试剂与材料

用料
培养皿94 x 16 mm，无菌（Biolab，目录号：020005）
玻璃盖玻片24 x 24毫米（Deltalab ，目录号：D102424）
血清移液管5 ml，10 ml，25 ml（Nunc，目录号：056815、056816、056817 ）
费尽过滤移液管头20 微升，200 微升，1000 微升，无菌（拉bclinics ，产品目录号：LAB20ULFNL，LAB200ULFNL，LAB1000ULFNL ）
70 µm多孔细胞过滤器（Biologix Research Co.，目录号：151070）
24孔多孔板（Nunc，目录号142485）
Falcon，50 ml离心管（Deltalab，Eurotubo ，目录号：DEL429927 ）
猎鹰15毫升离心管（Deltalab，Eurotubo ，目录号：DEL429946 ）
同上I 8 - wel l µ-Slides（Ibidi GmbH，目录号：80826 ）
Transwell聚碳酸酯膜细胞培养插入物，直径6.5 mm，孔径0.4 µm（Corning，目录号：CLS3413）
23 G 1“针（BD Microlance 3，目录号：300800）
一次性1毫升注射器（B-Braun，目录号：9166017V ）
一次性10毫升注射器（Becton Dickonson ，目录号：309110）
细胞培养瓶，过滤帽25 cm 2 （Nunc EasYFlasks ，目录号：156367）
注射器过滤器，孔径为0.22 µm，无菌（Millipore，Millex ，目录号：SLGP033RS）

试剂种类
磷酸盐缓冲液（PBS）粉末，pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：P3813），在室温下保存
乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，pH 8.0，〜0.5 M（Sigma-Aldrich，目录号：03690），在室温下保存
基质胶基底膜基质，无LDEV-（康宁，目录号：354234），保存于- 20 °C
注意：在冰上解冻O / N，并等分0 。到达后，装满5-1 ml的小瓶，以最大程度地减少冷冻和融化周期。

提前的Dulbecco改良培养基（DMEM）/ F12（热˚F isher 小号系统求解，GIBCO，目录号：12634010），存储在2-8 ℃下
GlutaMAX 补充剂，100 x （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：35050038），储存于2-8 °C
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）缓冲溶液，1 M（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15630056），储存在2-8 °C
Normocin （InvivoGen Corporation制，目录号：蚂蚁-NR-2），储存在-20 ℃下
B-27补充剂，不含维生素A，50 x （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12587010），在-20 °C下等分储存
N-2补充剂，100 x （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：17502048 ），在-20 °C下等分储存
N-乙酰基-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165），在-20 °C下等分保存
重组鼠表皮生长因子（EGF）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：PMG8043），分装在-20 °C下
重组人 R-spondin 1（R＆D Systems，货号：4645-RS-250），在-20 °C下等分储存
ř ecombinant鼠头蛋白（派普泰克公司制，目录号：250-38），储存在-20 ℃下等份
Y-27632二氯化物，粉末（Sigma-Aldrich公司，目录号：Y0503 ，- [R econstitute在1mM，在无菌的Milli-Q和s 撕毁在-20 ℃下等份）
CHIR99021（Stemgent ，目录号：04-0004），在-20 °C下分装
丙戊酸钠盐（Sigma-Aldrich公司，目录号：P4543 ，- [R econstitute在1M在无菌的Milli-Q和s 撕毁在-20等分）
TrypLE Express酶，带有酚红，1 x （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12605010 ），在2-8 °C下储存
胎牛血清（FBS），已热灭活（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10500064），储存在-20 °C
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX 补充剂，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：31966021 ），储存在2-8 °C
青霉素-链霉素，在0.9％NaCl中每毫升含10,000单位青霉素和10 mg链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781 ），储存在-20 °C
最低基本培养基非必需氨基酸（MEM-NEA）溶液100 x （Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11140035 ），在2-8 °C下储存
胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C0130），储存在-20 °C
ACK裂解液（Gibco，目录号：A10492-01），存储在RT
乙醇，96％v / v（PanReac Applichem ，目录号：131085），在RT储存
肠类器官生长培养基或ENR_CV培养基（请参见“配方” 部分，表1 ）
肠上皮下肌成纤维细胞消化培养基（参见“配方” 部分，表2 ）
肠上皮下肌成纤维细胞培养基（参见“食谱” 部分，表3 ）
助剂（参见食谱部分，表4 ）
基本介质（请参见“食谱” 部分，表5 ）
70％v / v乙醇（请参阅“配方” 部分，表6 ）

