材料和试剂

2.5 ml鲁尔锁注射器（Terumo，Tokyo，Japan，货号：SS-02LZ）
三通旋塞阀（Terumo，货号：TS-TR2K）
26 G针（Terumo，货号：NN-2613S）
18 G针（Terumo，货号：NN-1838S）
1 ml注射器（Terumo，目录号：SS-01T）
50 ml管（Greiner，Kremsmünster，Austria，目录号227261）
2 ml管（INAOPTIKA，日本大阪，目录号：SC-0200）
小鼠：C57BL / 6J，雌性，7-12周大（日本SLC，静冈，日本）
1 mg / ml佐剂，完整的H37 Ra（BD Difco，Franklin Lakes，NJ，目录号231131）
M。结核 H37 Ra（BD Difco，目录号：231141）
百日咳毒素来源于百日咳博德特氏菌冻干粉（密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司，目录号：P7208）
髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白35-55（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，纯度：> 95％，Scrum，东京，日本）
5 mg / ml咪达唑仑（Dormicum，Astellas Pharma，Tokyo，Japan）
5 mg / ml布托啡诺（Vetorphale，明治制衣制药公司，东京，日本）
1 mg / ml美托咪定（Domitor，Zenoaq，Fukushima，Japan）
氯化钠（Nakalai Tesque，京都，日本;目录号：31320-05）
氯化钾（Nakalai Tesque，目录号：28514-75）
磷酸氢二钠（Nakalai Tesque，目录号：31801-05）
磷酸二氢钾（Nakalai Tesque，目录号：28721-55）
盐水（大冢制药，日本东京）
磷酸盐缓冲盐水（请参阅食谱）

设备

研钵和杵（未指定）
烹饪秤（特法尔，萨尔塞勒斯，法国；目录号：BC2000J2）
冰柜

软件

Graph Pad Prism 5（Graph Pad Prism软件，加利福尼亚州圣地亚哥）

程序

时间轴

第0天
步骤A，麻醉准备：〜15分钟
BD步骤，MOG / CFA乳液的制备：〜60分钟
步骤E，准备PTx：〜10分钟
步骤F，MOG / CFA乳液和PTx的给药：约45分钟

第1天
步骤G，EAE监控：1〜2分钟/鼠标

第2天
步骤E，准备PTx：〜10分钟
管理PTx的步骤F9和F10：〜10分钟
步骤G，EAE监控：1〜2分钟/鼠标

第3-28天
步骤G，EAE监控：每只鼠标1-2分钟

三种不同麻醉剂鸡尾酒的制备
麻醉对于确保乳剂的皮下给药是重要的。
1. 准备在盐水中的三种不同麻醉剂（30μg/ ml美托咪定，400μg/ ml咪达唑仑和500μg/ ml丁烷醇）的混合物。混合后，该溶液可以在4°C的冰箱中保存至少8周。对于未免疫的对照小鼠，请使用与EAE相同的麻醉剂。
  1. 对于25毫升的溶液，在50毫升的试管中将2毫升的咪达唑仑与2.5毫升的丁烷酚合并。
  2. 加入0.75毫升美托咪定。
  3. 用盐水稀释至25毫升。
弗氏完全佐剂（CFA）的制备
CFA用于增加佐剂MOG 35-55的免疫原性。
1. 计算所需的 M量。结核 H37 Ra（MT）。每只小鼠所需的MT量为500μg。在准备和注射过程中会损失MT，因此准备的量要比所需量多1.5至2倍。
2. 计算所需量的1 mg / ml佐剂，完全H37 Ra（1 mg / ml CFA）。1 mg / ml CFA的所需量为每只小鼠100μl。在准备和注射过程中会损失CFA，因此准备量要比所需量多1.5至2倍。
3. 将所需量的MT放入研钵中，并用杵研磨以获得细粉（图1A）。
4. 将所需量的1 mg / ml CFA添加到研钵中（步骤B3；例如，将5 mg MT添加到1 ml 1 mg / ml CFA中）并混合，以获得6 mg / ml CFA / MT混合物的最终浓度（图1B）。此溶液应在通过乳剂免疫的当天制备，并可以在室温下保存，直到用于步骤D1。
  
