材料和试剂

安全密封杂交室，直径9毫米，深0.8毫米（包含密封片，Thermo Scientific，目录号：S24732）
EasYFlask 25 cm 2 （Thermo Scientific Nunc，目录号：156340-ROS）
血清移液管（Thermo Scientific Nunc，2 ml，5 ml，10 ml，50 ml）
细胞培养皿，150 mm x 20 mm （Thermo Scientific Nunc，目录号：168381-ROS）
粘附显微镜载玻片（Citotest ，目录号：188105）
15 ml锥形离心管（Thermo Scientific Nunc，目录号：339650-SPL）
50 ml锥形离心管（Thermo Scientific Nunc，目录号：339652-SPL）
过滤的移液器吸头（QSP，0.1-10 µl，2-20 µl，10-100 µl，20-200 µl，100-1,000 µl）
0.2 ml PCR管（AXYGEN，目录号：PCR-02-C）
1.5 ml微型管（AXYGEN，目录号：MCT-150-C）
0.22 微米的膜过滤器（Millipore公司，目录号：SLGP033RS）
HER2锁式探针（序列：5 ' - ATTACTTGCAGGTTCT TTCCTTTTAC GA CCTCAATGCTGCTGCTGT ACTAC TCTT CAGAATTCGTCCCCGG ，U nderline：靶杂交序列和检测探针的互补部分，粗斜体：RCA引物结合部分）（Synbio 技术，中国）
ACTB锁式探针（序列：5 ' - CTGTGCTCGCGGGGCG TTCCTTTTAC GA CCTCAATGCTGCTGCTGT ACTAC TCTT GGCAAAGGCGAGGCT ，U nderline：靶杂交序列和检测探针的互补部分，粗斜体：RCA引物结合部分）（Synbio 技术，中国）
RCA引物（序列：5 ' - ACAGCAGCAGCATTGAGGTC）（Synbio 技术，中国）
HRP标记的检测探针（序列：5 ' HRP-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC）（TaKaRa公司）
胃蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P7012 -1 G ），储存在-20 °C
胎牛血清（Hyclone ，目录号：10270-106），储存在-20 °C
胰蛋白酶（Hyclone ，目录号：SH30042.01），储存在-20 °C
ATP，100 mM溶液（Thermo Scientific，目录号：R0441），储存在-20 °C
T4 多核苷酸激酶，10 U / µl （Thermo Scientific，目录号：EK0032，包含PNK缓冲液A ），储存在-20 °C
dNTP套件，100 mM解决方案（Thermo Scientific，目录号：R0182），储存在-20 °C
SplintR 连接酶，25 U / µl（NEB，目录号：M0375L），储存在-20 °C
phi29 DNA 聚合酶，10 U / µl（Thermo Scientific，目录号：EP0094），储存在-20 °C
BSA，20 mg / ml（NEB，目录号：B9000S），储存在-20 °C
RiboLock RNase抑制剂，40 U / µl（Thermo Scientific，目录号：EO0384），储存在-20 °C
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-100ML），在室温下保存（RT）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-100ML），在室温下存放
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：795429-500G），在室温下存放
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9541-500G），存放在RT
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014-1kG），存放在RT
Na 2 HPO 4 （BBI LIFE SCIENCES，目录号：A610404-0500），存放在RT
KH 2 PO 4 （生工生物，目录号：A100781-0500），保存于室温
碘酸钠（BBI LIFE SCIENCES，目录号：A600859），在RT存放
硫酸铝钾十二水合物（生工生物，目录号：A500755），保存于室温
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012-100ML），存放在RT
苏木（Sigma-Aldrich，目录号：H3136-25G），存放在RT
中性香脂填充剂（BBI LIFE SCIENCES，目录号：E675007），在室温下存放
二甲苯（西龙SCIENTIFIC ，目录号：33535 - 5 00毫升），贮存于室温
乙醇（Macklin，目录号：E809061-500 ML ）在RT存放
醋酸盐（Macklin，目录号：A801295-500 ML ），存放在RT
盐酸（SCR，目录号：10011018），在室温下存放
DEPC（Sigma-Aldrich，目录号：D5758-25ML），储存在4 °C
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：16005-1KG-R），储存于4 °C
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037-100ML），储存在4 °C
20x SSC缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S6639），在4 °C下存储
1X磷酸盐缓冲盐水（海克隆公司，目录号：SH30256.01），保存于4 ℃下
不含DNase / RNase的水（Solarbio ，目录号：R1600），储存在4 °C
在H 2 O中30 wt。％的过氧化氢溶液（Macklin，目录号：H811240-500 ml），储存在4 °C
DAB 免疫组化显色试剂盒（BBI LIFE SCIENCES，目录号：EP670033），储存在-20 °C
EDTA （Sigma-Aldrich，目录号：RDD017-500G ），在室温下存放
无血清培养基DMEM / HIGH GLUCOSE （Hyclone ，目录号：SH30022.01 ），在4 °C下储存
青霉素-链霉素（Hyclone ，目录号：SV30010 ），储存在-20 °C
培养基（50毫升）（请参阅食谱）
10x PBS（500 ml），pH 6.8（请参阅食谱）
1x DEPC-PBS（1 L），pH 7.4（参见配方）
1个DEPC-PBS T （1 L）（请参阅食谱）
4％（w / v）PFA（500毫升）（请参阅食谱）
1x TE缓冲液（100 ml），pH 8.0（请参见食谱）
0.5％（v / v）Triton X-100（5毫升）（请参阅食谱）
3％（w / v）H 2 O 2 溶液（50μl ）（请参阅食谱）
2x杂交缓冲液（5 ml）（请参阅食谱）
洗涤缓冲液（15毫升）（请参阅食谱）
2x检测缓冲液（5 ml）（请参阅食谱）
染色缓冲液（50μl ）（参见配方）
0.1％盐酸 -乙醇（5毫升）（请参阅食谱）
苏木精染色液（50毫升）（请参阅食谱）
25 mM dNTP s （100μl ）（请参阅食谱）

