材料和试剂

30G针（BD Microlance，30G½”，0.3 x 13毫米，目录号：304000）
离心管（Tarsons，目录号：500010x）
纸巾（Scott SCOTTFOLD毛巾，31.4厘米x 19.9厘米，货号：01960）
汉密尔顿注射器（Hamilton Company，10 µl，目录号：MICROLITER TM ＃701）
染色盒（通过将两个塑料移液器彼此平行固定在矩形塑料盒的底部进行定制）
玻璃载玻片（Superfrost Plus显微镜载玻片）（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
pCS2 +质粒（大卫·特纳，密歇根大学，安阿伯分校）
3-氨基苯甲酸乙酯，甲烷磺酸盐，三卡因甲磺酸盐（Acros，目录号：118000500）
2x HBSS（从10x溶液中稀释，请参见食谱）
mMESSAGE mMACHINE SP6套件（Thermo Fisher，目录号：AM1340）
Lipofectamine messenger max试剂（Invitrogen，目录号：LMRNA001）
DABCO（1,4二氮杂双环[2.2.2]辛烷，Sigma-Aldrich，目录号：D27802）
Na 2 HPO 4 （磷酸氢二钠，Sigma-Aldrich，目录号：255793）
NaH 2 PO 4 （磷酸二氢钠，Sigma-Aldrich，目录号：33198）
KCl（氯化钾，Himedia，目录号：MB043）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
Tissue-Plus OCT复合物（Fisher Health care，目录号：4585）
BSA（牛血清白蛋白组分-V，Himedia，目录号：GRM105）
海卫一X-100（西格玛奥德里奇，目录号：T8787）
BrdU（5-Bromo-2'-deoxyuridine，Sigma-Aldrich，目录号：B5002）
PFA（多聚甲醛，Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
PVA（聚乙烯醇，Sigma-Aldrich，目录号：P8136）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
Tris Base（Trizma基座，Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
HCl（盐酸，Sigma-Aldrich，目录号：320331）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
Tris-HCl（1 M，pH 7.5，100毫升）（请参阅食谱）
曲卡因甲磺酸盐溶液（100毫升）（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲液（PB，1 M，pH 7.4，100毫升）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，10x，pH 7.4，1 L）（请参阅食谱）
HBSS（汉克斯平衡盐溶液，10倍，pH 7.14，100毫升）（请参阅食谱）
4％PFA（50毫升）（请参阅食谱）
DABCO（2.5％，50毫升）（请参阅食谱）
蔗糖溶液（50毫升）（请参阅食谱）

设备

镊子（McPherson缝合带直捆扎平台钳10cm（4“）5 mm尺寸，钳口长度，Surtex仪器，目录号：FR-780-10）
立体显微镜（带有LED照明的Carl Zeiss TM Stemi TM DV4系列立体显微镜）
电穿孔器（Electro Square Porator，BTX哈佛仪器，型号：ECM 830）
电极（白金镊子，5 mm直径，45-0204电缆，BTX，目录号：45-0489）
低温恒温器（Leica，型号：CM3050 S）
Rotospin旋转混合机（塔森）
摇水浴（Stuart，型号：SBS40）
离心机（渐新世，目录号：ScanSpeed 1736R）
尼康N i -E荧光显微镜和尼康A1共焦成像系统（Nikon A1-SHS，目录号：10225）

程序

视网膜损伤（Kaur等，2018; Mitra等，2018; Mitra等，2019; Sharma等等，2019）
1. 在鱼水中准备50毫升1x三卡因甲磺酸盐溶液。
2. 通过放入三卡因溶液来麻醉鱼，直到the的运动变慢。
3. 将麻醉的鱼放在湿纸巾床上，右侧朝上。
4. 将斑马鱼的眼睛聚焦在立体显微镜下，并用镊子轻轻倾斜眼球的背侧。
5. 用30 G针刺伤伤口，刺伤眼睛的腹侧，然后损伤眼睛的另一侧。
6. 通过从腹侧轻轻倾斜眼睛的背面来重复受伤，总共造成4次伤害。
7. 让鱼在系统水中恢复活力（有关详细信息，请参见视频1）。
  
  视频1.斑马鱼的视网膜损伤
体内 mRNA转染（Mitra等，2018； Sharma等，2019）
基因的体内过量表达是通过视网膜中的mRNA转染实现的。它涉及以下步骤（有关详细信息，请参见视频2）：

