材料和试剂

烧杯（500 ml，1 L）
50 ml锥形管
21 G针
T175烧瓶（Corning，目录号：CLS431080）
10厘米培养皿（Corning，目录号：430167）
6孔皿（Corning，目录号：CLS3516）
FACS管（猎鹰，目录号：352235）
Reprosil-Pur C18-AQ，1.9μm树脂（Dr.Maisch GmbH）
25厘米熔融石英发射器，内径为75μm（DNU-MS GbR）
台式清洁剂（terralin ® PAA，目录号：126203，在室温下存储）
1.5 ml安全密封的无热原管（Sarstedt，目录号：72.706.201）
0.45μm过滤器（Sartorius，目录号：10109180）
pH试纸0.0-6.0; 6.0-10.0（MN，部件号：1138922； 1178895）
PVDF膜（GE Healthcare Amersham TM Hybond TM -P膜，目录号：10471085，在室温下存储）
Phage-ubc-nls-2xmcp-egfp-BirA *（Addgene质粒，目录号：131132）或phage-ubc-nls-2xmcp-egfp-cMyc BirA *（Addgene质粒，目录号：131133）或phage-ubc-nls -2xmcp-mCherry-BirA *（Addgene Plasmid，目录号：131136）
pCEP4-tat（Addgene Plasmid，目录号：22502）
pRSV-Rev（Addgene Plasmid，目录号：12253）
pMDLg / pRRE（Addgene Plasmid，目录号：12251）
pMD2.G（Addgene Plasmid，目录号：12259）
Hek293 FT细胞（Thermo Scientific，目录号：R70007）
野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF， eg ，Park 等人，，2014）
琼脂糖磁链霉抗生物素蛋白磁珠（GE，货号：28985799，储存于4°C）
MBS MEF（在β-actin基因位点的3'-UTR中插入有24个MS2结合位点（MBS）的MEF；请参见Park et al。，2014年）
Fugene 6（Promega，货号：E2691，在4°C下存储）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4049，储存在-20°C）
胎牛血清（FBS; Sigma-Aldrich，目录号：F4135，储存在-20°C）
碱性磷酸酶偶联的抗生蛋白链菌素
胰蛋白酶，测序级，修饰，0.5μg/μl（Promega，目录号：V5113）
LentiX浓缩器（宝酒，商品目录号：631231，在4°C下储存）
赖氨酰内肽酶Lys-C（Waco，目录号：129-02541），储备液：H 2 O中的浓度为0.5μg/μl
OptiMEM（Thermo Scientific，目录号：31985062，在4°C下存储）
DMEM高葡萄糖培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D6429，储存在4°C）
1x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D6429，储存在4°C）
青霉素-链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4333，储存在-20°C）
漂白粉（Schülkeperform ®消毒剂，目录号：107912，在室温下保存）
手部消毒剂（STERILLIUM Virugard溶液，目录号：126064，在室温下存储）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501，储存在4°C）
完全的蛋白酶抑制剂，不含EDTA（Roche，目录号：11697498001，在4°C下储存）
5x Roti Quant Bradford试剂（Roth，目录号：K015.3，在4°C下储存）
SDS（十二烷基硫酸钠）（Roth，目录号：CN30.1，在室温下保存）
溴酚蓝（Roth，目录号：A512.1，在室温下保存）
甘油（西格玛奥德里奇，目录号：G6279，在室温下保存）
Nu-PAGE SDS-PAGE凝胶4-12％（Invitrogen，目录号：WG1402BOX，储存在4°C）
NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（20x）（Invitrogen，目录号：NP0001，储存在4°C）
β-巯基乙醇（Roth，目录号：42273，在室温下存储）
对硝基四氮唑蓝藻酸酯（NBT）（Roth，目录号：4421.2，储存在-20°C）
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐（BCIP）（Roth，目录号：A155.2，储存在-20°C）
碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，目录号：09830，在室温下存储）
NuPage SDS-PAGE凝胶（Thermo Scientific，目录号：NP0315BOX，在4°C下储存）
PHOENIX肽纯化试剂盒（PreOmics，目录号：PO00023）
二硫苏糖醇（VWR，目录号：0281-5G，室温保存）
尿素（Merck，货号：1.08488.1000，在室温下存放）
硫脲（Merck，目录号：1.07979.0250，在室温下存储）
碘乙酰胺（Merck，货号：8.04744.0025，在室温下保存）
乙腈（默克，目录号：1.00030.2500）
甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：33015-500ML）
乙酸（Roth，目录号：3738.5）
三氟乙酸（TFA）（Merck，目录号：1.08262.0100）
氯化钠
氯化镁 2
三氯乙烯
TBS
补间20
脱氧胆酸盐
HEPES
EDTA
氯化锂
完整介质（500毫升）（请参阅食谱）
无血清培养基（100 ml）（请参阅食谱）
生物素培养基（100毫升）（请参阅食谱）
50 mM生物素溶液（请参阅食谱）
BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯）（请参阅食谱）
NBT（硝基蓝四氮唑）（请参阅食谱）
AP（碱性磷酸酶）底物缓冲液（请参见食谱）
1个TBS（Tris缓冲盐水）（请参阅食谱）
1x TBST（Tris缓冲盐水-吐温）（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液1（请参阅食谱）
洗涤缓冲液2（请参阅食谱）
洗涤缓冲液3（请参阅食谱）
洗涤缓冲液4（请参阅食谱）
20 mM ABC（碳酸氢铵）缓冲液（请参阅食谱）
2x SDS（十二烷基硫酸钠）样品缓冲液（请参阅食谱）
变性缓冲液（请参见配方）
还原缓冲区（请参见食谱）
烷基化缓冲液（请参见配方）
溶剂A *（请参阅配方）
溶剂A（请参阅配方）
HPLC溶剂A（请参见配方）
HPLC溶剂B（请参见配方）