  图1.弗氏完全佐剂（CFA）的制备。 A.用研钵和研棒将MT接地。B.用研钵和研棒混合MT和1 mg / ml CFA，使最终浓度为6 mg / ml CFA / MT。
MOG 35-55肽溶液的制备
MOG 35-55用作诱导脱髓鞘免疫反应的抗原。
1. 在盐水中稀释冻干的MOG 35-55，在2 ml试管中获得2 mg / ml储备液。该溶液（2 mg / ml MOG 35-55溶液）可以在溶解后于-20°C的冰箱中保存至少8周。避免反复冻融。
2. 免疫前，用盐水稀释MOG 35-55储备溶液，使最终浓度为1 mg / ml。该溶液（1 mg / ml MOG 35-55溶液）应在通过乳剂免疫的当天制备，并可以在4°C的冰箱中保存，直到用于步骤D4。
3. 对于未免疫的对照小鼠，使用生理盐水代替MOG 35-55溶液。
MOG乳液的制备
MOG 35-55 / CFA乳液可诱导淋巴结免疫反应。
1. 从研钵（步骤B4）中将6 mg / ml CFA / MT混合物吸入装有18 G针头的2.5 ml鲁尔锁注射器中（图2A）。对于未免疫的对照小鼠，使用与EAE相同的6 mg / ml CFA / MT混合物。
2. 取下18 G针并连接三通旋塞阀。从旋塞阀释放空气（图2B）。
3. 转动旋塞阀杆以关闭连接到CFA注射器的阀（图2C）。
4. 将1 mg / ml MOG 35-55溶液（步骤C2）吸入另一个带有18 G针头的2.5 ml鲁尔锁注射器中。对于未免疫的对照小鼠，请使用生理盐水代替MOG 35-55溶液。
5. 卸下18 G针并连接到三通旋塞阀。从旋塞阀释放空气（图2D）。此时，对于CFA溶液或MOG溶液，体积较大的液体称为“溶液A”，体积较小的液体称为“溶液B”。
6. 通过三通旋塞阀排放“溶液A”，使其体积与“溶液B”相同。安排6 mg / ml CFA / MT混合物：1 mg / ml MOG溶液至1：1后，转动旋塞阀杆以关闭未连接到注射器的阀（图2E）。
7. 将溶液在两个注射器之间来回传递约10分钟（图2F）。在这一步中，重要的是，首先要推入装有CFA的注射器。这将产生白色乳液。当注射器突然开始容易移动时，该过程完成。
8. 只需将一滴乳液滴入水中即可检查乳液。如果液滴散布在水表面，则表明混合物尚未准备就绪（图3A），因此重复步骤D7和D8，直到乳液完成。当液滴不扩散时就准备就绪（图3B）。该乳液应在免疫当天制备，并可以在4°C的冰箱中保存，直到在步骤F4中使用为止。
  
  图2. MOG乳液的制备。 A.从研钵中将6 mg / ml CFA / MT混合物吸入2.5 ml leur lock注射器中。B.将CFA注射器连接到三通旋塞阀，然后从旋塞阀释放空气。C.关闭连接到CFA注射器的阀。D.将MOG 35-55注射器连接到旋塞阀并释放空气。E.安排MOG 35-55：CFA = 1：1的量，并在没有注射器的情况下关闭阀门。F.将MOG 35-55和CFA混合，得到白色乳液。
  
