图1.溶酶体靶向RG检测的示意图。由于GFP和mCherry的荧光，表达PEX26 TM -RG蛋白的过氧化物酶体在细胞质或自噬体中将呈现黄色。。当靶向溶酶体时，GFP荧光将被淬灭，过氧化物酶体将显示为红色。

材料和试剂

Stericup快速释放Millipore Express PLUS 0.22μmPES 过滤器，500 ml（Millipore Sigma，目录号：S2GPU05RE）
T25烧瓶（Corning Life Sciences，目录号：C353109）
4孔Nunc TM Lab-Tek TM 密室盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：155383）
Lipofectamine 2000（Life Technologies，目录号：11668-019）
E-64（Enzo Life Sciences，目录号：BML-PI107-0001）
Leupeptin（Bioshop，目录号：LEU001）
HeLa人宫颈癌细胞系（ATCC CCL-2）
GFP-mCherry（RG）-PEX26 TM 质粒
Dulbecco的改良Eagle培养基（Hyclone，目录号：SH3008101）
L-谷氨酰胺（Hyclone，目录号：SH30034.01）
胎牛血清（生命科技，目录号：A12617）
OptiMEM降低血清培养基（Thermo Fisher，目录号：31985062）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％），酚红（Thermo Fisher，目录号：25300062）
CO 2 独立介质（Life Technologies，目录号：18045）
汉克的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher，目录号：14025092）

设备

蔡司LSM710配备63x 1.4 NA油浸物镜和适当的激光器（488 nm在可调氩气458/477/488/514 nm上，波长为30 mM，带493-565 nm带通滤光片，以及561 nm DPSS激光器，带600- 700 nm带通）
Forma Steri-Cycle CO 2 孵化器（Thermo Fisher）

软件

Volocity（Perkin Elmer，版本6.3）
蔡司禅（Zeiss，href="https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.hTMhttps://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.hTMl“target=”_blank>https://www.zeiss.com/microscopy /int/products/microscope-software/zen.html）
Microsoft ® Office Excel（Microsoft Office 365）

程序

基因克隆
GFP-mCherry-PEX26 TM 按照Deosaran等，2013年所述的几个步骤构建。首先，将pSPORT-PEX26（Invitrogen）的PEX26 ORF克隆到pmEGFP-C1的EcoRI和SalI位点，将PEX26的整个ORF插入GFP的C端。接下来，使用两个含有BglII位点的引物通过PCR去除了整个PEX26，但其C末端尾锚域（TM）。最后，将含有BglII或BamHI位点的引物用于PCR扩增的mCherry。用BglII和BamHI消化后，将PCR产物插入pmEGFP-PEX26 TM 载体上的BglII位点，以生成GFP-mCherry-PEX26 TM （RG-PEX26 TM ）向量。参见图2的示意图。

图2. RG-PEX26 TM 构建体的示意图。给出了使用的限制性内切酶。小箭头指示使用的引物的位置。
细胞接种
在这里，我们将描述在HeLa细胞上所做的工作，这些细胞在Dulbecco的改良Eagle Eagle培养基（DMEM）中生长，该培养基中添加了10％FBS和5％CO 2 。将培养基用FBS过滤除菌。但是，该协议可以适用于大多数可转染的细胞系。我们已经在许多可转染的细胞（例如MEF，Cos7，U2OS，Hek293和MDCK）中测试了该协议。
1. 要播种细胞，请先将无菌培养基和PBS加热至37°C。解冻胰蛋白酶并加热至室温。
2. 从培养箱中移出细胞并吸出生长培养基。用PBS（约5 ml）洗涤并吸出。将胰蛋白酶以适当的体积添加到烧瓶中，以确保细胞不会干燥（即，在T25烧瓶中加入1 ml胰蛋白酶）。
3. 将细胞在胰蛋白酶中于37°C孵育3-5分钟。
4. 一旦细胞不再粘附在烧瓶上，添加培养基以稀释胰蛋白酶并使之失活（约5 ml）。将含有细胞的培养基收集在15 ml试管中，并以1,000 x g 离心5分钟以沉淀细胞。
5. 离心后，吸出培养基并将细胞重悬于新鲜培养基中。
6. 使用血球计数器或其他细胞计数设备对细胞进行计数。
7. 在4孔Lab-Tek实验室（或等效的盖玻片系统中，可以进行活细胞成像）中的种子细胞，密度为25,000个细胞/孔。孔内的总体积应为0.5 ml。对于其他细胞类型或更长的过程，以合适的密度接种细胞以进行转染。
8. 在转染到37°C的培养箱中之前，让细胞粘附并静置24小时。
细胞转染
1. 在第2天，用RG-PEX26 TM 构建体（以及实验所需的任何其他构建体）转染。根据制造商的说明，每孔使用1-2μgDNA和Lipofectamine2000转染试剂。简而言之，在1.5 ml试管中将0.5μlLipofectamine2000与50μlOpti-mem培养基混合。静置5分钟。在另一个1.5 ml试管中，合并50μlOpti-mem培养基和DNA。合并lipofectamine和含DNA的混合物，静置20分钟。对每个转染的孔进行此操作。向每个孔中添加完整的混合物（100μl）。
2. 让细胞生长24-36小时。
3. 将介质更改为DMEM + FBS或不带FBS的HBSS。由于氨基酸饥饿，HBSS诱导了mTORC1相关性咽炎。两者都补充有2μME-64和0.5 mM亮肽素，以防止溶酶体内的蛋白质降解并允许检测mCherry信号。在37°C下孵育4-24小时。通过使用依赖CO 2 的培养箱在37°C下进行孵育。
图像采集
1. 为了进行成像，应在适当的条件下（ ie ，37°C和5％CO 2 ）对细胞进行成像。如果使用不带CO 2 的显微镜系统，则应使用补充有0.5 mM亮肽素和2μME-64的适当的独立于CO 2 的培养基替换培养基。
2. 在开始之前，请确保显微镜已开机并预热至37°C。
3. 对于每组实验，请校准设置，以使平均GFP和mCherry荧光强度（I G / R ）大致相等（ ie ，I GFP / I mCherry = 1）。校准将取决于所使用的显微镜，但是简而言之，应将激光，增益和速度设置为使背景接近零强度，同时荧光团的大多数信号都不会饱和。对于每个细胞，RFP的平均强度与GFP的平均强度之比应接近于对照细胞的1。确保GFP和mCherry信号大致相等，可以最佳地检测出人为感染后荧光强度比的变化。对于每个试验，所有条件都应在同一天成像。3D z切片或单个切片均可用于定量，但要确保在整个试验过程中保持成像方法的一致性。有关示例图像，请参见图3。
  
