材料和试剂

白色多孔板（SUMILON ，目录号：MS-8096W）
P ipette提示（Gilson）将
铝箔
1.5 ml Eppendorf管
撒布机（Sarstedt ，目录号：86.1569.005）
培养皿（IWAKI ，目录号：SH90-15E）
谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合的VCP及其缺失突变体位于pGEX-2T载体质粒DNA中（庆应义University大学的Masaya Imoto 博士和Etsu Tashiro的礼物（Sasazawa 等人，2012 ）。缺少D2结构域的截短的突变体VCP的构建是我们自己构建的（Suvarna et al 。，2019）。
BL21 Star（DE3）感受态大肠杆菌细胞（Thermo Fisher Sientific ，目录号：C6010-03）
乙二胺四乙酸（EDTA）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：345-01865，CAS 号：6381-92-6）
ATP（GE Healthcare，目录号：27-2056-01，CAS 号：56-65-5）
MgCl 2 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：136-03995，CAS 号：7786-30-3）
MgSO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：137-12335，CAS 号：7487-88-9）
ģ lucose（FUJIFILM和光纯药，目录号码：049-31165，CAS 号：50-99-7）
Tris （S Sigma -Aldrich，目录号：252859，CAS 号：77-86-1）
NaCl （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：191-01665 ，CAS 号：7647-14-5）
3-[（3-氯氨基丙基）二甲基铵] -1-丙烷磺酸水合物（CHAPS）（S igma -Aldrich ，目录号：C3023，CAS 号：33171745-4 ）
KCl （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：163-03545 ，CAS 号：7447-40-7 ）
的Na 2 HPO 4 （FUJIFILM和光纯药，Ç atalog 号码：196-02835 ，CAS 号：10039- 32-4 ）
KH 2 PO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：169-04245 ，CAS 号：7778-77-0 ）
胰蛋白胨（Becton Dickinson公司，目录Ñ 棕土：211701）
酵母提取物（Becton Dickinson ，目录号：212750）
琼脂粉（Becton Dickinson ，目录号：156783）
Milli-Q水（密理博的MilliQ Q-POD 生产的纯净水）
氨苄青霉素（S Sigma -Aldrich ，目录号：A0166，CAS 号：69-52-3 ）
蛋白酶抑制剂片（ROCHE cOmplete ，目录号：4693159001）
异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG ）（Sigma- A ldrich ，目录号：10724815001，CAS 号：367-93-1 ）
谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（GE Healthcare ，目录号：17075605）
还原型谷胱甘肽（S igma -Aldrich ，目录号：G4251，CAS 号：70-18-8 ）
纯化柱（Econo 柱，B io -R ad ，目录号：7371512）
N，N'-二苄基喹唑啉-2,4-二胺（DBeQ ; VCP的ATPase活性的已知抑制物; S Sigma -Aldrich ，目录号：SML0031，CAS 号：177355-84-9 ）
Kinase Glo Plus试剂（Promega ，目录号：V3771 ，参考文献8 ）
分析缓冲液（1x；请参见配方）
ATP解决方案（请参阅食谱）
Kinase- glo 试剂（请参见配方）
DBeQ 解决方案（请参阅食谱）
LB琼脂（250毫升）（请参阅食谱）
细胞裂解缓冲液（请参阅食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 10x; 1 L;参见食谱）
超最佳肉汤（SOC）（请参阅食谱）

设备

多通道移液器（Gilson）
烧瓶（500毫升玻璃锥形烧瓶）
pH计（HORIBA ，型号：D-21）
酶标仪（Thermo Fisher Scientific，VarioSkan Lux）
超声波仪（Tomy ，型号：UR-20P）
Vortex（科学工业公司，Genie 2 ）
用于15/50 ml和Eppendorf管的标准冷冻离心机（Tomy ，型号MX-301 ）
加热块（Scinics ，型号：ALB-121）
平板培养用空气培养箱（EYELA ，型号：MTI-203）
水浴（EYELA ，型号：NTT）
摇床（TAITEC ，型号：BR-15）