  图3.检查乳液的状态。 A.未完成的乳液如上图所示铺开。B.完整的乳液不扩散。
百日咳毒素（PTx）的制备
PTx用于破坏血脑屏障，并使免疫细胞侵入CNS。
1. 在1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释一小瓶百日咳杆菌毒素（百日咳杆菌）冻干粉（50μg），以得到50μg/ ml PTx储备液。该溶液（50μg/ ml PTx储备溶液）可以在溶解后于4°C的冰箱中保存至少6个月。
2. 计算所需的PTx量。每只小鼠所需的PTx量为10μg/ kg。在准备和注射过程中会损失一些Ptx，因此准备的量要比所需量多1.1至1.5倍。
3. 将PTx储备溶液在PBS中按1:50稀释，在2 ml试管中的终浓度为1μg/ ml。该溶液（1μg/ ml Ptx）应在注射当天（第0天和第2天）制备，并可以在4°C的冰箱中保存，直到在步骤F7和F10中使用为止。对于未免疫的对照小鼠，请使用与EAE相同的PTx溶液。
4. 准备1毫升注射器和26 G针进行腹膜内注射。
动物免疫
该免疫步骤优选在光照阶段进行。麻醉，乳剂和PTx的给药日设为第0天，仅PTx的注射日设为第2天。
1. 确保可以通过对尾巴进行颜色标记来轻松识别所有小鼠，以便进行日常评估，例如 eg 。
2. 将每只老鼠放在烹饪秤上，并测量每只老鼠的体重。
3. 用三种不同麻醉剂的混合物进行麻醉。通过腹膜内（ip）注射（10 ml / kg）麻醉每只小鼠。使用装有26 G针的1 ml注射器。对于未免疫的对照小鼠，请使用与EAE相同的麻醉剂。给药后约10分钟将小鼠完全麻醉，麻醉持续约1小时（Kirihara et al。，2013）。
4. 重新混合在步骤D中制备的完整乳液，并将所有乳液转移到单个注射器中。
5. 卸下旋塞阀并连接26 G针（图4A）。
6. 在两个不同部位（上背部（颈部）（图4B）和下背部（右后肢的根部））（图4C）皮下注射（sc）100μlMOG 35-55 / CFA乳液。对照小鼠，使用步骤D中制得的对照乳剂，该乳剂仅不含MOG 35-55。
7. ip注射10 ml / kg PTx溶液（10μg/ kg PTx）。对于未免疫的对照小鼠，注射与EAE相同的PTx溶液。
8. 检查注射乳剂的小鼠的以下几点：小鼠是否已从麻醉中醒来，未死亡或乳剂从给药部位漏出。有任何问题的小鼠从实验中排除。
9. 按照第2步的步骤E，准备PTx解决方案。
10. 如步骤F7所述，在第二天免疫后测量体重并注射第二剂PTx。
  
  图4.动物免疫。 A.将26 G针头连接到乳液注射器。B和C。在颈部（B）和右后肢（C）的底部皮下注射乳液。
EAE监控
该监视步骤优选地在光阶段期间执行。在第0天（乳液当日
给药），从麻醉中恢复后评估小鼠。第2天（只有
PTx注射），给药后立即进行评估。
1. 每天称重每只小鼠（EAE和非免疫对照）。
2. 每天评估每只小鼠（EAE和未免疫对照）的临床体征，并按以下方式评分：
  1. 0：无临床缺陷。
  2. 1：部分尾巴麻痹（图5A，视频1）。
  3. 2：全尾巴麻痹（图5B，视频2）。
  4. 3：后肢部分麻痹（图5C，视频3）。
  5. 4：后肢完全瘫痪（图5D，视频4）。
  6. 5：前肢轻瘫（图5E，视频5）。
  7. 6：死了。
  临床评分评估的详细信息
  首先，将鼠标举到尾巴的中心时，如果尾巴的尖端垂下，则得分为1或更高；否则，得分为0。其次，当鼠标被尾巴的底部抬起时，如果所有的尾巴都垂下来而没有拉力，则得分为2或更高。接下来，将鼠标悬吊在只有前肢的笼子盖上时，如果可以抬起下半身抓住前盖和后肢的盖子，则得分为2，得分为3或2。如果没有更高。然后，将鼠标放在平坦的桌子上时，如果其后肢都朝下拖动，则得分为4分或更高；如果不是，则得分为3分。此后，抬起鼠标的下半身时，如果鼠标只能沿一个方向（左右方向）移动前肢，则得分为5；如果鼠标可以沿两个方向移动，则得分为4。请注意，未免疫的对照小鼠根本不会出现这种临床症状。
  
  图5. EAE小鼠的临床评分评估。每个临床评分的代表性小鼠图像。A.临床评分1：部分尾巴麻痹B.临床评分2：完全尾巴麻痹C.临床评分3：部分后肢麻痹D.临床评分4：完全后肢麻痹E.临床评分5：前肢麻痹。 br />
  