设备

37°C水浴（Fisher Scientific，Isotemp 205水浴）
细胞培养培养箱，设置为5％CO 2 （Thermo Scientific，Heracell TM 150i CO 2 培养箱）
离心机（Eppendorf，型号：5430）
细胞分选仪（BD，型号：FACS Aria I）
端到端旋转器（Heidolph，型号：REAX 2）
Thermomixer（Eppendorf，目录号：5350 000.013）
磁力架（Bio-Rad，目录号：1614916）
离心机（Heraeus Fresco 17，Thermo Fisher Scientific，目录号：75002420）
Western blot SDS-PAGE电泳仪（Bio-Rad，Mini Trans-Blot ® Cell）
Western blot SDS-PAGE湿式转移仪（Bio-Rad，小型Trans-Blot模块，目录号：1703935）
浓缩器加真空离心机（Eppendorf，货号：5305 000.304）
EASY-nLC 1200（Thermo Fisher Scientific）或与所选MS系统兼容的任何（U）HPLC系统
LTQ Orbitrap或Q Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）或任何最新的高分辨率质谱仪。
荧光显微镜（Zeiss CellObserver，40x，1.4 NA油浸物镜，GFP滤光片组38HE）

软件

MaxQuant软件套件（ www.maxquant.org ，Max-Planck-Institute of Biochemistry，Martinsried）或其他程序可用于下游分析
英仙座（ http://www.coxdocs.org/doku.php?id = perseus：common：download_and_installation ，马克斯-普朗克生物化学研究所，Martinsried）