设备

手术镊子（Biolab，目录号s ：711198和711199）
手术刀（至高无上，目录号：PCS23）
手术剪（Biolab，目录号：005064）
37 °C 水浴（Fisher Scientific，Polytest 20）
Milli-Q净水系统（Millipore，Q-POD）
Neubauer计数室（品牌，目录号：718605）
微量移液器（Gilson，型号：P20，P200，P1000）
移液器帮助（Eppendorf，Easypet ）
细胞培养台式离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Allegra X-12R）
37 ℃下加湿的培养箱中5％CO 2 （热科学，免缝-Cult 3141）
层流罩（Telstar，BIO II A）
平台振动器（Heidolph ，型号：Unimax 1010）
孵化台式轨道摇床（Thermo Scientific，4518 S / N 15150-131）
明场显微镜（Nikon，Eclipse Ts2）
带STX3电极的上皮伏特计（World Precision Instruments，EVOM2）
制冰机（苏格兰人，MF56）
参考程序ð 乌尔 Ë

肠隐窝的分离和培养（图1A）
注意：直到在长凳上执行步骤A8为止，然后您可以在层流罩下继续进行操作以利于无菌。

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图1. 体外肠道上皮单层细胞生成的开发方法概述。A.从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 小鼠分离肠隐窝，并在Matrigel滴剂中生长以获得类器官培养物。将类器官分解成隐孢子虫小块或隐孢子虫单细胞，并接种在基质胶包被的标准组织培养板或Transwell插入物上，以获得二维体外肠上皮培养系统。

从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 小鼠收获小肠。
将肠放入装有PBS 的P etri皿中，并用手术镊子，手术刀或手术剪刀将脂肪和肠系膜从组织中清除。
注意：注意不要破裂肠组织。

使用10 ml注射器和23 G 1“针用PBS冲洗小鼠小肠。
使用外科剪刀纵向切开组织。
注意：确保切开组织时，粘膜面朝上。

用玻璃盖玻片仔细刮擦肠粘膜，以机械方式除去绒毛。
注意：注意不要施加太大压力以保存隐窝。

用PBS冲洗3次，然后将肠放入新的P etri皿中。
切割组织成1-4毫米厚的片使用手术剪（小号EE图2）。

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图2 。图片显示使用手术剪刀将肠切开后获得的组织块的外观（大小和形状）。

将碎片转移到层流罩下的无菌50 ml F alcon管中。
加入10 ml冰冷的PBS，并使用10 ml移液器上下吸移5-6次。让碎片沉降并丢弃上清液。
注意：非常重要的一点是PBS必须是冰冷的，并且事先用PBS润湿移液管的内壁。否则，薄纸片可能会粘在移液器上。

加入新鲜的10 ml冰冷的PBS，并重复步骤A 9 10-20次，直到上清液几乎变得澄清为止。
注意：洗涤20次后，上清液可能仍然有点混浊，无论如何都要进行下一步。

