材料和试剂

50 ml离心FALCON型试管
1.5毫升微管
Cuvettes
玻璃珠（Retsch，目录号：22.222.0004）
抗组蛋白H3（Abcam，货号：ab1791）
抗Pgk1（Invitrogen，目录号：459250）
抗兔IgG（Sigma-Aldrich，目录号：A0545）
Ani-Mouse IgG（伯乐，目录号：170-6516）
细胞培养基：
蛋白ept（FORMEDIUM，目录号：PEPCFG）
葡萄糖（FORMEDIUM，目录号：GLUCFG）
半乳糖（FORMEDIUM，目录号：GALCFG）
酵母提取物（FORMEDIUM，目录号：YEACFG）
酵母氮碱（CONDA，货号：1553）
硫酸铵（PanReac AppliChem，目录号：141140）
尿嘧啶（西格玛奥德里奇，目录号：U-1128）
L-蛋氨酸（FORMEDIUM，目录号：DOC0168）
L-色氨酸（（FORMEDIUM，目录号：DOC0187）
硫酸腺嘌呤（FORMEDIUM，目录号：DOC0229）
L-亮氨酸（SIGMA ALDRICH，目录号：L8912）
L-赖氨酸一水合物（FORMEDIUM，目录号：DOC0159）
L-组氨酸（FORMEDIUM，目录号：DOC0144）
MilliQ H 2 O
HEPES（iNtRON BIOTECHNOLOGY，目录号：1017365）
KCl（PanReac AppliChem，目录号：131494）
NaCl（PanReac AppliChem目录编号：121659）
MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
CaCl 2 （PanReac AppliChem目录号：131232）
Triton X-100（PanReac AppliChem，目录号：142314）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S3256）
EDTA（PanReac AppliChem，目录号：131669）
甘油（PanReac AppliChem，目录号：141339）
IGEPAL CA-630（NP-40）（西格玛奥德里奇，目录号：I8896）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U-6504）
DTT（FORMEDIUM，目录号：DTTCFG）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
Tris（PanReac AppliChem，目录号：141940）
SDS（BioPure，目录号：8030S）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
Β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
正丁酸（Sigma-Aldrich，目录号：B103500）
缓冲区1和缓冲区2（请参阅配方）
样品缓冲液（请参见配方）
细胞培养基（请参阅食谱）
1. 酵母完全培养基YPD
2. 合成滤料（SD）

设备

1. 500毫升锥形玻璃烧瓶
冷藏离心机（用于50毫升试管：海蒂诗，型号：Universal 32R；用于1.5毫升试管：Beckman Coulter，型号：Allegra 21R）
分光光度计：Ultrospec 10细胞密度计（Amersham Biosciences）
Vortex（带有TurboMix附件的Genie 2，多样本设备）
酵母培养用轨道振荡器/培养箱：Multitron Standard（Infors AG）