  视频1.临床得分为1的EAE小鼠
  
  视频2.临床评分为2的EAE鼠标
  
  视频3.临床评分为3的EAE鼠标
  
  视频4.临床得分为4的EAE鼠标
  
  视频5.临床评分为5的EAE鼠标
  
  这些视频是根据京都大学动物实验委员会的道德准则和日本药理学会的准则在京都大学制作的，并经京都大学动物实验委员会批准（协议编号：19-36）。

数据分析

通过使用GraphPad Prism（表格式：分组），将每日体重测量数据显示为XY图，其中Y为“体重”，X为“免疫后天数”（图6A）。
通过使用GraphPad Prism（表格式：分组），在XY图中显示每日临床评分评估数据，其中Y为“临床评分”，X为“免疫后天数”（图6B）。
使用Tukey的多重比较测试，使用双向方差分析分析数据。

图6. EAE的体重和临床症状的变化。在MOG免疫的C57BL / 6小鼠中EAE的发展。监测体重（A）和临床评分（B）28天。请注意，小鼠在EAE期间开始出现临床体征时开始体重减轻。n = 4，** P ＆lt; 0.01，*** P ＆lt; 0.001。

笔记

将MT磨成细粉的重要性（步骤B3）
此步骤很重要，因为与粗心操作相比，牢固执行此操作时EAE发生率更高。MT的细粉易于与CFA混合，因此应增加EAE的发生率。
使用三通旋塞阀获取乳液的原因（步骤D）
制备强乳液非常重要。因此，当我们使用三通旋塞阀时，我们可以通过注射器操作的打滑来判断乳液的完整性。
清除旋塞阀中空气的重要性（步骤D2和D5）
如果不除去空气，则给予一只小鼠的乳剂中MOG 35-55和CFA的含量可能会降低，从而导致实验之间存在差异。因此，应清除三通旋塞阀和注射器中的空气。
首先从CFA注射器开始的重要性（步骤D7）
在将它们混合制成乳液的步骤中，我们尝试了从CFA注射器推动和从MOG注射器推动。结果，我们发现前者在推动注射器混合时很容易推动，因此我们建议先推动CFA注射器。
必须将乳液注入两个不同的位置（步骤F6）
每次乳剂给药的位置都针对不同的淋巴结。上背部（颈部）是腋窝淋巴结，下背部（后肢的根部）是腹股沟淋巴结。我们认为，EAE发病率会通过在各种淋巴结中引起免疫反应而增加。当发生率低时，原因之一可能是给药位置可能距离淋巴结较远。
每日体重测量的重要性（步骤G1）
由于症状的恶化和体重减轻相关，因此认为记录体重和临床评分可以正确评估EAE。此外，体重减轻经常发生在EAE临床评分出现之前，这有助于避免忽视临床评分1。
日常临床评分评估的重要性（步骤G2）
EAE病理状况可以通过用临床评分确认每日变化的症状来评估。用药物给药或转基因小鼠进行的症状评估可阐明疾病状态并评估治疗效果。因此，每日评分很重要。抗原免疫后约10-14天，临床症状变得明显，然后在几天至一周内达到最高评分，并通常变得慢性。发生率为90-100％。
遗传背景的重要性
遗传背景非常重要，因为MOG 35-55 EAE模型不适用于SJL小鼠，而PLP 139-151 EAE模型不适用于C57BL / 6J小鼠。但是，NOD（非肥胖糖尿病）小鼠也可用于MOG EAE模型。有关详细信息，请参见Stromnes和Goverman的引用，2006。

菜谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1升超纯水
8克氯化钠（NaCl）
0.2克氯化钾（KCl）
1.15 g磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）
0.2克磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）

致谢

这项研究得到了MEXT / JSPS KAKENHI资助号17K19486和19K03377（HS资助）的支持。该程序改编自先前研究中描述的程序（Tsutsui et al。，2018）。

利益争夺

作者声明与此手稿无关的利益冲突。

伦理

所有实验均根据京都大学动物实验委员会的道德准则和日本药理学会的准则进行。该协议中动物实验的批准ID为14-42，有效期为2014年至2019年。

参考文献

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