图1.自动计数过程的演示。第一个宏通过自动设置TH阳性区域（A）的阈值来创建关注区域（ROI）。然后，第二个宏将ROI放置在相应的外围蛋白染色图像上，并在TH和外围蛋白染色共处的位置（B，C）创建遮罩。然后对这些蒙版进行计数，并显示一个列表，显示已分析的每个图像的计数。显示合并图像以说明共定位（D）。白色箭头表示可以通过眼睛识别的纤维，绿色箭头表示仅通过共定位识别的纤维。

材料和试剂

移液器吸头（Starlab，TipOne 1 ml，200 µl，10 µl，目录号：S1111-6001，S1111-0000，S1111-3000）
显微镜盖玻片（Engelbrecht，盖玻片24 mm x 60 mm，货号：K12460）
切片机刀片（羽毛，一次性切片机刀片，目录号：C-35）
样品模具（Sakura Finetek，Tissue-Tek Cryomold中间体15毫米x 15毫米x 5毫米，目录号：4566）
显微镜载玻片（VWR，粘合载玻片SuperFrost Plus 75毫米x 25毫米，目录号：631-0108）
PAP笔（Thermo Fisher，Super PAP笔，目录号008899）
锥形瓶（品牌，锥形瓶250毫升，目录号：92736）
C57B / 6J小鼠（Janvier Labs，C57B / 6JRj，目录号：C57B / 6JRj）
山羊血清（NGS）（Agilent Dako，山羊血清（普通），全血清，10毫升，目录号：X090710-8），储存在4°C
兔抗TH抗体（Merck，抗酪氨酸羟化酶抗体，目录号：AB152），储存在-20°C
鸡抗Peripherin抗体（Abcam，Anti-Peripherin抗体，目录号：ab39374），储存在-20°C
山羊抗兔抗体（Invitrogen，山羊抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 594 ，目录号：A-11037），在4°C下储存
山羊抗鸡抗体（Abcam，山羊抗鸡IgY H＆amp; L（Alexa Fluor ® 488），目录号：ab150169），储存在4°C
包埋介质（Sakura Finetek ，Tissue-Tek ® OCT TM 化合物，12 x 125 ml，目录号：4583），在室温下保存（RT）
Triton X（Sigma-Aldrich，Triton TM X-100 ，目录号：T8787），在RT处存储
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，多聚甲醛，试剂级，结晶，目录号：P6148），储存于4°C
盐酸（西格玛奥德里奇，盐酸36.5-38.0％，生物试剂，用于分子生物学，目录号：H1758），在室温下存放
氢氧化钠（Merck，氢氧化钠1.000 l，目录号：1099130001），存放在RT
Prolong Gold（Invitrogen，带有DAPI的ProLong TM Gold防褪色贴壁剂，目录号：P36931），存储在4°C下
磷酸盐缓冲盐水（Gibco，PBS（10x），pH 7.4 ，目录号：70011044），存放在RT
液氮（Linde，CRYOSPEED MED，目录号：4130919）
去离子H 2 O
3％PFA（250毫升）（请参阅食谱）
PBS 1x（请参阅食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
洗涤液（请参阅食谱）
二级抗体稀释液（请参见食谱）

设备

低温恒温器（Leica，CM3000 Research低温恒温器）
显微镜（蔡司，Axioskop 2 plus）
相机（Nikon，DSV Vi1）
PC（Intel Core i3-7100U CPU，2.40 GHz，8.00 GB RAM，Windows 10 Enterprise，64位，Intel HD Graphics 620）
磁力搅拌加热器（IKA，IKAMAG，目录号：RET）
-80°C冰箱（Thermo Scientific，Forma 906，目录号：906）
电子秤（Sartorius，电子精密秤，目录号：1465 MP8）
摇床（Peqlab，迷你摇床摇床，目录号：MR-1）
微量移液器（Eppendorf，Research加可变的0.1-1 ml，20-200μl，2-20μl，0.5-10μl，目录号：3123000063、312312055、3123000039、3123000020）