加入25 ml在冷PBS中制备的2 mM EDTA，在4 °C 孵育30分钟。在平台振荡器上温育期间，剧烈搅拌F alcon管。
孵育后，使组织碎片沉降到F alcon管的底部，并丢弃上清液。
使用10毫升移液器将10毫升含10％FBS的冰冷PBS加入组织片中。建议用含10％FBS的冰冷PBS润湿移液器的内壁，以免组织碎片粘在移液器上。
使用10 毫升移液器上下吸取3-5次组织碎片。让碎片静置，并通过置于新的50 ml F alcon浴缸e 上方的70 µm孔滤池过滤上清液。洗脱的溶液将对应于第一隐窝洗脱级分。
重复步骤s A13和A14 4-5次，以获得以下隐窝洗脱级分。使用新的70 µm孔细胞过滤器和新的50 ml F alcon管收集随后的隐窝洗脱级分。
移取5 µl每个洗脱级分到P etri皿中，并使用明场显微镜进行分析，以确定每个级分中隐窝的纯度和大小。
注意：通常，第一部分包含很多碎屑和一些绒毛块。建议丢弃这些部分并保留其余部分，这些部分主要以小隐窝块的形式污染（图3）。

池在50毫升的选择的馏分˚F 爱尔康管和离心悬浮液，在55 ×g下于5 分钟，在8 ℃下。
注：在这种情况下在报道˚F igure 3，我们会放弃部分1和游泳池分数小号2,3和4。

重悬轻轻吹打使用P1000微量和冷的1 2-3次含有预解冻基质胶隐窝粒料，000微升移液管尖端。重悬液的体积将取决于合并的洗脱级分的数量，因此取决于所获得沉淀的大小。例如，在所报告的情况下˚F igure 3中，其中我们已轮询馏分2,3和4（图3A）和得到所示细胞的沉淀˚F igure 3B我们将使用500μl的Matrigel中的以重悬沉淀。
注意：使用前将等分试样（1毫升）的基质胶在冰上解冻至少1小时。在方案的此步骤中，您必须始终在冰上工作以防止Matrigel固化。

小心吸取预先加温的24孔板中每孔无气泡的40 µl隐窝基质胶悬浮液。通常，您将获得约15滴。将板放入37 °C的培养箱中5-10分钟，以使Matrigel固化。
注意：播种前，将24孔板置于37 °C 的培养箱中10分钟。这有助于液滴正确形成。

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图3. 不同隐窝级分的洗脱过程。一。明视野显微镜照片显示了给定肠隐窝分离物的4种不同的隐窝洗脱部分。比例尺：100 µm。B. 示出了从汇聚隐窝获得的细胞沉淀图像洗脱的级分小号2 + 3 + 中所示的隔离的4 ˚F igure 3A。

在Matrigel固化后，向每个孔中加入400 µl预热的肠道类器官生长培养基（表1），然后将它们转移回含5％CO 2 的37 °C 湿润培养箱中。
添加额外的ENR-CV因子（相同浓度的我Ñ 表1）每隔一天，在当前的培养基中，在培养的第一天4-5和Rho每天激酶抑制剂（Y-27632）（10μM）在第4天，以避免上皮细胞死亡的失巢凋亡。每2-3天更换一次整个培养基。或者，每隔一天添加100 µl新鲜介质，直到类器官通过为止。
注意：通常，在培养2-3天后，隐窝会开始萌芽（图4）。培养一周后，传出的隐窝变长。如果隐窝汇合度很高，则需要较早的传出隐窝通过以形成适当的类器官。通常，在原始液滴中，每个液滴我们会获得约100-125个类器官。

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图4.明场显微镜图像显示新鲜分离的肠隐窝随时间（最多3天）的生长和出芽。请注意，分离后，肠隐窝开始在培养中发芽2-3天。比例尺：100 µm。

类器官形成后传递隐窝
实验前至少1小时解冻Matrigel，将等分试样放在冰上。
在37 °C下准备并预热类器官生长培养基（表1）和24孔板。
除去从含有完全成熟的类器官孔中的类器官的生长培养基（见˚F igure 5，左图）加300微升的TrypLE 快递1 X 到每个孔中，轻轻地分离并破坏基质胶滴刮它关闭使用P1000微量。该步骤在RT执行。
注意小号：