程序

图1显示了演示实验程序总体轮廓的流程图。

图1. RNA-BioID过程流程图

生成表达MCP-GFP-BirA *融合蛋白的稳定细胞系
1. 在UBC启动子控制下的MCP-GFP-BirA *基因融合被整合到第三代慢病毒载体中，可通过Addgene（Addgene 131132/131133/131136）获得三种不同版本。可以以类似方式使用三种不同版本。
2. 为了进行转导，将MCP-GFP-BirA *质粒Gag / Pol与Env和VSV-G质粒结合使用，以在Hek293FT细胞中组装并产生完整的病毒颗粒。
3. 转染前一天，在10 cm皿中的完全生长培养基中播种4 x 10 6 Hek293FT细胞。
4. 转染当天，建立两个1.5 ml离心管，每个离心管包含500μlOptiMEM培养基。
5. 在一个试管中，加入相应量的以下质粒：
  <身体>
  
  MCP-GFP-BirA *骨架质粒：
  20 µg
  
  pCEP4-tat
  1微克
  
  pRSV-Rev
  1微克
  
  pMDLg / pRRE
  1微克
  
  pMD2.G（插入名称VSV-G）
  2微克
  
  总计
  25μg质粒DNA
6. 向另一个装有OptiMEM的离心管中加入75 µl Fugene HD转染试剂（每µg质粒3 µl）。
7. 将两个试管分别在室温下孵育5分钟。
8. 将含有质粒DNA的OptiMEM培养基添加到装有OptiMEM-Fugene HD混合物的试管中，通过移液2-3次进行短暂混合，并在室温下孵育至少25 分钟（最多45分钟）。这导致DNA-Fugene复合物的形成。
9. 用新鲜的10 ml完全生长培养基交换含有Hek293FT细胞的10 cm皿的培养基。
10. 逐滴将DNA-Fugene复合物添加到细胞顶部。轻轻旋转培养皿，将Fugene-DNA混合物与培养基混合，然后在37°C下孵育培养皿至少16 h。
  注释：
  1. 出于生物安全的原因，请将培养皿放在培养箱内的托盘上，以免由于处理错误而将培养基洒落到培养箱中。
  2. 在此阶段，正在生产慢病毒，因此必须严格遵守II级生物安全法规。孵育16小时后，所有已经和将要与含病毒溶液接触的培养皿和移液器在处理前都必须用漂白剂进行处理。始终穿实验室外套，并用乙醇擦拭整个引擎盖。当您离开工作空间时，也请用漂白剂处理手套。
11. 在孵育16小时之前，请准备500毫升10％的漂白剂，并将其保存在组织培养罩中的大烧杯中以处理表面（每天准备新鲜的19％漂白剂，仅可保持24小时有效）。
12. 一旦在引擎盖下准备好漂白液，请小心地从10厘米的培养皿中取出8毫升介质，并将其转移到50毫升锥形管中。保持在4°C过夜。
13. 向培养皿中加入8 ml新鲜的完全生长培养基，然后再将其返回到培养箱中24小时。
14. 此时，将种子野生型（WT）MEF和MBS MEF（3 x 10 6 / 10 cm皿）并在细胞培养箱（5％CO 2 ）。
15. 在连续的几天中，重复步骤A11-A13两次。每天收集培养基，并将其收集在与步骤A12相同的50 ml锥形管中，保持在4°C。收集所有上清液后，将锥形管在500 x g 和4°C下旋转10分钟以沉淀大碎片。
16. 通过0.45μm过滤器过滤离心分离后的上清液。
17. 根据制造商的说明，使用LentiX浓缩器浓缩上清液中的慢病毒颗粒。
18. 浓缩病毒颗粒后，加入1 ml无血清培养基（配方2）并小心地重悬沉淀。