设备

Vorte x 混合器（MIULAB，型号：MIX-25P）
微量离心机（MIULAB，型号：Mini-6K）
电磁搅拌器（IKA，RCT基础）
pH计（OHAUS，型号：starter3100）
PCR机（BIOER，型号：TC-XP）
分析天平（OHAUS，型号：AS220.R2）
移液器（Eppendorf AG，研究部另加）
细胞培养培养箱（Esco ，型号：CCL-170B-8）
生物安全柜（Esco ，型号：AC2-4S1）
超低温冷冻机（Thermo，型号：DW-86L338）
冰柜（西门子，型号：KG32EV2S0C）
电加热恒温中耕机（ENXIN，型号：DRP-9052）
显微镜（徕卡，型号：DM6B，配有DFC7000T相机）

软件

CellProfiler
GraphPad棱镜

程序

细胞培养和样品制备
预热2 ml 1x DEPC-PBS，23 ml 培养基和0.8 ml 0.25％（w / v）胰蛋白酶 -EDTA 到37 ℃ 。
在细胞培养瓶中取出用过的培养基（例如，取25 cm 2的烧瓶）。
用2 ml 1x DEPC-PBS短暂洗涤。吸出PBS。
向烧瓶中加入0.8 ml的0.25％（w / v）胰蛋白酶-EDTA，盖上细胞。
用倒置显微镜检查细胞，以确保大多数细胞均已取整，但仍附着在烧瓶上。小心取出胰蛋白酶。
3毫升培养基添加至烧瓶中，暂停的从附着细胞层的细胞和通过将它们充分混合移液。
将5张玻片放入培养皿中，并向其中加入20 ml培养基以覆盖玻片。
将重悬的细胞接种在玻片上。
静置至少10分钟，直到重悬的细胞在玻片上平息。
将培养皿转移到细胞培养箱中（37 °C ，5％CO 2 ）。
培养细胞，直到它们达到80％融合（12-48 小时）。
孵育12-48小时后，取出并丢弃培养基。
用25毫升1x DEPC-PBS 洗涤3次，每次3分钟。
加入25 ml 4％（w / v）PFA到培养皿中，在室温下覆盖玻片30分钟。
用25 ml 1x DEPC-PBS 洗涤两次，每次3分钟。
执行dehy d 配给使用乙醇系列的70％，85％，乙醇为绝对每次5分钟。空气干燥。
注意：样品玻片可以在-80 °C 下保存，直到使用。