你可以用300 微升的TrypLE 快递1 X 卷恢复从组织体2滴。
在此步骤中，将使用TrypLE Express 1 x 获得大小更均一的隐窝，并有利于Matrigel消化。
将Matrigel悬浮液转移到已经置于冰上的15 ml Falcon管中。
使悬浮液通过带有23 G 1“针的1 ml注射器3-4次，以进一步机械破坏类器官。该步骤在冰上进行。
注：的次数，你通过注射器通过样品和应用的力将依赖于完全成熟的组织体溜溜的大小ü 打算打破。请注意，过分温和的程序不会破坏类器官，太苛刻会过度消化隐窝。

每300μl悬浮液中加入1 ml PBS中的2％FBS，并手动搅动试管以充分混合内容物。
注意：如果需要进一步清洗，可以重复此步骤。

在8 °C下以72 xg离心3分钟。
除去所有上清液，然后使用微量移液器轻轻移液，将沉淀重悬于新鲜的Matrigel中。重悬液的量将取决于被消化的初始液滴的数量。
注意：分割比例通常为1：4 ：1：5。

如前所述，将预先准备好的24孔板中的含有隐窝液滴（40 µl /滴）的Matrigel板。
通过在37 °C 下孵育5-10分钟来聚合Matrigel 。
向每个孔中添加400 µl 肠类器官生长培养基（表1），并将板转移回含5％CO 2 的37 °C 湿润培养箱中。
注意：请参阅˚F igure 5（中图）为新鲜分离肠类器官衍生的隐窝的代表性明视野显微镜图像。

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图5. 在基质胶滴中生长的完整的肠类器官（左图），新鲜解离的肠类器官隐窝（中间图）和新鲜消化的肠类器官衍生的单细胞（右图）的代表性明场显微镜图像。插图显示相应图像的放大倍数。请注意，由于3D文化，并非所有的细胞结构都在同一焦点。比例尺：100 µm，50 µm（插图）。

制备基质胶涂层的基材
放置ibidi 8 - 以及μ-幻灯片或Transwell小室和P20微量提示到冷冻预先。
注意：此步骤对于获得均质的Matrigel涂层尤为重要。

在实验前至少1小时解冻基质胶，将等分试样放在冰上。
将预冷的ibidi 板放在冰上。使用P20微量移液器和预冷的微量移液器在每个ibidi 平板孔或每个Transwell插入物中移液10 µl Matrigel 。确保将10μl基质胶在整个基片表面通过移动吸移管吨均匀地铺展IP同时释放基质胶（小号EE视频1）。
注意：去除多余的基质胶，该基质在Transwell插入件边界处积聚。

视频1.制备基质胶涂层的基材

对所有需要的孔和插入物重复步骤C3。
注意：对于均匀涂层，应尽快执行步骤C3和C4。

将板或插入板在培养箱中于37°C孵育1h，以聚合Matrigel。
继续播种（请参阅以下过程D）。

器官样肠上皮单层的生成
肠类器官衍生的隐窝种子（图1B）
如步骤B1-B6所述，消化类器官以获得具有均一大小的隐窝。
注：参见˚F igure 5（中图）为新鲜分离肠类器官衍生的隐窝的代表性明视野显微镜图像。

充分混合含有消化过的类器官悬浮液的F alcon，使用P20微量移液器将5 µl样品取3倍，然后将其放入P etri皿中。
使用明场显微镜对5 µl体积内的隐窝块数进行计数并取平均值，然后根据该值估算悬浮液中隐窝块的总数。
离心，在4°C下以72 xg离心3分钟收集隐窝碎片。
将沉淀重悬在肠道类器官生长培养基中（配方1）。计算出所需的1的接种密度总培养基体积，500隐窝/厘米2 。
注意：