视频2.玻璃体内注射和吗啉代电穿孔
1. 转染试剂的制备
  1. 将GFP或目标基因克隆到pCS2 +质粒中。从3'末端线性化包含插入片段的向量。使用sp6消息机器体外转录试剂盒制备mRNA。沉淀mRNA并溶解在无核酸酶的水中，以使库存量为2,000 ng / µl。
  2. 如下准备转染混合物（8 µl）和lipofectamine 2,000转染试剂：
    1. 在室温下将2μlmRNA（2,000 ng /μl）和2x HBSS溶液混合。
    2. 将2 µl lipofectamine与等体积的2x HBSS溶液按1：1的比例混合，然后将溶液保持在室温下。
    3. 让两种溶液在室温下静置五分钟。
    4. 以1：1的比例逐滴混合溶液（i）和（ii），并将混合物在室温下放置30分钟。使用包含500 ng / µl mRNA的最终转染混合物进行玻璃体内注射。
  注意：该转染混合物用于在4-5只斑马鱼中进行玻璃体内注射，并且仅使用了单个浓度的mRNA。根据实验需要，可以按比例放大或缩小这些体积，而不会影响转染效率。
2. 玻璃体内注射体内过表达
  1. 用30 G的针头刺伤四个鱼，麻醉鱼并伤害右眼。
  2. 从第四次戳中，使用Hamilton注射器注入1 µl转染混合物。
  3. 将负电极放在右眼上，将正电极放在另一侧上，对鱼进行电穿孔。
  4. 在70 V电压下以五个脉冲电穿孔，持续时间为50毫秒，脉冲之间的间隔时间为950毫秒。
  5. 如E和F节所述，在受伤4天后收眼。
  6. 在基因过表达的视网膜中，与GFP转染的视网膜相比，检查BrdU阳性细胞的增殖情况（请参阅步骤E，F和G）。
  7. 通过对GFP进行免疫染色检查转染，随后进行成像，显示整个视网膜中的GFP。在此处附加了两个代表性图像，分别显示了在损伤部位和远离损伤部位的GFP表达（图1）。
    
    图1。显示GFP mRNA转染后斑马鱼视网膜中GFP的表达。星号标记了损伤点。ONL - 外核层; OPL - 外丛状层; INL - 内核层; IPL - 内丛状层; GCL - 神经节细胞层。
药物输送和吗啉代电穿孔（Kaur等，2018; Mitra等，2018; Mitra等，2019; Sharma et al。，2019）
为了研究药物，蛋白质和基因敲低方法的局部作用，进行了玻璃体内注射。
1. 注射液的制备：
  1. 将冻干的吗啉代（300 ng）溶于300 µl高压灭菌的Milli-Q水中，制成1 mM的储备液。使用纯净的1 mM溶液或用Milli-Q水稀释以使注射储备液为0.5或0.25 mM。
  2. 将蛋白质溶解在推荐的溶剂中制成储备液，然后在1x PBS或推荐的稀释剂中进一步稀释。
  3. 将药物溶于1 ml DMSO（二甲基亚砜）或推荐的溶剂中，以制成最终浓度的储备溶液，具体取决于药理抑制剂的分子量和重量。用Milli-Q水稀释，从主要原料中获得所需的工作浓度。
2. 注射溶液：
  1. 如上所述，由于刺伤而伤及一个视网膜。
  2. 从第四次戳中，用Hamilton注射器注入约1 µl试剂。
  3. 对于吗啉代递送，电穿孔吗啉代以使其进入视网膜。
  4. 将正极放在注射吗啉代的眼睛上，将负极放在另一只眼睛上。
  5. 在上述条件下进行电穿孔。
  6. 如下所述，在视网膜损伤（dpi）后4天收获眼睛。
BrdU标签
BrdU脉冲标记完成3 h，然后以4 dpi采集眼睛。它通过在复制的DNA中掺入胸苷类似物（BrdU）来标记活跃增殖的细胞。
1. 通过将15.35 mg BrdU粉末溶于10ml高压灭菌的Milli-Q水中，制成5 mM BrdU溶液。取1毫升等分试样，并保存在-20°C下供以后使用。
2. 在使用前将BrdU溶液带入室温，然后填充胰岛素注射器。
3. 麻醉鱼，并在显微镜下握住湿纸巾。
4. 将胰岛素针轻轻插入骨盆鳍之间的中间，并使针与鱼体平行，注意不要损坏内部器官。
5. 注入约一单位（15-20 µl）的BrdU溶液，并将鱼留在系统水中3 h。
收获和组织准备
1. 收眼（有关详细信息，请参见视频3）
  1. 通过过量服用三卡因使鱼安乐死（长时间浸泡在1x三卡因溶液中）。
  2. 用镊子轻轻地将眼睛从插槽中拉出。
  3. 将眼睛放在培养皿中的冷冻固定液中，并在立体显微镜下聚焦。
  4. 用镊子握住眼睛，并用针刺穿角膜。在镊子的帮助下，撕开角膜并轻轻推动眼睛，使晶状体脱出。
  视频3.斑马鱼安乐死和眼睛收获
2. 组织固定
  1. 在4％PFA中于4°C固定眼睛过夜，并在转子旋转时以12 rpm的速度连续旋转。
  2. 除去PFA，并在室温下连续旋转，以蔗糖梯度使组织脱水45分钟。添加蔗糖溶液，如下所示：
    5％蔗糖，1容量
    5％：20％蔗糖，2：1体积
    5％：20％蔗糖，1：1体积
    5％：20％蔗糖，1：2体积
    20％蔗糖，1容量
  3. 最后，用500 µl新鲜蔗糖溶液代替20％蔗糖，并向其中加入等体积的OCT。通过在室温下旋转混合30分钟。
  4. 通过包裹在肘上制成铝箔的立方体模具。
  5. 用OCT将模具填充至一半，在顶部放置标记的标记，并使眼睛与腹腔平行。
  6. 保持在-80°C，立即冻结眼睛。
冷冻切片和免疫染色
1. 冷冻切片
  1. 打开低温恒温器，并在室内将视线障碍物保持10分钟。
  2. 借助OCT将组织固定在样品盘上。
  3. 将样品盘固定在样品头上并贴上载玻片标签。
  4. 去除多余的OCT，直到视网膜组织开始出现。
  5. 在载玻片上截取8-10 µm的薄串行部分。
  6. 让载玻片在室温下干燥过夜。
2. 免疫染色
  1. 取一组幻灯片，将其水平放置在免疫染色架上。
  2. 用1x PBS洗涤3次，每次10分钟以去除OCT。
  3. 在室温下用PBST中的5％BSA（1x PBS和0.01％Triton X-100）封闭组织2-3小时。
  4. 除去封闭溶液，并在4°C下用一抗覆盖玻片过夜。
  5. 第二天收集一抗，并在室温下用PBST洗涤玻片3次，每次10分钟。
  6. 在室温下用荧光标记的二抗覆盖玻片2-3小时。
  7. 收集二抗并用PBST洗涤玻片三次。
  8. 用高压灭菌水停止反应。
  9. 让幻灯片在黑暗中垂直干燥10-15分钟。
  10. 用60 µl DABCO固定玻片并盖玻片。
  11. 让载玻片在暗室中于室温下干燥过夜。
图像采集
在荧光显微镜下检查载玻片，并用共焦成像系统和配备荧光光学镜的尼康N i -E荧光显微镜和尼康A1共焦成像系统拍摄图像。