软件

R（R统计计算基金会；https：//www.r-project.org）

程序

表达和purificatio 的n个GST- VCP融合蛋白
GST融合的VCP和GST融合的VCP缺失突变体的表达
转型

在冰上解冻感受态大肠杆菌BL21星（DE3）细胞。
在1.5 ml Eppendorf管中取50 µl感受态细胞。
向感受态细胞中加入5 ng（2 µl）的质粒DNA。轻弹试管4至5次以轻轻混合，以混合细胞和DNA。不要涡旋。
将混合物在冰上放置30分钟。不要混在一起。
使用水浴在42°C下热冲击45 s。不要混在一起。
放在冰上2分钟。
向试管中加入500 µl SOC（预热至37°C）。混合。
将细胞在37°C下放置45-60 分钟，以表达Ampr 基因。
在平板培养箱中将含有100 µg / ml氨苄青霉素的LB琼脂平板加热至37°C。
扩展50 - 100微升细胞混合物的到琼脂平板上。
在37°C下孵育过夜。

蛋白质的诱导表达

收集一个分离的菌落，并在含有100 µg / ml 氨苄青霉素的5 ml LB培养基中进行预培养（在37°C，180 rpm下15 h）。
备好甘油储备液（500 µl肉汤和500 µl高压灭菌的40％甘油）以备后用，并储存在-80°C下（如果需要，可将来使用）。
次日加入1ml预培养物在含有100ml的LB培养基中100μg/ ml的氨苄青霉素的，并在37℃下生长为180rpm，直到OD为0.6 （˚F 拉斯克应仅被填充到其容量的20〜30％）。
最初在2小时后检查OD，然后每1小时检查一次。
在OD 0.6下，将烧瓶在冰上冷却。
诱导前取1 ml样品。在10,000 xg下于4°C 离心15分钟。用液氮速冻后，用1x PBS洗涤沉淀并在-80°C下储存。（将此样品用作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析的“诱导运行前”）。
为了进行诱导，将0.4 mM IPTG加入烧瓶中，并使细菌在20°C下以180 rpm的速度生长15 h。
取1 ml培养物，在10,000 xg下于4°C 离心15分钟，弃去上清液，用1x PBS洗涤剩余的细胞沉淀，用液氮速冻，并在
-80°C下保存，作为“诱导后”的样品”。在10,000 xg下于4°C 离心剩余的诱导细菌培养物15分钟。
用10 ml 1x PBS洗涤沉淀。在4°C下以10,000 xg 再次离心15分钟。（如果不立即使用，可以将细胞沉淀物快速冷冻并保存在-80°C下）。
向细胞沉淀中加入10 ml细胞裂解缓冲液。
涡旋使其获得透明的细胞悬浮液。
使用脉冲超声仪超声处理3分钟（5 s脉冲，中断10 s）。
在4°C下以10,000 xg 再次离心20分钟。
使用上清液进行纯化。
GST融合的VCP蛋白的纯化
注意：在4°C下执行所有步骤。

加入500 微升 50％的谷胱甘肽琼脂糖4B浆料树脂到柱（柱大小18ml）中。（500 µl的50％谷胱甘肽琼脂糖浆将产生250 µl床体积。）
用10 ml 1x PBS 彻底清洗谷胱甘肽琼脂糖3次，以除去乙醇存储溶液。
加载10毫升从先前的上清液小号TEP A1N 到平衡的谷胱甘肽琼脂糖柱GE ntly。允许柱到漏极（ç 如果需要的话用于SDS分析这里ollect 50微升样品）。
用10 ml 1x PBS洗涤三次。
用0.5 ml洗脱缓冲液洗脱蛋白质。重复此步骤3次，并收集至少3个洗脱样品。
使用二辛可宁酸（BCA）试剂估算纯化蛋白的量，并在SDS-PAGE （10％丙烯酰胺）上运行样品以检查级分的纯度。