一口ibidi 8孔µ-Slides 的表面积为1 cm 2 。然后，接种密度为1 ，500隐窝/样品。
为了参考的目的，从一个完全成熟的类器官的Matrigel下降（图5，左图），我们得到的大约为1 ，000-1 ，500个隐窝。
吸取30-50 µl隐窝悬浮液到Matrigel 包被的ibidi 8孔µ-Slides的每个孔中（请参阅过程C）。尝试将样品作为液滴放在孔的中心。
让隐窝附着在基质上3-4小时，然后再添加200 µl肠道类器官介质（表1）。
每隔一天更换一次介质。
使用明场显微镜检查整个培养时间内的单层形成和生长。播种后，类器官衍生的隐窝将迅速自身重折叠，形成包含Lgr5 + 肠干细胞（GFP + ）的隐窝样结构域。然后，将细胞散布在基板上并迁移的隐窝样结构域时，形成于GFP组成上皮单层- 细胞，其对应于绒毛形区（图6A）。
肠道类器官来源的d单细胞接种（图1 C）
遵循步骤B1-B4中所述的类器官消化协议。
将悬浮液通过带有23 G 1英寸针头的1 ml注射器5-6次，然后在37 °C下孵育5分钟。每分钟搅动细胞悬液以充分破坏细胞聚集。孵育5分钟后，将样品放在冰上，用移液管吸取5 µl消化物在P etri皿上，并在显微镜下检查样品。如果仍然观察到细胞聚集，则将孵育时间（37°C）增加更多的时间（最多8分钟）。
注：参见˚F igure 5（右图）对新鲜消化肠类器官衍生的单细胞的代表性亮视野显微镜图像。

一旦达到单细胞悬液，就将试管放在冰上，每300 µl悬液添加1 ml PBS和2％FBS，并手动搅动试管以充分混合内容物。
注：牛逼他的脚步可能在重复的情况下，需要进一步清洗。

使用Neubauer计数室对悬浮液中的细胞数进行计数。
在4°C下以110 xg离心4分钟。
将沉淀重悬于类器官生长培养基中（表1）。计算播种密度为10 5 细胞/ cm 2 所需的总培养基体积。
注意小号：

一口ibidi 8孔µ-Slides 的表面积为1 cm 2 。然后，接种密度为10 5个细胞/样品。
为了参考的目的，从一个完全成熟的类器官的Matrigel下降（图5，左图），我们获得的大约1.5 X 10 5 - 1.7 X 10 5 单细胞。
种子的基质胶包被的ibidi 8孔μ-幻灯片（见方法C）与1 0-20 微升单细胞悬液。
注意：将单细胞悬液滴入孔的中心，注意不要破坏它。

让细胞贴壁1小时，再添加200 µl最终肠溶性类器官培养基（表1）和Rho激酶抑制剂Y-27632。
每隔一天更换一次介质。
使用明场显微镜检查单层的形成和生长。播种后，类器官自发自组装形成包含Lgr5 + ISC的隐窝样结构域，紧密模仿隐窝碱基的体内排列。然后，细胞开始扩散，生成由GFP组成的上皮单层- 产生绒毛状区域（图6B）。
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图6. 干细胞在隐窝状结构域中自组装并起源于上皮单层。（A）重叠的亮场和GFP信号的实时成像序列，分别对应于从类器官衍生的隐窝播种后60小时和（B）在类基质胶薄膜上播种类器官衍生的单细胞后96小时。每个快照的相应时间显示在每个面板中。白色箭头指示Lgr5-GFP + 细胞。比例尺：50 µm（A，上排）和100 µm（A，下排和B）。该图改编自原始出版物（Altay 等人，2019，《知识共享署名4.0国际许可》，http：//creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。

肠上皮下肌成纤维细胞的分离和培养
收集步骤A15中描述的隐窝消化和洗脱留下的组织。
在PBS中加入10 ml的3 mM EDTA，并在37°C和200 rpm的孵育台式台式振荡器中孵育10分钟。
注意：将EDTA溶液预热至37°C。