软件

ImageJ（NIH， https://imagej.nih.gov/ij/ ）
NIS-Elements（尼康， https://www.nikon.com/ ）

程序

组织隔离和冷冻固定
1. 从小鼠（ eg ，脾脏）中分离目标组织。
2. 在冷的PBS 1x（4-8°C）中清洗组织1-2分钟一次。
3. 将包埋介质的底漆放在冷模中。
4. 将分离的器官/组织放入冷冻模具中。
5. 用包埋介质完全覆盖组织。
6. 将具有包埋组织的冰冻液缓慢降低到液氮中。
7. 等到整个块冻结成固体。
8. 将包埋的组织保存在-80°C直至切片。
组织的冷冻切片
1. 为了获得最佳切片，不同组织需要在低温恒温器内使用不同的温度（取决于脂肪含量，组织密度等）； Leica低温恒温器手册中包含了不同组织的温度列表，网址为： https://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/leica- cm3050-s / ）。
2. 确保切片机刀片不钝（如果有明显的痕迹或损坏，或者切片不容易从刀片上脱落或在切片过程中被破坏，则可能需要更换刀片）。
3. 将具有嵌入组织的低温模具放在低温恒温器的冷室中至少30分钟，以使温度平衡。
4. 当包埋的组织达到“切片温度”时，使用包埋介质将其粘到样品架（低温恒温器的一部分）上。确保将组织块固定并均匀地粘在样品架上。
  注意：包埋介质可能会在冷样品架上快速固化。
5. 等待约10分钟，以使包埋介质完全固化。
6. 将低温恒温器设置为100 µm步进，并在3个切片将修整厚度减小到50 µm之后以100 µm开始修整。对3个部分执行每个修剪步骤，直到达到所需的部分厚度为止（在本例中为3-5 µm，因为这些部分越薄，图像越清晰，稍后显示。越厚的部分会使图像更加分散）。 br /> 注意：如果开始时只有很少的组织，则从较薄的部分开始修剪，或尝试立即切成所需的厚度。
7. 一旦生产出所需厚度的可复制切片，就可以通过将其粘附到显微镜载玻片上来开始收集它们。
8. 将显微镜玻片及其粘附的组织切片在室温（RT）下干燥至少5分钟。
固定部分
1. 使用PAP笔在切片周围画一个疏水性石蜡圈。
2. 让圆圈干燥约1-2分钟。
3. 在每个圆圈中添加约100-300 µl的3％PFA（配方1）（液体不应流过圆圈的边缘）。
4. 在室温下将组织切片固定15分钟。
5. 将PFA从玻片上摇匀，并在比色皿中用PBS 1x洗涤玻片10分钟。
免疫荧光染色
1. 通过向每个圆加入封闭溶液（配方3）封闭（以减少抗体的非特异性结合），并在4°C下孵育1小时。
2. 吸出玻片，并在封闭溶液中添加以1：200稀释的一抗（兔抗TH抗体和鸡抗Peripherin抗体）。在4°C下孵育过夜。
3. 在极低的RPM（20-30 RPM）下，在摇床上用洗涤溶液（配方4）洗涤10分钟。10分钟后，将玻片放入新鲜的洗涤缓冲液中。重复洗涤共三遍。
  注意：从这一点开始，请在黑暗中工作，以免荧光团漂白。
4. 加入在二级抗体稀释液（配方5）中以1：1000稀释的二级抗体（用Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔抗体和用Alexa Fluor 488标记的山羊抗鸡抗体）（配方5）并在室温下孵育2小时。
5. 在非常低的RPM（20-30 RPM）下，在摇床上用PBS 1x洗涤10分钟。10分钟后，将切片放入新鲜的洗涤缓冲液中。重复洗涤总共三遍。
6. 向每个圆圈添加100-300 µl的Prolong Gold，并用盖玻片盖住玻片。用纸巾擦去多余的安装介质。
7. 将载玻片在室温放置过夜，以使Prolong Gold固化。
8. 安装介质固化后，将载玻片保存在4°C直至图像采集。
图像采集
1. 以400倍放大倍率捕获TH，Peripherin和DAPI的单个图像（在本例中为40x Neofluotar Zeiss物镜，已为400倍放大倍率的图像编写了宏。如果使用了不同的放大倍率，则第二个宏的粒径必须为尚未对宏进行过来自更高级的显微镜设置（例如共焦系统）的图像的测试。较高的信噪比可能导致更精确的光纤计数，因为预期阈值将更为精确）。
2. 为TH，Peripherin和DAPI创建单独的文件夹。
3. 保存时对相应的图像进行相应编号（例如，TH1，Peripherin1，DAPI1； TH2，Peripherin2，DAPI2…）。
自动纤维计数
1. 要将计数宏添加到ImageJ（请参见图2）：
  1. 打开ImageJ并单击Plugins-＆gt; 新-＆gt; 宏
  2. 从补充文件中复制每个宏（可在补充文件< / a>，然后将文本添加到空白的新宏窗口中。
  3. 将每个宏保存在可以再次找到的位置，并将其命名为TH.txt或Peripherin.txt。
2. 将每个宏保存在可以再次找到的位置，并将其命名为TH.txt或Peripherin.txt。
图2.向ImageJ添加新宏的说明。为了从文本中安装新宏，请打开ImageJ，单击“插件”，然后在下拉菜单中单击“新建” 。然后选择宏。将打开一个新窗口。您现在可以将代码从补充文件复制到新窗口中。插入文本后，单击“文件”，“另存为”，然后以合适的名称（在本例中为TH.txt和Peripherin.txt）保存宏。不要忘记在文件名中添加“ .txt”，否则ImageJ将无法加载宏。
要运行宏，请点击插件-＆gt; 巨集-> 跑。选择TH宏并将其运行到TH文件夹，以为TH阳性区域创建感兴趣区域（ROI）（请参见图3）。

