ®原位红色入门工具包鼠标/山羊中提供。请参见图3了解PLA的工作流程。

图3.时间线说明了使用Duolink ® 原位的ELMO1片段的PLA工作流程。 em> 红色入门套件鼠标/山羊
1. 转染24小时后，用PBS洗涤细胞一次，并在室温下用4％多聚甲醛固定细胞10分钟。
2. 用PBS洗涤固定的细胞3次。
3. 在室温下用0.1％Triton X-100 / PBS透化细胞15分钟。
4. 在室温下用5％FBS / PBS封闭细胞30分钟。
5. 稀释山羊抗ELMO1（识别myc-ELMO1 1-315 ）（1：100），小鼠抗FLAG（识别FLAG-ELMO1 315-727 ）（1 ：1000）和含5％FBS / PBS的兔抗β-微管蛋白（1：200）抗体，并在室温下用80μl稀释的抗体混合物对细胞染色1小时。
  注意：所用的一抗浓度对于获得高质量的PLA图像至关重要，应进行优化。
6. 用PBS洗涤细胞五次。
7. 用5％FBS / PBS稀释Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔IgG（1：1000）抗体，在室温下于黑暗中将细胞染色1小时。
8. 用PBS洗涤细胞五次。
9. 在室温下于黑暗中用洗涤缓冲液A洗涤细胞两次，每次5分钟。
10. 向每个盖玻片中加入80μlPLA探针反应混合物，并在37°C的潮湿培养箱中孵育1小时。
  注：对于每个反应，将16μlPLA探针抗山羊MINUS（与寡核苷酸MINUS缀合的驴抗山羊二抗）与16μlPLA探针抗小鼠PLUS（与之共轭的驴抗小鼠二抗）混合寡核苷酸PLUS）加入48μl抗体稀释液中，并在室温下孵育20分钟，然后使用。
11. 在室温下于黑暗中用洗涤缓冲液A洗涤盖玻片两次，持续5分钟。
12. 将80μl连接反应混合物添加到每个盖玻片中，并在37°C湿润的培养箱中孵育30分钟。
  注意：对于每个反应，将2μl连接酶添加到78μl1x连接缓冲液中。
13. 在室温下于黑暗中用洗涤缓冲液A洗涤盖玻片两次，持续5分钟。
14. 向每个盖玻片中加入80μl扩增反应混合物，并在加湿的37°C恒温箱中孵育100分钟。
  注意：对于每个反应，将1μl聚合酶添加到79μl1x扩增红中。
15. 在室温下于黑暗中，用洗涤缓冲液B清洗盖玻片两次，持续10分钟。
16. 在室温下，在黑暗中，用0.01x洗涤缓冲液B洗涤盖玻片一次，持续1分钟。
17. 使用最少的带有DAPI的Duolink Insitu 固定介质将盖玻片固定在显微镜载玻片上。
18. 用透明的指甲油密封已安装的防护玻璃的边缘。
19. 使用尼康荧光显微镜，使用60倍水浸镜头捕获细胞图像。
  注意：如果需要，将载玻片在黑暗中于4°C下保存。

数据分析

显微镜载玻片由带有60倍水浸镜头的尼康荧光显微镜成像。FITC和TRITC过滤器分别用于可视化β-微管蛋白和PLA信号。计算细胞内离散的荧光PLA点的数量。比较不同转染中每个细胞的PLA信号平均数，以研究两个片段之间相互作用的变化。计数来自至少60个细胞的PLA信号，并进行三个独立的实验。统计分析是通过Bonferroni事后检验使用单方差分析（ANOVA）进行的。

代表数据
最近，我们证明了PLA在细胞中ELMO1 1-315 和ELMO1 315-727 的相互作用，它们分别包含其EID和EAD。此外，在与野生型FE65共转染的细胞中，PLA信号的数量显着减少，但结合缺陷型突变体（ ie ，FE65m）却没有降低（图4）。PLA的这些发现与经典蛋白质结合测定的结果一致（Li et al。，2018）。

图4.代表性图像和PLA信号量化。用myc-ELMO1 1-315 和FLAG-ELMO1 315-727 转染HEK293细胞以及空向量（EV），FE65或FE65m。转染24小时后，将细胞固定并进行PLA。在每次转染中计数来自至少60个细胞的PLA信号数，并进行三个独立的实验。条形图显示了不同转染中的相对PLA信号（相对于EV的倍数变化）。* P ＆lt; 0.001。误差棒是SEM。仅在转染FE65的细胞中观察到PLA信号的显着降低，而在EV或FE65m转染的细胞中未观察到。β微管蛋白和细胞核分别染色，作为形态学和核标记。比例尺= 10μm。（这项研究最初发表在《生物化学杂志》上。LiW，Tam KMV，Chan WWR，Koon AC，Ngo JCK，Chan HYE和Lau KF。神经元衔接子FE65 通过募集和激活ELMO1 刺激Rac1介导的神经突生长。J 。生物化学.2018; 293（20）：7674-7688。©美国生物化学与分子生物学学会）

菜谱

1个TAE缓冲区
用蒸馏水将50倍原液稀释至1倍
聚-D-赖氨酸溶液
5毫克聚D-赖氨酸
5毫升蒸馏水
将5 mg聚D-赖氨酸溶解在5 ml蒸馏水中以得到储备溶液（200x）
将储备溶液等分储存在-20°C
4％多聚甲醛（新鲜配制）
0.4克低聚甲醛粉末
10毫升PBS
1. 将0.4 g低聚甲醛粉末加到10 ml PBS中
2. 在70°C水浴中孵育直至粉末溶解
3. 在室温下冷却溶液
4. 用0.22μm注射器过滤器过滤溶液
1个连接缓冲液
对于每个反应，用64μl蒸馏水稀释16μl5x连接缓冲液
1x放大红色
对于每个反应，用64μl蒸馏水稀释16μl5x扩增红色
洗涤缓冲液A
0.01 M Tris
0.15 M氯化钠
0.05％吐温20
pH值7.4
洗涤缓冲液B
0.2 M Tris
0.1 M NaCl
pH 7.5

致谢

这项工作得到了香港研究资助局，香港健康与医学研究基金会，中大直接资助计划和联合大学捐赠基金的资助。该协议改编自以前的工作。感谢Jean-FrançoisCôté教授（蒙特利尔临床研究所）提供pcDNA3-N-Myc-Elmo1的哺乳动物表达构建体。

利益争夺

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

参考文献

Li W.，Tam，KMV，Chan，WWR，Koon，AC，Ngo，JCK，Chan，HYE和Lau，KF（2018）。神经元适配器FE65通过募集并激活ELMO1来刺激Rac1介导的神经突生长。 J Biol Chem 293（20）：7674-7688。
Miernyk，JA和Thelen，JJ（2008）。发现蛋白质间相互作用的生化方法。植物J 53（4）：597-609。
Ohad，N.，Shichrur，K.和Yalovsky，S.（2007）。通过双分子荧光互补分析植物中蛋白质与蛋白质的相互作用。植物生理学杂志145（4）：1090-1099。
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Patel，M.，Pelletier，A.和Cote，JF（2011）。对ELMO法规开放：DOCK180 / ELMO复合体控制Rac信号的新见解。小型GTPases 2（5）：268-275。
I. Weibrecht，KJ Leuchowius，CM Clausson，Conze，T.，Jarvius，M.，Howell，WM，Kamali-Moghaddam，M.和Soderberg，O.（2010）。邻近结扎分析：蛋白质组学工具箱中的最新功能。 Expert Rev蛋白质组学 7（3）：401-409。