材料和试剂

注意小号：

根据研究人员的判断，以下化学物质可与适当的替代品互换。
所有这些成分都可以在室温下干燥的条件下存储。

不锈钢安装晶片
铜线
封口膜
22 x 22毫米玻片
显微镜盖玻片
细菌样本
钛金合金
Difco TM 琼脂，颗粒状（VWR，BD Biosciences，目录号：90000-786 ）
L-谷氨酸水合钠（Sigma-Aldrich，目录号：G1626）
甘油99％纯度（Fisher Chemical，目录号：G / 0650/17）
3-（N-吗啉代）丙烷磺酸（MOPS）（Sigma-Aldrich，目录号：M9381）
二水合磷酸氢钾，K 2 HPO 4 ·7H 2 O （Sigma-Aldrich，目录号：431478）
正磷酸二氢钾，KH 2 PO 4 （Fisher Chemical，目录号：7778-77-0）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
氯化铵，NH 4 Cl（Fisher Chemical，目录号：12125-02-9）
氯化钙，CaCl 2 ·2H 2 O（Fisher Chemical，目录号：10035-04-8）
氯化镁，MgCl 2 （Fisher Chemical，目录号：7791-18-6）
氯化亚铁（FeCl 3 ·6H 2 O）（Fisher Chemical，目录号：10025-77-1）
氯化锰MnCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：244589）
氯化锌ZnCl 2 （Fisher Chemical，目录号：7646-85-7）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
硫黄素T（Sigma Aldrich，目录号：T3516）
氢氧化钠
LB汤（Fisher Scientific，目录号BP1426-2 ）
0. 5 M磷酸钾缓冲液（pH 7）（请参阅食谱）
MOPS缓冲区（请参阅食谱）
修改后的MSgg （请参阅食谱）

设备

注：牛逼，他列出斯特拉特福德等人所使用的特定设备。，2019 可在表中找到1 - 2 。

基本设备

倒置荧光显微镜
显微镜培养箱
温度控制器
荧光灯光源
任意函数发生器
定制电极盘（材料清单在表3中）。
继电器电路（该图在图4中）。
电子束气相沉积系统或等效合金沉积方法
注意：使用CytePulse 方法不需要＃5- 8 。