预处理
P hosphorylate锁式探针使用前。制备50 微升混合含有38 微升DEPC-H 2 O，1 μ 升锁式探针（100 μ 中号），5 μ 升PNK缓冲液A （10 X ），5 μ 升ATP （10 毫），1 μ 升 T4 多核苷酸激酶（10U / μ 升）在0.2毫升PCR管。
我ncubate 上述混合物在37 C° 30分钟，65 ℃下10分钟，在PCR机器。
注意：对于福尔马林固定，石蜡包埋的病理组织切片，执行预处理过程小号3〜20，希望17和18对于细胞样品，执行预处理过程小号14至20。

将玻片在60 °C下烘烤30分钟。
把滑入二甲苯为15分钟和另一新鲜二甲苯10分钟，分别。
将玻片放入无水乙醇两次，两次于95％乙醇中，两次置于70％乙醇中，每次2分钟。
用DEPC- H 2 O处理玻片5分钟以完成补液。
用DEPC-PBS洗涤2分钟。
用DEPC-PBS中的4％（w / v）PFA进行固定过程10分钟。
用DEPC-PBS洗涤2分钟。
将玻片放入0.1 mg / ml胃蛋白酶在0.1 M HCl中的溶液中，在37 °C下放置30分钟。
用DEPC- H 2 O 洗涤5分钟。
用DEPC-PBS洗涤2分钟。
Dehydrat Ë 由滑动的乙醇系列的70％，85％，和无水乙醇，每次1分钟。
空气干燥。
甲ssemble 的9mm直径和0.8毫米深度的安全封条杂交室上，其中所述样品是一侧的载玻片的表面（图1）。以下所有的孵育步骤发生在用的体积的腔室50 微升。

图1. 甲ssemble杂交腔室，以滑动的表面，其中样品是。在每个填充口上放置一个密封片，以防止溶液蒸发和样品干燥。

用含0.05％Tween-20的DEPC-PBS（DEPC-PBST）冲洗细胞样品。
添加50 微升 0.5％（V / V）的Triton X-100（在DEPC-PBS）到室中以通透，在室温10分钟的细胞。
用1x DEPC-PBST洗涤3次。
申请50 微升3％（w / v的）H 2 ö 2 溶液在室温下将样品15分钟以阻断内源性过氧化物酶秒。
用DEPC-PBST洗涤3次。

挂锁探针杂交
制备50 微升锁式探针杂交混合物含有22.5 微升 DEPC-H 2 O，25 微升2×杂交缓冲液和2.5 μl的p hosphorylate d 锁式探针（2 μM ，从B2 ）。
将混合物加到培养箱中，并在37 °C 下孵育2小时。
用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
用DEPC-PBST洗涤3次。

挂锁探针结扎
制备50 微升锁式探针连接混合物含有6.5 微升DEPC-H 2 O，31.25 微升 80％（V / V）甘油， 5 微升BSA（2毫克/毫升），1.25 微升的RiboLock RNA酶抑制剂（40U / 微升），5 微升SplintR 连接酶反应缓冲液（10X）和1 微升 SplintR 连接酶（25U / 微升）。
将混合物加到培养箱中，并在37 °C 下孵育1小时。
用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。

RCA引物杂交
制备50 微升RCA引物杂交混合含有20 微升DEPC-H 2 O，25 微升2×杂交缓冲液和5 微升RCA引物（10 μM ）。
将混合物加到培养箱中，并在37 °C 下孵育30分钟
用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
用DEPC-PBST洗涤3次。

RCA
制备50 微升RCA混合含有26.75 微升DEPC-H 2 O，5 微升50％（V / V）甘油，2 微升的dNTP（25 毫），5 微升 BSA（2毫克/毫升），1.25 微升的RiboLock RNA酶抑制剂（40 U / μL ），5 微升的phi29 DNA 聚合酶缓冲液（10X）和5 微升的phi29聚合酶（10U / 微升）。
将混合物加入室中，并在室温下孵育16-18小时。
用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
用DEPC-PBST洗涤3次。

RCA产品检测
制备50个微升 RCA产物检测混合物含有10 微升DEPC-H 2 O，25 微升2×检测缓冲液，12.5 微升80％（V / V）甘油和2.5 微升HRP- 标记的检测探针（2 μM ）。
将混合物加入室中，并在室温下孵育30分钟。
用DEPC-PBST洗涤3次。