程序

酿酒酵母标准培养条件
1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以在酵母完全培养基（YPD）（配方3a）或补充有菌株特异性要求的合成辍学培养基（SD）（配方3b）中生长。
2. 用 S接种150 ml培养基（500 ml容器）。5 ml预培养物中的啤酒酵母细胞呈指数生长，并在30°C（或所需温度）下孵育。培养物必须在定轨振荡器上以180-200 rpm的速度振荡。
3. 让培养物生长直至达到OD 600 〜0.7-0.8。
4. 将培养物转移至50 ml离心管（x3）中，并通过离心（在4°C下2,500 x g 2分钟）收获。丢弃上清液。
5. 在此步骤中，可将颗粒保存在-80°C或用于继续操作。
染色质纯化方案
1. 所有后续步骤均在4°C下执行。
2. 用5 ml无菌MilliQ H 2 O洗涤细胞，离心（2,500 xg 2分钟），然后将沉淀重悬于1 ml MilliQ H 2 O。
3. 转移到1.5 ml微管中，并在4°C下以2500 x g 的速度离心1分钟。丢弃上清液。
4. 将沉淀重悬于200 µl缓冲液1（表1中的配方1）中，然后加入200 µl玻璃珠（大小：425-600 µm）。
5. 通过在4°C下使用带有TurboMix附件的Genie 2涡旋（多样品设备），以最大速度连续剧烈涡旋4分钟来裂解细胞。
6. 以500 x g 离心5分钟，以旋转玻璃珠和完整细胞。将上清液转移至新的1.5 ml微管中。小心不要从沉淀物中取出任何东西，以在后续步骤中有效减少细胞质污染。
7. 将上清液在500 x g 下离心5分钟，以丢弃残留的完整细胞。将上清液转移至新的1.5 ml微管中。在此步骤中沉淀物的污染导致最终纯化染色质级分中的细胞质污染。
8. 保留5-10 µl上清液作为输入对照。
9. 高速离心剩余的上清液（20,000 x g ）20分钟。
10. 用移液管弃去上清液，然后将可见的沉淀（P1）重悬于200 µl缓冲液1中（表1）。
11. 高速离心（20,000 x g ）20分钟。
12. 丢弃上清液，然后将可见的沉淀（P2）重悬于200 µl缓冲液2中（配方1表2）。
13. 高速离心（20,000 x g ）20分钟。
14. 丢弃上清液。可见的最终沉淀（P3）构成了富含染色质的部分。
15. 对于SDS-PAGE和Western印迹，将P3重悬于20 µl 1x Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液（配方2）中，并于100°C孵育10分钟。煮沸后，以30,000 x g 旋转1分钟。使用上清液进行凝胶电泳。
16. 对于质谱分析，在室温下，将富含染色质的级分（P3）轻轻重悬于20 µl Tris-HCl 50 mM，pH 7.5中。可以将其冷冻在-20或-80°C进行进一步分析。
放大条件
1. 为了扩大方案，使用600 ml的 S。必须使用OD 600 〜0.7-0.8的啤酒酵母培养物，并且完整的实验方案必须在4°C下进行。
2. 将培养物收集到三个离心管中，并在2500 x g 下离心2分钟。在这些条件下，每个试管中都包含一个相当于200 ml培养细胞的细胞沉淀。
3. 用5 ml无菌MilliQ H 2 O洗涤每个细胞的沉淀，以2,500 xg 离心2分钟，然后将每个沉淀重悬于1 ml MilliQ H 2 O。
4. 转移到1.5 ml微量管中，并在2500 x g 下离心1分钟。丢弃上清液。
5. 将每个沉淀重悬于200 µl缓冲液1（表1）中，然后加入200 µl玻璃珠（425-600 µm）。
6. 通过剧烈连续涡旋振荡4分钟来裂解细胞（带有TurboMix附件的Genie 2，这是一个多样品设备，以最大速度）。
7. 以500 x g 离心5分钟，以旋转玻璃珠和完整细胞。将对应于相同细胞培养物的三个上清液转移至新的单个1.5 ml微管中。
8. 后续步骤类似于标准协议。在标准协议的步骤B10和B12中，将缓冲液放大至600 µl。
9. 对于SDS-PAGE和Western印迹，将P3重悬于60 µl 1x Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液中（配方2；表3），并在100°C下温育10分钟。煮沸后，以30,000 x g 旋转1分钟。使用上清液进行凝胶电泳。
10. 对于质谱分析，在室温下，将富含染色质的级分（P3）轻轻重悬于20 µl（或要求的）Tris-HCl 50 mM，pH 7.5中。可以将其冷冻在-20或-80°C进行进一步分析。
缩小条件
1. 为了缩小协议规模，请添加50 ml的 S。使用的是OD 600 〜0.7-0.8的啤酒酵母培养物，所有操作步骤必须在4°C下进行。
2. 当按比例缩小方案时，用于标准程序的溶液量（200μl）得以维持，以轻松处理样品。
3. 对于SDS-PAGE和Western印迹，将P3重悬于20 µl 1x Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液中（配方2；表3），并在100°C下温育10分钟。煮沸后，以30,000 x g 旋转1分钟。使用上清液进行凝胶电泳。

数据分析

yChEFs过程中不同部分的蛋白质分析如图1所示。

图1. yChEFs方法不同部分的蛋白质分析。组蛋白H3和Pgk1作为对照，通过蛋白质印迹法进行了分析（抗兔IgG作为抗H3一抗的二抗，抗小鼠IgG作为抗Pgk1一抗的二抗）。请注意，由于未检测到细胞质Pgk1蛋白，因此染色质已正确分离。WCE：全细胞（裂解液）。P1-P3：丸1-3。S1-S3：上清液1-3。除整个P3馏分外，每个馏分的1/10体积上样。

菜谱

缓冲区1和缓冲区2（表1和2）

表1.缓冲液1的组成和制备

* FC：最终浓度

表2.缓冲液2的组成和制备

* FC：最终浓度
样本缓冲区（表3）

表3.样品缓冲液的组成和制备

* FC：最终浓度
细胞培养基
1. 酵母完全培养基（YPD）
  2％（w / v）蛋白ept
  2％（w / v）葡萄糖（或半乳糖）
  1％（w / v）酵母提取物
2. 合成滤料（SD）
  0.17％（w / v）酵母氮碱
  0.5％（w / v）硫酸铵
  2％（w / v）葡萄糖（或半乳糖）
  补充要求：
  L-组氨酸20 mg / L
  L-赖氨酸一水合物30 mg / L
  L-亮氨酸150 mg / L
  L-蛋氨酸20 mg / L
  L-色氨酸20 mg / L
  硫酸腺嘌呤50 mg / L
  尿嘧啶20 mg / L

致谢

我们先前的报告（Cuevas-Bermúdez et al。，2019）中对此协议进行了描述。这项工作得到了西班牙经济与竞争力部，MINECO和FEDER基金（FN的BFU2016-77728-C3-2-P）和安达卢西亚自治区（FN的BIO258）的资助。AC-B。是MINECO的FPI博士前合同的获得者。AIG-G是MEC的获得者和哈恩大学的博士后研究金。FG-S是哈恩大学博士前研究金的获得者。

参考文献

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