孵育后，让碎片静置并丢弃上清液。重复步骤E2两次。
丢弃上清液，并用20 ml PBS冲洗沉淀。重复此步骤2次以上。
注：牛逼他一步重要的是要消除所有EDTA。

丢弃上清液，并添加肠上皮肌成纤维细胞消化培养基（表2）。
在37°C和200 rpm的台式台式振荡器中孵育40分钟。
孵育后，用10 ml移液器在1分钟内上下吸移悬浮液。
以160 xg离心5分钟。
用10 ml ACK裂解缓冲液（在47°C下预热）重悬沉淀。
以160 xg离心5分钟。
用10 ml肠上皮肌成纤维细胞培养基（表3）重悬沉淀，并在25 cm 2 细胞培养瓶中培养。
注意：组织碎片最终会附着在烧瓶上，成肌纤维细胞会长出并扩散穿过烧瓶。每3-4天更换一次介质。通常，隔离烧瓶后2-3周将汇合。图7显示了该过程的代表性明场显微图像。

通过正常的胰蛋白酶消化使细胞传代5分钟。分配比例为1：3。

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图7. 接种后第9天（左图）和第19天（右图）组织培养瓶上ISEMF生长的代表性明场显微图像。请注意，消化后的组织碎片会附着在塑料上，并且新出现的成纤维细胞会通过烧瓶扩散，直到达到汇合为止。此过程可能需要21天。比例尺：200 µm。

肠上皮下肌成纤维细胞条件培养基（ISEMF_CM）的生产
在不改变培养基的情况下，将60-80％融合的ISEMF培养物培养4-6天（图8）。
收集培养基并将其以160 x g 离心5分钟以除去碎屑。
注意：将新鲜的肠上皮肌成纤维细胞培养基（表3）添加到平板中，然后继续培养。如果需要，通过细胞（步骤E12）。

收集上清液，并使用0.22 µm孔径的过滤器和10 ml注射器过滤。
过滤后的ISEMF_CM储存在-80°C直至使用。
重复步骤F1-F4，直到细胞衰老（通常在5-6代后）。
汇总从相同ISEMF隔离物中收集的所有ISEMF_CM馏分，并按照表4 中所述制备增强培养基。

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图8. 明场显微镜图像显示了分裂后6天内ISEMF的生长。在此期间，当ISEMF汇合率为60％到80％左右时，将收集ISEMF_CM。

通过跨上皮电阻（TEER）测量评估上皮单层形成和屏障完整性
按照程序C中的说明制备基质胶包被的Transwell 插入物。
遵循步骤D1a中描述的步骤，直到步骤D1d将类器官分解为隐窝。
将沉淀重悬于碱性培养基中（表5）。计算出所需的为3的接种密度总培养基体积，000-3 ，500隐窝/厘米2 。
注意小号：

一个直径为6.5 mm的Transwell插件的表面积为0.33 cm 2 。
为了参考的目的，从一个完全成熟的类器官的Matrigel下降（图5，左图），我们得到的大约为1 ，000-1 ，500个隐窝。
用30-50 µl隐窝悬浮液播种每个Matrigel包被的Transwell插入物。
注意：保留2-3个Matrigel涂层的Transwell插入物，无种子，作为TEER测量的对照。