辅助设备

pH计或试纸
体重秤
摇摇培养箱
音量可调的移液管，从0.1 微升至1000 微升
量筒或血清移液管从5 - 100毫升
解剖刀
镊子
本生燃烧器

表1 。基本设备示例设备清单

基本设备

正文参考

基础学习设备

多级荧光显微镜

配备Leica CTR高级电子盒的Leica DMi8显微镜（Leica）

孵化室

佩康有限公司（PeCon ）

温度控制器

TempController 2000-2加热器单元（Pecon ）

荧光灯光源

Lumencor SOLA SE光引擎光源（Lumencor ）

任意函数发生器

泰克AFG1062函数发生器（RS，目录号：898-6858）

定制电极盘

施工过程：s 程序A

物料清单：表3

CytePulse 易损件。

CytePulse 耗材（Cytecom ）

继电器电路

物料清单：表3 。

电路图：图4

电子气相沉积系统

定制模型II2000EB（科学真空系统）

表2 。辅助设备示例设备清单

辅助设备

正文参考

基础学习设备

pH计

pH计（Fisher-Scientific，目录号：AE-150）

体重秤

分析天平（Fisherbrand ，目录号：PS100）

摇摇培养箱

摇动培养箱（Labnet ，目录号：311DS）

可调量移液器

可调量移液器（Eppendorf，Research Plus）

分光光度计

Jenway 7305分光光度计

表3 。定制电极盘物料清单

零件

制造商

制造商零件编号

数量

玻璃底显微镜皿

威尔科·威尔斯

HBST-5040

4

爱牢达两部分环氧树脂

一个红宝石

2457-H

1个

钕磁铁

中号agnets4U

SP515-50

50

不锈钢口罩

激光微加工

不适用

1个

M 6平板维修洗衣机

奇异用品

不适用

4

Arduino Uno（版本3）

Arduino的

0000

1个

中继

RS PRO

291-9704

7

凤凰联络人

凤凰联络人

1725656

4

BNC母连接器

RS PRO

526-5864

4

电阻1MΩ

TE Connectivity

LR1F1M0

7

原型面包板

维罗技术

01-0021

1个

10路IDC连接器（公）

RS PRO

625-7252

7

10路IDC连接器（母）

RS PRO

625-7369

4

10向带状电缆卷盘

RS PRO

360-093

1个

2.54 mm间距排针

RS PRO

251-8121

3

面包板跳线

RS PRO

791-6463

1个

软件

显微镜控制软件（例如，的MetaMorph ，微经理[ micro-manager.org/ ] ）
Arduino IDE（arduino.cc）（Cytepulse 方法不需要）
图像处理软件（例如，Fiji / I mageJ（fiji.sc）（Schindelin 等人，2012 ））
数据处理软件（例如，Matlab的，水蟒的Python / R分布[ anaconda.com ] ）。

程序

对于那些使用定制方法的人员，如Stratford 等人所述。（2019 ）必须遵循所有步骤。对于使用CytePulse 系统（Cytecom Ltd）的用户，请跳至步骤C “ 样品制备”部分。另外，值得注意的是，该过程中标有星号（*）的步骤仅适用于采用定制方法的步骤。如果使用CytePulse 产品和耗材，请忽略这些步骤。

定制电极盘结构
在下面的方法是基于使用电子束汽相淀积系统。不同的方法可以不同的结构之间变化小号。图2提供了说明性指令。

CON STRUCT负不锈钢掩模（图1）。这是由一家激光制造公司完成的。

图1.负极掩模。用于定制电极皿构造的负电极掩模示意图。

构造安装晶片（图2）。

图2.安装晶片的过程。一世。安装晶片结构所需的材料（1 个不锈钢安装晶片； 4个不锈钢垫圈；双面胶带）。ii。在每个洗衣机的底部粘贴双面胶带。iii。将每个垫圈固定到安装晶片上。

将面罩放入玻璃底显微镜皿中（图3）。

图3. Bespo ke电极盘结构；步骤A3-A6。所有数字对应于定制电极构建过程中的它们各自的步骤。

使用非磁性镊子在与每个电极平行的位置放置12个镍磁体。这样可以确保面罩与玻璃接触。
将带有面罩，磁铁和电线的碟子安装到安装晶片上的不锈钢平台上。放入电子气相沉积系统。
使用电子气相沉积法（20 nm Ti ； 80 nm Au）将钛金合金沉积到培养皿上。
从蒸镀机上取出碟子。使用光学显微镜检查每个位置的电极间隙是否连续。
将大约5厘米的7根铜线焊接到公IDC连接器的相应引脚上。
使用烙铁，在现在已图案化的玻璃底电极盘的塑料边缘上创建7个小孔。将每个铜线穿过一个孔。用Araldite两部分环氧树脂将公IDC连接器固定到培养皿的边缘。
将铜线修剪成适当的长度，以接触每个电极端子（包括接地），如图3 所示。用导电石墨环氧树脂将铜线粘合在一起。石墨环氧树脂固化后，进一步用Araldite两部分环氧树脂涂覆石墨结合剂以防水。

继电器电路构造
以下电路用于控制跨电极的电刺激。门控各个电极，直到手动触发或在预定数量的显微镜图像后触发为止，具体取决于用户显微镜的配置。物料清单可在表2中找到。运行该电路的代码位于github （github.com/ ConorEd / ElectrodeStimulation ）。

焊接两个BNC母连接器；6个继电器原型板有6个1MΩ电阻器和2个10通IDC公头连接器，如图4所示。
沫ü NT中的Arduino UNO微控制器的原型板并连接Arduino的GPIO引脚到所述电路如图4这可以通过从电路或者挤压试验板跨接线来实现，并将它们插入到销，或创建“屏蔽通过将2.54 mm间距的排针焊接到电路板上。
将带状电缆切成适当的长度，以到达显微镜和信号记录设备。
将两个10通IDC母头连接器连接到显微镜电缆的任一端。
使用USB B电缆将Arduino UNO微控制器连接至计算机，然后上传位于www.github.com/ConorEd/ElectrodeStimulation的代码。