图3.运行第一个宏的说明。第一个宏用于在一个文件夹中的图像中创建TH正区域的ROI。要运行宏，请单击“插件”，“宏”和“运行”。从在步骤F1c中保存宏的位置加载宏。宏将询问您输入和输出文件夹。选择包含两个TH染色图像的文件夹。然后，宏将为所选文件夹中的每个图像创建一个ROI。宏使用ImageJ“自动阈值”的“大津暗”功能为每个图像自动设置阈值。然后根据阈值创建ROI。在ROI管理器中，单击“更多”和“保存”以将列表保存到可以轻松检索它的位置。如果您要立即继续使用第二个宏，则可以将ROI管理器保持打开状态。关闭由宏打开的“日志”窗口，“阈值颜色”窗口和所有图像（所选文件夹中的每个图像都将在桌面上打开）。
保存ROI列表。
点击插件-＆gt; 巨集-> 选择并运行包含外围蛋白图像的文件夹的Peripherin宏。这将扫描TH阳性ROI内的Peripherin阳性区域（参见图4）。

图4.运行第二个宏的指令。第二个宏用于计数TH阳性ROI中的外周蛋白阳性颗粒。在运行第二个宏之前，请确保具有相应ROI的ROI管理器已打开。然后通过单击“插件”，“宏”，“运行”并选择“ Peripherin”宏来运行宏。该宏将再次询问您输入和输出文件夹。这次选择包含您的外周蛋白染色图像的文件夹。宏使用ImageJ“自动阈值”的“默认暗度”功能为每个图像自动设置阈值。面具是基于阈值创建，这些面具是由的ImageJ“分析粒子”工具计数。仅对尺寸大于23像素的蒙版进行计数。如果使用较低的放大倍数，则需要在代码中减小尺寸。在“摘要”窗口中，宏将创建所选文件夹中所有图像的列表，显示每个图像中计数的粒子数量。列表中的所有项目均可通过按“ ctrl-A”进行标记，并通过单击鼠标左键并选择“复制”将其复制到数据处理软件中。复制列表后，完全关闭ImageJ。
将列出每个图像（图像1，图像2，图像3…）的颗粒计数。将列表复制到要用于统计分析的软件中。
使用您选择的软件分析数据。