染色和安装
将样品与染色溶液一起孵育3至8分钟，具体取决于颜色。
用DEPC-H 2 O 洗涤3次。
染色核苏木精染色液 1分钟。
用DEPC-H 2 O 洗涤3次。
用0.1％盐酸-乙醇微分1分钟。
用DEPC-H 2 O 洗涤3次。
将玻片放入1x DEPC-PBS中1分钟。
用DEPC-H 2 O 洗涤3次。
移开腔室，并用自来水冲洗5分钟。
Dehydrat Ë 由乙醇系列的70％，85％，和无水乙醇，每次1分钟的幻灯片。
安装，带15-20滑动微升中性香脂安装平台。

图像采集
使用40倍物镜，用明场显微镜采集图像。
在图像中，检测到棕点，单个的mRNA分子和细胞核显示为蓝色（图2和3 ）。

图2 。MCF-7细胞ACTB mRNA的检测。比例尺= 40μm 。

图3 。的检测HER2 的mRNA 分子 S IN HER2阳性和HER2阴性乳腺癌FFPE组织切片。比例尺s = 40μm 。

数据分析

通过使用CellProfiler 图像分析软件可以对检测到的RNA分子进行定量分析。的图像与“处理Unmixcolors ”，“ EnhanceOrSuppressFeatures ”，“ IndentifyPrimaryObjects ”，“ IndentifySecondaryObjects ”，“ IndentifyPrimaryObjects ”和“ RelateObjects 反过来”模块。要删除的背景下，“ Unmixcolors ”模块用于拆分成苏木和DAB两个通道。该“ EnhanceOrSuppressFeatures ”模块是用来突出DAB染色斑点。最后，通过“ RelateObjects ”模块识别信号与其宿主细胞的关系。然后列出了每个单元的RCP数量。使用GraphPad Prism进行统计绘图。

笔记

对于FFPE组织切片和新鲜冰冻组织切片，预处理是不同的，由于不同类型的组织，包括permeabiliz 一个重刑和固定。
溶解寡核苷酸，并用1x TE缓冲液稀释。锁式探针，RCA引物和检测探针的储备浓度为100 μ 中号，10 μ 中号和2 μ 中号分别。
根据细胞类型，调整核酸复染的实验条件，例如染色时间，染色液浓度。
使用溶液之前，将DEPC加热灭活。
在向腔室中添加新溶液之前，请吸取先前步骤中的溶液。

故障排除：表1列出了实验失败的可能原因和解决方案的列表。

表1 。故障排除表

问题

可能的原因

解

很少或没有信号

挂锁探针未5 ' 磷酸化

带有PNK的磷酸化挂锁探针

在感兴趣的细胞中，RNA的丰度很低

增加靶向同一RNA上不同杂交位点的挂锁探针的数量

使用适当的阳性对照细胞系

弱染色

DAB染色液不新鲜

准备新鲜的DAB染色液

高背景

DAB染色时间过长

缩短染色时间

内源性过氧化物酶未被阻断

用3％H 2 O 2 溶液阻断内源性过氧化物酶

菜谱

培养基（50毫升）
45 ml无血清培养基

5毫升胎牛血清

0.5 ml青霉素-链霉素溶液

储存在4 °C

10x PBS（500毫升），pH 6.8
40克氯化钠

1克氯化钾

7.2克Na 2 HPO 4

1.2克KH 2 PO 4

500毫升超纯水

过滤器使用0.22的溶液微米的膜过滤器

准备新鲜

1x DEPC-PBS（1 L），pH 7.4
100毫升10x PBS

900毫升超纯水

1毫升DEPC

储存在4 °C

1个DEPC-PBS T （1 L）
1升DEPC-PBS

0.5毫升Tween-20

储存在4 °C

4％（w / v）PFA（500毫升）
对于4％多聚甲醛溶液：

向480毫升1x DEPC-PBS中添加20克EM级低聚甲醛
加入5 ml的5 M NaOH，并在约30 °C 的加热块上轻轻搅拌直至多聚甲醛溶解
使混合物冷却至室温和一个将pH djust至7.4用HCl
然后用1x DEPC-PBS将最终体积调节至500 ml
过滤通过0.22的溶液微米的膜过滤器，以除去任何颗粒物质
使等分的多聚甲醛溶液保鲜之前使用，或存放- 20℃数月。避免反复冻结/解冻
1x TE缓冲液（100 ml），pH 8.0
1毫升1 M Tris-HCl（pH 8.0）