图4.继电器电路图。继电器电路构造的详细示意图。

样品preparatio Ñ （图小号5 和6 ）
该方法可适用于许多细菌菌株或物种，需适当选择液体和固体生长培养基。威尔D型枯草芽孢杆菌（NCIB3610），或大肠杆菌（K12），在OD的密度600 = 1.5，作为粘性物的方法d模式生物和斯特拉特福使用等。，2019。

以下协议细节的野生型培养物的程序枯草芽孢杆菌（NCIB3610），OD 600 〜1.5。使用经过或未经过抗生素万古霉素处理的培养物，该程序可确定对抗生素敏感的细胞和对耐药的细胞。在斯特拉特福等。（2019 ），我们显示了用UV，乙醇或CCCP处理过的细胞显示出与未经处理的增生细胞不同的反应。可以测试用不同的抗菌剂或程序处理过的细胞的快速AST的电响应。

注意：虽然此方法应适用于广泛的微生物，但可能需要适应于具有不同生长要求的物种和/或菌株。

LB文化

将枯草芽孢杆菌的单个菌落放入LB液体培养基的5 ml等分试样中。使用微生物学的标准无菌技术。
放置在振荡培养箱（37 °C; 200 rpm）中过夜。监测使用分光光度计细胞培养物的光密度，基准OD 600 在此过程中在所述时间实验的是大约1.5。

MSgg 液体培养

将枯草芽孢杆菌LB培养物在3,220 xg （4,000 rpm）下离心5分钟; 保留沉淀并丢弃液体上清液。
在等体积的补充或不加万古霉素（或其他抗菌剂）的MSgg 液体培养基中重悬沉淀。
将培养物置于振荡培养箱（30 °C; 200 rpm）中1 h 。

创建琼脂垫*

提取培养物之前〜30分钟，创建琼脂垫
放置在显微镜盖玻璃上的P arafilm，这确保了液体MSgg 琼脂溶液保持小号上Ç 超过玻璃。加入1 米升液体的MSgg 琼脂到单个22×22毫米的玻璃滑，小心覆盖整个滑移。

立即在琼脂上放置另一个盖玻片，然后等待琼脂凝固。避免形成气泡。
用镊子和手术刀将顶部的玻璃片从固体琼脂上倒出，然后将琼脂切成约50 mm 2的方形垫。

装载样品放入电极盘或Cytecom 样本保持器（图小号5 和6 ）
将1.5μl 细胞悬液添加到每个琼脂垫上，确保液滴在中心且不接触垫的边缘，以防止由于细菌生长而导致垫侧向漂移。
等待10分钟，使滴液在室温下干燥至琼脂垫中。
用手术刀和镊子将琼脂垫从底部缓慢提起并翻转到电极上，使样品的一面朝下，以使样品直接与电极接触。*
注意：琼脂垫可能非常脆弱，请注意不要破坏或划伤琼脂垫。确保将接种面朝向电极。

关闭培养皿或Cytecom样品架上的盖子，以防止样品干燥。
注意：如果使用所述定制的电极盘，确保P arafilm密封盘关闭，以防止从样本过多水分流失。

准备样品进行显微镜检查
将培养皿固定在显微镜载物台插入物中。如果使用油浸透镜，则在每个电极上方，将浸油浸入培养皿或Cytecom样品架的底部。
将载物台插入显微镜载物台。
打开MetaMorph （或等效的显微镜操作软件）。
找到电极的位置，并在相衬，DIC或明场照明下找到正确的焦点。使用显微镜软件保存电极的位置。对所有6个电极重复此操作。
注意：在远离电极的位置添加一个“静止”位置，这应该是物镜在成像序列之间保持远离电极的位置。这有助于防止垫变干。