与Bleck et al。（2019）的原始出版物中对纤维进行手动计数相比，该方法已得到验证。有关下颌下腺和心脏切片的图像及其相应计数的示例，请参见图5。

图5.下颌下腺和心脏切片图像的计数示例。 A显示了下颌下腺切片的染色和计数。下颌下腺被SNS纤维密集支配。相比之下，B显示了染色以及来自较少受神经支配的心脏部分的结果。

菜谱

3％PFA（250毫升）
在磁力搅拌加热器上的Erlenmayer烧瓶中将约200 ml去离子（DI）H 2 O预热至60°C。
1. 在50 ml反应管中称取7.5 g PFA
2. 加入约40ml预加热ħ<子> 2 O到PFA，混合以及
3. 将混合物添加到其余的H 2 O中并继续搅拌
4. 加入0.75毫升5 M氢氧化钠
5. 继续搅拌，直到溶液变澄清为止
6. 加入25毫升的10x PBS
7. 加入300 µl浓盐酸
8. 将pH调整至7（添加HCl或NaOH）
9. 用DI H 2 O最多填充250毫升
10. 在组织固定之前让溶液冷却
11. 将溶液在4°C下保存约一周，或准备等分试样以在-20°C冷冻，以备后用（解冻多次后请勿使用）
PBS 1x
将1体积的PBS 10x加入9体积的去离子H 2 O
阻塞解决方案
将2％NGS和0.3％Triton X添加至所需体积的PBS 1x
洗涤液
将0.3％的Triton X加入所需体积的PBS 1x
二抗稀释液
将2％的NGS加入所需体积的PBS 1x

致谢

该协议是为原始研究论文“确定目标组织中交感神经纤维密度的新型半自动化方法的介绍和验证”而建立的（Bleck et al。，2019）。

伦理

用于建立该协议的C57B / 6J小鼠在杜塞尔多夫大学（ZETT）的动物实验设施中进行了繁殖和处死，以进行器官提取。所有方法均按照ID O 57/15项目下批准的准则进行。

参考文献

Auer，RN（1994）。使用基于微机的数字图像分析技术自动进行神经纤维大小和髓鞘的测量：理论，方法和结果 J Neurosci方法 51（2）：229-238。
Bleck，D.，Ma，L.，Erdene-Bymbadoo，L.，Brinks，R.，Schneider，M.，Tian，L.和Pongratz，G.（2019）。介绍并验证一种确定目标组织中交感纤维密度的新的半自动化方法。 PLoS One 14（5）：e0217475。
Frykman，GK，Rutherford，HG和Neilsen，IR（1979）。在多台小型计算机系统中使用阵列处理器自动进行神经纤维计数。 J Med Syst 3（1-2）：81-94。
Hufton，SE，Jennings，IG和Cotton，RG（1995）。芳香族氨基酸羟化酶的结构和功能。 Biochem J 311（Pt 2）：353-366。
T. Nagatsu，M。Levitt和S.Udenfriend（1964）。酪氨酸羟化酶。去甲肾上腺素生物合成的第一步。 J Biol Chem 239：2910-2917。
波特（MM），德尼绍（B.）和格罗斯（F.）（1983）。 Peripherin，中间丝蛋白家族的新成员。 Dev Neurosci 6（6）：335-344。
斯特劳布，RH，劳奇，L。，法索尔德，A。，洛文，T。和庞加兹，G。（2008）。神经元释放的交感神经递质刺激II型胶原诱发的早期关节炎T细胞的脾脏干扰素-γ分泌风湿性关节炎 58（11）：3450-3460。