0.2 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）

98.8毫升DEPC-H 2 O

过滤器使用0.22的溶液微米的膜过滤器

储存在4 °C

0.5％（v / v）Triton X-100（5毫升）
25 微升的Triton X-100

4.975毫升DEPC-H 2 O

存放在RT

3％（w / v）H 2 O 2 溶液（50μl ）
5 微升30％（w / v）H 2 O 2

45 微升DEPC-H 2 O

准备新鲜

2x杂交缓冲液（5 ml）
3毫升20x SSC

1毫升甲酰胺

1毫升DEPC-H 2 O

存放在RT

洗涤缓冲液（15毫升）
1.5毫升20x SSC

3毫升甲酰胺

10.5毫升DEPC-H 2 O

存放在RT

2x检测缓冲液（5 ml）
1毫升20x SSC

5 微升Tween-20

0.2毫升20毫克/毫升BSA

3.975毫升DEPC-H 2 O

储存在4 °C

染色缓冲液（50μl ）
45 微升 DAB缓冲

2.5 微升20×DAB底物溶液

2.5 微升20×DAB显色溶液

准备新鲜

0.1％盐酸 -乙醇（5毫升）
50 微升盐酸

3.713毫升乙醇

1.237毫升DEPC- H 2 O

存放在RT

苏木精染色液（50毫升）
用12.5 ml乙醇溶解0.1 g 苏木精
用37.5 ml DEPC-H 2 O 溶解0.85 g 十二水合铝硫酸钾铝
然后混合两种解决方案
加入10毫克碘酸钠将苏木精氧化为紫红色后，加入0.5毫升乙酸盐
过滤器使用0.22的溶液微米的膜过滤器。存放在RT
苏木精染色液的浓度可用DEPC-H 2 O 稀释
25 mM dNTP（100 微升）
25 微升100 mM ATP

25 微升100 mM GTP

25 微升100 毫CTP

25 微升100 mM TTP

储存在-20 °C

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

Acknowledg 发言：

这项工作得到了国家自然科学基金（31770927），国家重点研究和发展计划（2017YFA0106800），福建省自然科学基金以及华侨大学科研基金的资助。

参考文献

Banér ，J.，Nilsson，M.，Mendel- Hartvig ，M。和Landegren ，U。（1998）。通过滚环复制进行挂锁探针的信号放大。Nucleic Acids Res 26（22）：5073-5078。
Battich ，N.，Stoeger ，T.和Pelkmans ，L.（2013）。以单分子分辨率在数千个单个人体细胞中基于图像的转录组学。Nat Methods 10（11）：1127-1133。
Crosetto ，N.，Bienko ，M.和van Oudenaarden ，A.（2015）。空间分辨转录组学及其他。Nat Rev Genet 16（1）：57-66。
Femino ，AM，Fay，FS，Fogarty，K。和Singer，RH（1998）。可视化的单RNA转录原位。科学280（5363）：585-590。
姜明，刘丽，洪昌，陈大元，姚X.，陈X.，林昌和Ke R（2019）。用于固定细胞和组织中RNA可视化的单分子显色原位杂交测定。RNA 25（8）：1038-1046。
Larsson，C.，Grundberg ，I.，Soderberg，O.和Nilsson，M.（2010）。单个mRNA分子的原位检测和基因分型。Nat Methods 7（5）：395-397。
Nilsson，M.，Malmgren ，H.，Samiotaki ，M.，Kwiatkowski，M.，Chowdhary，BP和Landegren ，U.（1994）。挂锁探针：环化寡核苷酸以进行局部DNA检测。科学265（5181）：2085-2088。
Shah，S.，Lubeck，E.，Schwarzkopf，M.，He，TF，Greenbaum，A.，Sohn，CH，Lignell ，A.，Choi，HM，Gradinaru ，V.，Pierce，NA和Cai，L. （2016）。通过杂交链反应和组织水凝胶包埋和清除，可在深度检测单分子RNA。发展143（15）：2862-2867。
Wang，F.，Flanagan，J.，Su，N.，Wang，LC，Bui，S.，Nielson，A.，Wu，X.，Vo，HT，Ma，XJ and Luo，Y.（2012）。 RNAscope：用于福尔马林固定，石蜡包埋的组织的新型原位RNA分析平台。分子诊断杂志14（1）：22-29。