  图3.用RG构建体转染的HeLa细胞。对照细胞已在上述补充有E-64和亮肽素的DMEM中孵育。在成像之前，饥饿的细胞在HBSS中生长12小时，还补充了E-64和Leupeptin。两种细胞均表达GFP-mCherry-PEX26 TM 。对照细胞（顶部）显示出几乎相等的GFP和mCherry像素强度。氨基酸饥饿导致下咽病的细胞（下图）显示出增加的“仅红色”信号，表明过氧化物酶体已靶向溶酶体。注意，随着绿色荧光强度的降低，“仅红色”信号的增加更容易观察到。红色荧光强度不应改变。比例尺= 10μm

数据分析

注意：有关详细的电子表格，请参阅图3。

使用Volocity软件或其等效软件，首先通过在表达RG构建体的单个细胞周围绘制感兴趣区域（ROI）来确定细胞区域（图4A）。
接下来，仅使用mCherry信号识别过氧化物酶体（图4B，第1列）。在Volocity中，可以用几种不同的方式完成此操作，但是对于大多数在ROI中具有很高信噪比的图像而言，这是最简单的。具有类似算法的大多数其他成像分析软件可用于在Z堆栈图像中查找对象。测量每个点的GFP和mCherry信号的平均荧光强度以及每个点的体积，然后输入电子表格中（图4B，第2-4列）。
接下来，通过计算每个点的mCherry与GFP荧光的比例，确定溶酶体靶向的过氧化物酶体（“仅红色”的过氧化物酶体）的比例（图4B，第5列）。如果平均mCherry荧光信号比平均GFP荧光信号高至少3倍，则将点视作“仅红色”。在电子表格中，这表示为1（以溶酶体为靶标）或0（没有以溶酶体为靶标）的值（图4B，第6A列）。使用此信息，可以通过Excel有效地制表每个细胞的溶酶体靶向过氧化物酶体的体积（图4B，第6B列）。
添加每个细胞的所有溶酶体靶向过氧化物酶体的体积（图4B，第7列）。通过添加所有mCherry阳性点的体积来确定细胞中所有过氧化物酶体的面积（图4B，第8栏）。要确定每个细胞的溶酶体靶向过氧化物酶体的比例，请将溶酶体靶向过氧化物酶体的体积除以总过氧化物酶体体积（图4B，第9栏）。
对每个细胞重复此过程，每个试验至少定量50个细胞。计算每种测试条件下的溶酶体靶向点的平均比例，并绘制在图表上。
至少完成3次独立试验后，进行统计分析和图表绘制。有关示例图，请参阅图4C。

图4.样品细胞的ROI生成和计算电子表格。 A.图2中成像的细胞的ROI生成（左细胞在DMEM中孵育12小时，右细胞在HBSS中孵育12小时）。ROI用白色虚线表示。显示合并的图像。B.样本计算电子表格。显示了在A中成像的每个细胞中10个过氧化物酶体的定量。将细胞1在DMEM（对照）中温育，而将细胞2在HBSS（诱导咽炎）中温育12 h。请参阅协议以获取详细的列说明。注意，仅红色的过氧化物酶体（第6列）是那些平均红色荧光强度至少比平均绿色荧光强度大3倍的过氧化物酶体。C.B中的样本数据以图形方式表示。

笔记

此实验必须实时成像，因为固定可能会改变mCherry和GFP像素强度。
如果需要进行其他染色（例如，确定是否表达构建体），则可以在成像后固定细胞，正常染色并重新成像，以确定表达RG构建体的细胞中有多少比例也在表达您感兴趣的构建体。
在同一试验中，不得在图像或样本之间改变激光强度或增益。

致谢

资金来源：这项工作得到了加拿大卫生研究院的研究资助（PK Kim的PJT156196和GA McQuibban的MOP-130281）以及加拿大自然科学和工程研究委员会的发现资助（PK Kim和RGPIN的RGPIN-2015-04077）的支持。 -2015-05969（GA McQuibban）。该协议改编自我们之前的工作（Deosaran等，2013; Wang等，2015; Riccio等，2019 ）。

利益争夺

没有重大的竞争性财务，专业或个人利益会影响本手稿中所述作品的表现或表现。

参考文献

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