让隐窝附着1-2小时，并在Transwell的顶端（上方）再添加200 µl碱性培养基（表5）。
准备加强培养基（表4），并向Transwell的基底外侧（底部）添加500 µl。
也将相应的培养基添加到控件（无单元格）插入中。
将培养皿置于含5％CO 2 的37°C湿润培养箱中，隔天更换一次顶侧和基底外侧的培养基。
更换培养基后，将板在通风橱中于室温下放置5-10分钟，以使培养基温度达到平衡。
同时，将EVOM2上皮伏特计STX3电极浸入70％乙醇（表6）中15分钟，以对其进行灭菌。
用PBS冲洗电极，并将其保持在溶液中，直到开始测量为止。
打开电压表，插入电极，将其中一个插入顶端，将另一个插入Transwell的基底外侧。记录测量值。
取下电极，然后重新插入以再次测量。再重复一次此步骤，即可从同一样品中获得3种不同的测量值。
通过浸入PBS，然后浸入碱性介质中，在两次测量之间清洗电极。
完成测量后，将电极浸入70％乙醇中15分钟以对电极进行灭菌。用无菌Milli-Q冲洗它们，让它们在细胞培养罩下风干并保存。
每2天（最多培养20天）测量单层的TEER。
通过从测量的总电阻（带有细胞的样品）中减去固有电阻（在没有细胞的对照样品上测得的值）并校正表面积（0.33 cm 2 ），以ohm · cm 2 来计算对应于上皮单层的电阻。
注意：作为参考，培养20天后，TEER值逐渐增加到大约60 ohms·cm 2 。

数据分析

为了进行统计比较，我们使用了两尾不等方差t检验，并且我们认为P <0.05是显着的。我们在至少三个独立的实验中重复了单层形成方案。我们进行了三个独立的实验，每个实验每个条件有两个技术复制品用于TEER测量。可以在原始文章的材料和方法以及补充信息部分中找到进行的数据分析的详细说明（Altay 等人，2019）。

配方小号

肠类器官生长培养基或ENR_CV培养基

表1. 肠类器官生长培养基或ENR_CV培养基配方的成分清单。标明了原料和最终浓度，以及使用的溶剂（需要时）。显示了最终成分为20 ml的培养基中每种成分的体积（在原液浓度下）。

试剂

库存浓度

储备溶剂

对于20米升的最终体积（立即使用）

最终浓度

谷氨酰胺

100 x

200 微升

1％v / v

HEPES

1 M

200 微升

1％v / v（10 毫米）

诺莫霉素

50毫克/米升

40 微升

100微克/米升

B-27

50 x

400 微升

2％v / v

N-2

100 x

200 微升

1％v / v

N-乙酰-L-半胱氨酸

500毫米

Milli-Q

50 微升

1.25毫米

先进的DMEM / F12

18 ，910μ 升

生长因子

100微克/米升

PBS

20 微升

100毫微克/米升

ñ oggin

100微克/米升

PBS

20 微升

100毫微克/米升

R - S 池塘1

100微克/米升

PBS

40 微升

200毫微克/米升

ç HIR99021

10毫米

二甲基亚砜

6 微升

3微米

V alproic酸

1 M

Milli-Q

20 微升

1毫米

如果没有新鲜制备，则该培养基（不添加ENR_CV）可以在2-8 °C 下保存2周。必须在使用前添加ENR_CV。

肠上皮下肌成纤维细胞消化培养基

表2. 肠上皮下肌成纤维细胞消化培养基配方的成分清单。标明了原料和最终浓度，以及使用的溶剂（需要时）。显示了最终成分为20 ml的培养基中每种成分的体积（在原液浓度下）。

试剂

库存浓度

储备溶剂

对于20米升的最终体积（立即使用）

最终浓度

胎牛血清

4 ，000μ 升

20％v / v

胶原酶

100毫克/毫升

PBS

75 μ 升

0.37毫克/毫升（100 U /毫升）

记忆体

16 ，000μ 升

在使用培养基之前添加酶。

肠上皮下肌成纤维细胞培养基

表3. 肠上皮下肌成纤维细胞培养基配方的成分清单。标明了原料和最终浓度，以及使用的溶剂（需要时）。显示了最终成分为20 ml的培养基中每种成分的体积（在原液浓度下）。