19. 从培养箱中取出带有WT MEF和MBS-MEF的培养皿进行转导，用新鲜的完全培养基（配方1）替换旧培养基，并每10 cm培养皿中加入100μl病毒颗粒溶液和10 ml培养基。将其余的病毒颗粒储存在-80°C下。将MEFs放回细胞培养箱中，放置24小时。
20. 在荧光显微镜（GFP的滤光片设置）下检查病毒转导效率。如果看不到GFP荧光，则用另一等份存储的病毒颗粒重复步骤A19。
21. 荧光细胞应稳定表达MCP-GFP-BirA *融合蛋白。
22. 在收集的最后一天，漂白所有与病毒颗粒接触的餐具。
分离表达功能性MCP-GFP-BirA *融合蛋白的细胞
1. 生成稳定细胞系后（WT-BirA *：表达MCP -GFP-BirA *的WT MEF ； MBS-BirA *：在β-肌动蛋白的3'-UTR中具有24x MBS并表达MCP-GFP-BirA *的MEF），在含有1 ml完全生长培养基的FACS（荧光激活细胞分选）管中，通过对GFP进行荧光激活的细胞分选来分选阳性表达GFP的细胞。这可以通过您机构的核心机构来完成。
2. 排序后，在室温下以500 x g 旋转细胞5分钟。重悬，并根据在细胞分选中鉴定出的阳性细胞数量，在10 cm或更大的培养皿（10,000个细胞/每个10 cm的培养皿）中培养它们。
3. 分离出至少10,000个细胞后，测试两种转导细胞类型（WT-BirA * / MBS-BirA *）中的GFP表达水平。为了检查GFP的表达，在裂解缓冲液中准备细胞裂解液（配方10）。加入3个细胞体积的裂解缓冲液（PCV），并通过21 G针头经过10-12次。将裂解物在4°C下于12,000 x g 离心10分钟以去除细胞碎片。取出可溶性部分，并在4°C下保存在新的1.5 ml离心管中。使用至少10 µg总蛋白进行GFP和管家基因（例如， GAPDH ）的蛋白质印迹。使用未转染的WT MEF作为阴性对照，使用GAPDH作为加载对照。此步骤对于检查完整的NLS-HA-2XMCP-eGFP-BirA *构建体是否表达给出91.4 kDa的条带非常重要（图2A）。
4. 要检查BirA *的活性和生物素化效率，请使用6孔培养皿。WT-BirA *和MBS-BirA * WT未转染的3 x 10 4 细胞的种子重复样，并在完全培养基中培养24小时。第二天，交换媒体。使用含50μM生物素的完整培养基，每个重复样本仅加一孔。对于第二组重复项，只需将介质与不含生物素的新的完整介质交换即可。
5. 用新培养基（有或没有生物素）培养细胞至少6小时，最多24小时。6小时后，生物素化效率可能不会提高，具体取决于细胞系。
6. 孵育结束时，用冷PBS洗涤6孔培养皿的孔两次，最后加入胰蛋白酶分离细胞。
7. 通过添加500μl/孔的温暖胰蛋白酶溶液分离细胞，并在37°C下孵育培养皿2-3分钟。2分钟后，在细胞培养显微镜下（放大10倍）检查所有细胞是否完全分离。如果没有，将细胞留在培养箱中，但培养时间不要超过5分钟。
8. 用细胞除去溶液，并将其转移到15 ml锥形管中。加入6 ml含FBS的完全培养基以使胰蛋白酶失活。
9. 在室温下以500 x g 旋转细胞5分钟。
10. 除去培养基，加入1 ml冷的1x PBS，用1 ml尖端重悬沉淀，并通过在4°C下以500 x g 离心4分钟再次沉淀细胞。
11. 重复步骤B10以完全删除介质。
12. 向每个沉淀中加入3种含有1x完全蛋白酶抑制剂的PCV裂解缓冲液，重悬细胞，并在冰上放置10分钟。通过将沉淀物通过21 G针10-15次来裂解细胞。裂解后，将裂解物在4°C下于12,000 x g 旋转10分钟以除去未破碎的细胞。