数据分析

通过观察视网膜切片中的荧光，在荧光显微镜下计数BrdU标记的细胞。在实验组和治疗组中，都对主要损伤部位的细胞进行计数，并避免这些斑点远离主要损伤。损伤点可以通过不连续的外核层来划分，如下所示（图2）。在每个实验设置中，至少要取三只眼。计数存在于三个视网膜部分的所有主要损伤部位中的标记细胞。排除异常值（极低和极高的值），并通过分析Excel工作表中的数据来计算平均值和标准偏差。

图2.显示带有红色标记的BrdU阳性细胞的损伤点（用星号标出）。损伤点周围的正方形标记了细胞计数区域。比例尺- 10 μ 米; ONL - 外核层; INL - 内核层; GCL - 神经节细胞层。

菜谱

Tris-HCl（1 M，pH 7.5，100毫升）
1. 将12.1 g Tris碱溶于80 ml Milli-Q水中，制成1 M Tris-HCl储备液
2. 用浓盐酸溶液将pH调节至7.5，并用Milli-Q水将最终体积调节至100 ml
曲卡因甲烷磺酸盐溶液（100毫升）
1. 量取2 g 3-氨基苯甲酸乙酯，甲磺酸盐并将其溶解在100 ml 0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）溶液中（将10 ml 1 M溶液溶于90 ml碳酸氢钠中，将原液稀释至0.1 M）。 Milli-Q水）
2. 使用前将溶液保持在4°C并在鱼类系统水中稀释（1：100）
磷酸盐缓冲液（PB，1 M，pH 7.4，100毫升）
1. 称量以下成分：
  
  Na 2 HPO 4
  10.9877克
  
  NaH 2 PO 4
  2.711548 g
2. 首先，将Na 2 HPO 4 溶解在80 ml Milli-Q H 2 O中，然后添加NaH 2 PO 4
3. 用Milli-Q H 2 O调节pH到7.4并补足100 ml
4. 高压灭菌溶液并用高压灭菌的Milli-Q水稀释至0.1 M的工作量
磷酸盐缓冲盐水（PBS，10x，pH 7.4，1 L）
1. 测量以下组件：
  