将样品在30 °C下在显微镜室中静置1 h，以防止由于热移动而引起的焦点漂移。

延时显微镜设置
按照表4 设置显微镜参数。时差分别用于每个位置。

表4 。蒂姆· E-推移显微镜参数

参数

设置

总时长

1分钟

影像间隔

500 毫秒

波长

434 nm（CFP滤光片）

曝光时间

150 毫秒

荧光强度

X

将代码（https://github.com/ConorEd/ElectrodeStimulation）上传到Arduino UNO。* 微控制器，确保所有继电器均设置为闭合。在Arduino IDE上载之前，可以设置手动或显微镜触发的继电器控制。
验证电刺激设置正确（如表5所示）。
打开信号发生器。*
通过IDC连接器将电极盘连接到设备（图7 ）。

表5 。电刺激参数

参数

设置

持续时间

2500 毫秒

波形图

正弦波

频率

100赫兹

电压

±1.5伏

偏移量

0伏

图5. 从细胞培养到显微镜的定制方案概述。用于创建细胞培养物，MSgg 液体培养物，创建琼脂垫并将样品加载到Cytecom 样品架中的示意图。

图6. cytecom 协议概述；从细胞培养到显微镜。硅。创建细胞培养物（方法见补充信息）。慈 MSgg 液体培养。D.将样品装入Cytecom 样品架。

图7.将碟子连接到设备。将信号输出IDC连接器分别连接到i）定制碟或ii）CytePulse载物台插件。

通过显微镜软件开始图像采集。

数据分析

将延时图像序列加载到Fiji / ImageJ中（Schindelin 等，2012）（或平衡图像分析软件）
注意：建议将数据集作为电影播放，以确保没有因电解而引起的焦点漂移，图像漂移或气泡形成。

使用ImageJ中的ROI管理器在单个单元格周围添加感兴趣的区域（ROI）。
使用ROI Manager中的多项测量功能来测量随时间变化的强度值。在基础研究中，我们观察到增殖细胞中的荧光强度增加，而抑制细胞中的荧光强度降低。

菜谱

ñ OT E：所有的媒体需要进行高压灭菌，用标准的微生物无菌技术处理。

磅
按照瓶子上的指示混合25 g / L

0. 5 M磷酸钾缓冲液（pH 7）
混合68.5 ml 1 M K 2 HPO 4 和31.5 ml 1 M KH 2 PO 4
加100 毫升水稀释至0. 5 M
1 M MOPS缓冲区
将1 摩尔MOPS盐倒入900毫升水中
用NaOH滴定pH至7.0
质量高达1 L
修改后的MSgg
1）20毫升小号terile 中号illQ 瓦特亚特

2）200 微升的1M MOPS b uffer

3）200 微升的0.5M钾，对hosphate b uffer

4）仅适用于MS gg 琼脂：0.3克琼脂

在固体MSgg 琼脂的情况下，加入成分1）-3）[1）-4）后高压灭菌]。对于固体MSgg 琼脂，在过程中使用培养基之前，先添加成分5）-14）[5）-15）。

5）200 微升50％的甘油（V / V）

6）200 微升25％葡萄糖的（W / V）

7）400 微升的25％L-谷氨酸（W / V）

8）200 微升的0.1氯化物M铵

9）20 微升的0.7M的CaCl 2

10）20 微升2 M MgCl 2

11）20 微升的0.1M的的FeCl 3

12）20 微升的0.05M的的MnCl 2

13）0.4 微升0.1M的硫胺的

14）0.2 微升的0.1M氯化锌的2

15）对于MSgg 琼脂只：20 微升的10mM的ThT的

16）对于AST，根据需要补充抗菌剂

致谢

该协议改编自St r atford 等。，2019年。这项工作得到了生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）/工程和物理科学研究委员会（EPSRC）对沃里克综合合成生物学中心（Grant BB / M017982 / 1）的资助。

利益争夺

JPS和MA是Cytecom Ltd（Cytecom.co.uk）的创始人和股东。JPS和CLAE是Cytecom Ltd.的雇员。JPS和MA已为该报告的技术申请了专利。

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