13. 确定蛋白质浓度（ eg ，按照制造商的规程通过Bradford分析）。
14. 将10 µg总蛋白质与SDS-PAGE上样缓冲液混合。
15. 在95°C下将混合物煮沸5分钟，然后在室温下以12,000 x g 旋转碎片3分钟。
16. 将步骤15中的上清液加载到1x MOPS运行缓冲液中的Nu-PAGE SDS-PAGE凝胶上，并在200 V下运行，直到前染料退出凝胶。
17. 通过半干蛋白质印迹法（在250 mA下2.5 h）将蛋白质从凝胶上转移到活化的PVDF膜上。
18. 转移完成后，在小盒中用TBST（配方9）清洗PVDF膜两次，每次在室温下旋转或倾斜5分钟。
19. 为了探测生物素化的蛋白质，与碱性磷酸酶结合的抗生蛋白链菌素孵育。
20. 将膜与AP底物缓冲液（配方7）在室温下孵育5分钟。
21. 除去AP底物缓冲液。在15 ml锥形管中，将5 ml新鲜制得的AP底物缓冲液与NBT（配方6）（最终浓度50μg/ ml）和BCIP（配方5）（最终浓度50μg/ ml）一起混合。将混合物倒在膜的顶部，并避光。
22. 在避光的振荡器上孵育膜，并每隔1分钟检查一次，直到您看到生物素化蛋白的紫色条带为止（图2B）。
23. 一旦测试了生物素化是否正常，就可以继续进行大规模生物素化实验，以纯化生物素化蛋白并进行质谱分析。
RNA生物识别
1. 要捕获和分析RNA-BioID中的生物素化蛋白，每轮质谱分析需要一个融合的T175烧瓶细胞（2-3 x 10 7 ）。
2. 在抗生蛋白链菌素下降的前一天，汇合度应达到80％。一个T175烧瓶的培养基替换为WT-BirA *或MBS-BirA *细胞含生物素的培养基，并培养16-24小时。
3. 在室温下用PBS洗涤细胞两次，以处理死细胞和含血清的培养基。在培养箱中胰蛋白酶消化2-3分钟。在显微镜下检查细胞脱离后，将细胞转移到锥形管中，并加入5 ml含血清的培养基以使胰蛋白酶失活。
4. 在4°C下以500 x g 离心5分钟收集细胞。
5. 用冰冷的PBS洗涤细胞两次，以完全去除培养基。
6. 在每个沉淀物中加入3 PCV裂解缓冲液（包括Complete TM 蛋白酶抑制剂混合物）并重悬。
7. 裂解细胞，收集裂解物并如上所述确定蛋白浓度（步骤B12-B13）。
8. 为了分离生物素化的蛋白质，每个裂解物使用至少1 mg的总蛋白质，每1 mg的蛋白质使用300μl的磁性链霉亲和素磁珠。
9. 要准备珠子，请通过快速涡旋将珠子溶液混合在原始供应商的试管中，将200μl珠子浆液移至新的1.5 ml管中，并通过在磁力架上捕获珠子5分钟，将珠子与其存储缓冲液分离。取出存储溶液，并用1 ml裂解缓冲液洗涤磁珠3次。在端对端旋转器上将含珠浆的试管旋转5分钟。
10. 将磁珠收集在磁力架上，并丢弃洗涤缓冲液。将1 mg的总细胞裂解物添加到微珠上，从磁力架上移开，将混合物放置过夜，并在4°C端到端旋转。
11. 第二天，将磁珠收集在磁力架上，用1 ml的洗涤缓冲液1（配方11）洗涤两次，用1 ml的洗涤缓冲液2（配方12）洗涤一次，用1 ml的洗涤缓冲液3（配方1）洗涤一次。 13），并用1 ml洗涤缓冲液4（配方14）洗一次，每次在室温下端对端旋转5分钟。
12. 在用1 ml洗涤缓冲液4进行的最终洗涤过程中，将100μl放入新的1.5 ml离心管中，并通过磁力架收集磁珠，并将磁珠存储在冰上直至步骤C14，以检查银染后蛋白质的富集。从磁力架上剩余的900μl收集珠子。
13. 用50 mM碳酸氢铵缓冲液洗涤小珠3次，每次在室温下旋转5分钟。收集珠子并立即进行步骤D或将珠子存储在-80°C（安全停止点）。