  氯化钠
  75.97克
  
  Na 2 HPO 4
  9.937克
  
  NaH 2 PO 4
  3.59克
2. 通过剧烈摇动或用磁珠将所有成分溶于800毫升Milli-Q水中
3. 所有组分溶解后，将pH值调节至7.4，并补足最终体积至1,000 ml
4. 对该溶液进行高压灭菌，并将其用作用Milli-Q水稀释的1x溶液
HBSS（汉克斯平衡盐溶液，10倍，pH 7.14，100毫升）

氯化钠
8克

氯化钾
0.354克

葡萄糖
1.351克

HEPES
5.466克

Na 2 HPO 4
99.35毫克
1. 测量这些成分并溶于80毫升Milli-Q水中
2. 调节pH至7.14并补足最终体积至100 ml
3. 用10倍的储备液制备2倍的溶液，并以1毫升等分试样在-20°C下储存
4％PFA（50毫升）
1. 在50 ml干燥离心管中计量2 g PFA，然后向其中加入5 ml 1 M PB
2. 用高压灭菌的Milli-Q水将体积调至45 ml，并在摇动的水浴中于65°C加热以溶解PFA
3. 中间取下离心管，剧烈颠倒混合沉降的粉末。完全溶解大约需要15-30分钟
4. 适当溶解后，用高压灭菌的Milli-Q水将体积调节至50 ml，并立即置于冰上。要长期保存，请分装少量样品并保存在-20°C下
DABCO（2.5％，50毫升）
1. 在50 ml离心管中量取12 g甘油
2. 量取4.8克PVA，并将其添加到甘油中。轻轻颠倒试管至均匀溶液，充分混合
3. 加入12 ml高压灭菌的Milli-Q水，并在转子上混合过夜。然后在室温下旋转
4. 加入24 ml 0.2 M Tris-HCl，pH 8-8.5
  1. 将12.1 g Tris碱溶于80 ml Milli-Q水中，制成100 ml 1 M Tris-HCl溶液
  2. 用浓盐酸溶液将pH值调节至8.2，并补足最终体积至100 ml
  3. 要制成0.2 M Tris-HCl，请在24 ml Milli-Q水中取6 ml 1 M储备液
5. 将溶液在摇床水浴中加热至50°C，持续15-30分钟，然后以5,000 x g 离心15分钟
6. 小心地除去上清液，并向上清液中加入1.25 g DABCO
7. 以5,000 x g 离心15分钟
8. 将上清液分装在1 ml试管中，并将其储存在-20°C下以备后用
蔗糖溶液（50毫升）
1. 5％蔗糖：量取2.5克蔗糖并将其溶解在40毫升0.1 M PB溶液中。用0.1 M PB将体积调节至50 ml
2. 20％蔗糖：量取10克蔗糖并将其溶解在40毫升0.1 M PB溶液中。旋转溶解后，用0.1 M PB将体积调节至50 ml
3. 将溶液储存在4°C以便长期使用

致谢

PS感谢Wellcome Trust / DBT印度联盟和IISER Mohali提供的博士后研究金。PS感谢本科生Ajay Kumar进行视频捕获和编辑。这项工作得到了Rajesh Ramachandran授予的Wellcome Trust / DBT印度联盟中级研究金（IA / I / 12/2/500630）的支持。RR还感谢印度DST（EMR / 2017/001816），DBT印度（BT / PR9407 / BRB / 10/12612013），（BT / PR17912 / MED / 31/336）科学教育和研究委员会（SERB）的研究资金/ 2016）和IISER Mohali的支持。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献

Kaur，S.，Gupta，S.，Chaudhary，M.，Khursheed，MA，Mitra，S.，Kurup，AJ和Ramachandran，R.（2018）。 let-7 microRNA介导的shh信号调节和基因调节网络对于视网膜再生至关重要。 Cell Rep 23（5）：1409-1423。
Mitra，S.，Sharma，P.，Kaur，S.，Khursheed，MA，Gupta，S.，Ahuja，R.，Kurup，AJ，Chaudhary，M.，and Ramachandran，R.（2018）。 Histone脱皮酶重新编程的希拉里娜（Merler glia）inlin重新编程介导的Minler glylia iScience 7：68-84。
Mitra，S.，Sharma，P.，Kaur，S.，Khursheed，MA，Gupta，S.，Chaudhary，M.，Kurup，AJ和Ramachandran，R.（2019）。在斑马鱼视网膜再生过程中，Myc必须对lin28a进行双重调节。 J Cell Biol 218：489-507。
Sharma，P.，Gupta，S.，Chaudhary，M.，Mitra，S.，Chawla，B.，Khursheed，MA和Ramachandran，R.（2019）。 Oct4介导斑马鱼视网膜再生过程中的Muller胶质细胞重编程和细胞周期退出。生命科学联盟 2（5）：pii：e201900548。