试剂

库存浓度

对于20米升的最终体积（存储在2-8 ℃下最多2周）

最终浓度

胎牛血清

2 ，000μ 升

10％v / v

青霉素链霉素

100 x

200 微升

1％v / v

MEM-NEA

100 x

200 微升

1％v / v

诺莫霉素

50毫克/米升

40 微升

100微克/米升

记忆体

17 ，560μ 升

助剂

表4. 加强培养基配方的成分清单。标明了原料和最终浓度，以及使用的溶剂（需要时）。显示了最终成分为20 ml的培养基中每种成分的体积（在原液浓度下）。

试剂

库存浓度

储备溶剂

对于20米升的最终体积（立即使用）

最终浓度

谷氨酰胺

100 x

200 微升

1％v / v

HEPES

1 M

200 微升

1％v / v（10 毫米）

诺莫霉素

50毫克/米升

40 微升

100微克/米升

B-27

50 x

400 微升

2％v / v

N-2

100 x

200 微升

1％v / v

N-乙酰-L-半胱氨酸

500毫米

Milli-Q

50 微升

1.25毫米

ISEMF_CM

18 ，910μ 升

生长因子

100微克/米升

PBS

20 微升

100毫微克/米升

ñ oggin

100微克/米升

PBS

20 微升

100毫微克/米升

R - S 池塘1

100微克/米升

PBS

40 微升

200毫微克/米升

ç HIR99021

10毫米

二甲基亚砜

6 微升

3微米

V alproic酸

1 M

Milli-Q

20 微升

1毫米

Wnt3a

100微克/米升

Milli-Q

5 微升

25纳克/立方米升

如果未新鲜制备，则该培养基（不添加ENR_CV 和Wnt3a 因子）可以在2-8 °C 下保存2周。必须在使用前添加ENR_CV和Wnt3a因子。

基本中等

表5. 基本介质配方的成分列表。标明了原料和最终浓度，以及使用的溶剂（需要时）。显示了最终成分为20 ml的培养基中每种成分的体积（在原液浓度下）。

试剂

库存浓度

储备溶剂

对于20米升的最终体积（存储在2-8 ℃下最多2周）

最终浓度

谷氨酰胺

100 x

200 微升

1％v / v

HEPES

1 M

200 微升

1％v / v（10 毫米）

诺莫霉素

50毫克/米升

40 微升

100微克/米升

B-27

50 x

400 微升

2％v / v

N-2

100 x

200 微升

1％v / v

N-乙酰-L-半胱氨酸

500毫米

Milli-Q

50 微升

1.25毫米

先进的DMEM / F12

18 ，910μ 升

70％v / v乙醇

表6. 制备70％v / v乙醇的成分清单。显示了每种成分的体积（原液浓度），最终体积为1L 。

试剂

库存浓度

最终体积为1 L（存放于RT）

最终浓度

乙醇

96％v / v

230百万升

70％v / v

Milli-Q

770百万升

致谢

这个项目的资金是由欧盟的展望2020 ERC资助协议没有提供647863 （COMIET），该CERCA 计划/ Generalitat 德加泰罗尼亚（2017年-SGR-1079），和经济的西班牙外交部和竞争力（TEC2017-83716-C2- 1-R和Severo Ochoa 高级研究中心计划2016-2019）。作者非常感谢通讯社德因管理所D'Ajuts Universitaris 我去Recerca （AGAUR）为资金Gizem 通过FI-DGR 2014年阿勒泰这里的结果只反映作者的看法; 欧盟委员会对其所含信息的任何使用概不负责。该协议改编自Altay 等人的方法。，2019年。我们衷心感谢IBEC传播部门的工作人员在视频录制和编辑方面的协助。

Ç Ò 米p é 吨我纳克利益

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。

伦理

所有涉及小鼠的实验方案均已获得巴塞罗那科学园动物保护和使用委员会（CEEA-PCB）和加泰罗尼亚政府的批准，并根据其相关指南和规定执行。实验项目的批准ID：9162，有效期：12 / 2018- 12/2023。

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