14. 从步骤C12中剩余的珠子中，加入50μl1x SDS样品缓冲液（配方16），将混合物在95°C下煮沸5分钟，然后在室温下以12,000 xg 旋转1分钟。。
15. 在室温下将离心管在磁力架上放置2分钟，然后将上清液移至新的1.5 ml离心管中。在1x MOPS运行缓冲液中的Nu-PAGE SDS-PAGE凝胶上加载20μl上清液，并在200 V下运行直到前部染料退出凝胶。
16. 在此凝胶上进行银染（Aboulaich，2011），以比较WT-BirA *中的蛋白质（显示被背景生物素化的蛋白质，如线粒体羧酶和未特异性结合至磁珠的蛋白质）和生物素处理后的MBS-BirA *细胞（图2C）。
珠上胰蛋白酶消化
1. 向珠子（通常为30-80μl）中添加适量的变性缓冲液（配方17），使其覆盖良好，并在孵育过程中漂浮在悬浮液中。
2. 加入还原缓冲液（配方18）至终浓度为1 mM，在室温下在Thermomixer中以1,000 rpm孵育1 h。
3. 加入烷基化缓冲液（配方19）至终浓度5.5 mM，在室温下在Thermomixer中以1,000 rpm孵育1 h。
4. 加入1μgLysC进行预消化，并在pH 6-10 pH试纸上检查pH。pH值必须约为8，否则，应使用1 M Tris-base pH 8进行调节。在室温下在Thermomixer中以1,000 rpm孵育3 h。
5. 加入4体积的20 mM碳酸氢铵缓冲液以稀释缓冲液中的尿素。
6. 加入1μg胰蛋白酶进行消化，并在pH 6-10 pH试纸上检查pH（pH应该为8），在室温下在Thermomixer中以1,000 rpm孵育过夜。
7. 通过使用磁力架分离珠子和上清液，并将上清液转移到新管中。
8. 用TFA酸化样品至pH≤2。
肽清除
1. 将样品上样到PHOENIX肽纯化试剂盒设备上。
2. 遵循试剂盒规程执行清洗程序（清洗和洗脱步骤）。
3. 洗脱后，在真空浓缩器中将样品体积减小至≤9μl（在30°C下30-40分钟）。
4. 添加1μl溶剂A *（配方20），并用溶剂A（配方21）将样品体积调整为10μl。
质谱分析F. 质谱分析
1. 使用在线纳流液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析肽样品。请注意，这是蛋白质组学的常规分析，可以在与最新型高分辨率质谱仪联用的任何高性能液相色谱系统上进行。
2. 在这里，nanoLC-MS / MS分析是在通过电喷雾电离源连接到LTQ-Orbitrap Elite的EASY-nLC 1200系统上完成的。
3. 在600 bar的恒定压力下，将25 cm长，内径为75μm的分析柱与反相的C18-AQ Reprosil-Pur 1.9μm颗粒一起装填，并将柱切成最终长度为20 cm。
4. 以500 nl / min的流速将肽直接上样到色谱柱上。
5. 上样后将流速降低至200 nl / min，并用分段线性梯度HPLC溶剂B（配方23）（5-33-50-90％）分离肽87分钟。
6. 使用以下采集周期以正离子模式运行质谱仪：使用Orbitrap池以R 120,000的分辨率测量全扫描，然后使用碰撞对线性离子阱中前15个最强肽离子的MS / MS进行质谱分析-诱导的解离（CID）。采集质量范围从m / z 300到2000的前体离子，并将目标值1E6电荷用于全扫描（Orbitrap分析仪），并将目标值5E3电荷用于线性离子阱中的碰撞诱导解离（CID）。需要在60 s的进一步选择中排除已测序的前体质量。
  
  图2.集成的BirA *融合构建体的功能验证。 A.通过Western印迹检测全长BirA *构建体的表达。仅通过MBS MEF细胞中的GFP部分通过Western blot可以检测到nls-HA-2x mcp-egfp-BirA *转基因的全长融合蛋白。GAPDH可以用作阴性对照蛋白，因为它可以从WT和MBS-BirA * MEF的裂解物中检测到。B.使用AP偶联的抗生蛋白链菌素测试MEF中的BirA *活性。将MEF与50μM生物素温育24小时后，将细胞裂解，并从泳道上取WT和MBS-BirA * MEF细胞的10μg总细胞裂解液。使用AP-链霉亲和素通过Western印迹在比色测定中检测到生物素化的蛋白质。C.通过链霉亲和素偶联的磁珠纯化后获得的RNA-BioID中生物素化蛋白质的模式。将通常用于质谱分析的磁珠的1/10 在100μlSDS样品缓冲液中煮沸。将其中的20微升装在10％SDS-PAGE上，分离并通过银染检测。MBS-BirA * MEF 裂解物中的蛋白条带数量和强度远大于WT-MEF，表明成功的RNA依赖性生物素化和相关蛋白的捕获。

菜谱

完全培养基（500毫升）
445 ml DMEM介质
50毫升FBS
5 ml青霉素-链霉素溶液
无血清培养基（100毫升）
99 ml DMEM介质
1 ml青霉素-链霉素溶液
生物素培养基（100毫升）
89 ml DMEM介质
10毫升FBS
1毫升青霉素-链霉素溶液
50 µM生物素
50 mM生物素溶液
2.44毫克生物素
10毫升无血清DMEM
需要移液以完全溶解生物素。通过0.22-μm注射器驱动的过滤器单元进行消毒
在4°C下最多可活动8周
BCIP
50 mg / ml BCIP
高纯H 2 O
NBT
10 mg / ml NBT
高纯H 2 O
AP底物缓冲液
100 mM氯化钠
5毫米MgCl 2
100 mM的Tris-Cl pH 9.5
1个TBS
50 mM Tris-Cl pH 7.5
150毫米氯化钠
1个TBST
1个TBS
0.1％吐温20
裂解缓冲液
50 mM Tris-Cl pH 7.5
150 mM氯化钠
2.5 mM氯化镁 2
1毫米DTT
1％的Triton X-100
1x蛋白酶抑制剂（Roche）
洗涤缓冲液1
2％SDS
高纯H 2 O
洗涤缓冲液2
0.1％脱氧胆酸盐
1％吐温20
500 mM氯化钠
1毫米EDTA
50 mM HEPES pH 7.5
洗涤缓冲液3
250 mM氯化锂
0.5％吐温20
0.5％脱氧胆酸盐
1毫米EDTA
10 mM Tris pH 8.1
洗涤缓冲液4
50 mM Tris pH 7.4
50毫米氯化钠
20 mM ABC缓冲液
79.06 mg碳酸氢铵
50毫升无RNase和DNase的水
2个SDS样本缓冲区
100 mM Tris-Cl pH 6.8
4％（w / v）SDS
0.2％（w / v）溴酚蓝
20％（v / v）甘油
200 mMβ-巯基乙醇
制成100μl等分试样并储存在-20°C
变性缓冲液
6 M尿素
2 M硫脲
10 mM Tris缓冲液（pH 8.0）
还原缓冲区
1 M二硫苏糖醇
50 mM碳酸氢铵
烷基化缓冲液
550毫米碘乙酰胺
50 mM碳酸氢铵
溶剂A *
2％乙腈
1％甲酸
溶剂A
0.5％醋酸
HPLC溶剂A
0.1％甲酸
Milli-Q水
HPLC溶剂B
0.1％甲酸
Milli-Q水中的80％ACN

致谢

该协议改编自（Mukherjee et al。，2019）。我们感谢Jeff Chao（FMI，巴塞尔）和JuliénBethune（BZH，海德堡）的质粒和细胞系。Silke Wahle（PCTTübingen）被公认为提供技术支持。该项目是由Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG JA696 / 11-1）资助的，是DFG研究部FOR2333的一个项目。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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