使用纯化的VCP蛋白进行ATP水解反应
在开始反应之前，将纯化和等分的VCP蛋白，Kinase-Glo Plus试剂和ATP在冰上解冻。其他试剂（例如缓冲液）应允许达到室温。反应中使用的纯化蛋白，ATP和抑制剂的量可能会有所不同，应根据需要进行标准化。

准备并标记96孔实心白色多孔板。使用多通道移液器将20 µl测定缓冲液（2.5x）分配至每个孔护理液。
向每个孔中加入10 µl所需浓度的纯化VCP蛋白或洗脱缓冲液（空白）。
加入10 µl测试化合物或二甲基每孔加入亚砜（DMSO）或DBeQ （阳性对照）。
在室温下孵育60分钟。
向溶液中加入10 µl 0.5 µM ATP，混合。
在室温下孵育60分钟。
通过在每个孔中添加10 µl Kinase-Glo Plus试剂来测量反应后ATP的剩余量。
在黑暗中于室温下孵育10分钟。该板应保存在黑暗的房间中或用铝箔覆盖以防光线照射。
使用微板读取器以发光模式（1 s）读取发光。
从空白反应的值（不含ATPase）中减去获得的值，以计算消耗的ATP量，这表明反应的ATPase活性（图1）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-30 \ 1902812--1284 Nobumoto Watanabe 744899 \ Fig jpg \ Fig 1.jpg

图1. NPD8733对VCP ATPase活性的影响。A.使用SDS PAGE和CBB染色分析纯化的GST-VCP（完整）及其截短的突变体（S459 *； Ser 459更改为终止密码子）蛋白（每种6 µg ）。B和C.在NPD8733或N ，N'- 二苄基喹唑啉-2,4-二胺（DBeQ ）的存在下，以图中所示的浓度测量纯化的Full和S459 *蛋白的ATPase活性。将红色圆点表示各个测量。

数据分析

测定的一个例子与纯化酶的SDS-PAGE一起显示在图1中。B中的值表示全长VCP的ATPase活性，而C中的值表示VCP的D1域的ATPase活性，因为截短的VCP突变体仅包含D1域。由于NPD8733不会显着影响全长或截短的VCP的活性，因此我们得出结论，它与VCP的D1结构域结合而不影响其ATPase活性，而DBeQ 抑制了VCP的D1和D2结构域的ATPase活性。实验一式三份，并使用R进行统计分析。对数据（补充文件：R脚本）进行单向方差分析，并使用R中的ANOVA和Tukey HSD函数对Tukey的诚实显着性差异进行事后检验。，分别。

菜谱

测定缓冲液（1x）
准备1x分析缓冲液
50 mM Tris（pH 7.4）

20毫米MgCl 2

1毫米EDTA

仅使用MiiliQ 水进行缓冲液制备
储存在4℃。使用前先温热至室温
ATP溶液
在200 mM Tris碱（pH 7.4）中准备100 mM A TP
分装并储存ATP储备液于-20°C
不要冻结解冻，因为ATP会随着时间分解
用MilliQ 水稀释
激酶-Glo试剂
使用前在室温下平衡缓冲液和底物
将整个缓冲液转移到装有冻干荧光素酶底物的琥珀色瓶中
轻轻涡旋或涡旋混合
Kinase-Glo试剂应新鲜使用或分装并保存在-20°C
DBeQ 解决方案
预削减10 毫DBeQ 使用DMSO储备溶液
分配到几种液体中并储存在-20 °C
LB琼脂（250毫升）
2.5克胰蛋白Try

1.25克酵母提取物

2.5克氯化钠

3.75克琼脂

细胞裂解缓冲液
150毫米氯化钠

5毫米EDTA

50 mM Tris pH 7.5

0.5％CHAPS

蛋白酶/磷酸酶抑制剂（一dded新鲜）

洗脱缓冲液
50 mM Tris pH 8.0

20 mM还原型谷胱甘肽

准备新鲜LY

磷酸盐缓冲盐水（PBS 10 x）（1 L）
80克氯化钠

2克氯化钾

14.4克Na 2 HPO 4

2.4克KH 2 PO 4

pH值7.5

SOC（200毫升）
4克胰蛋白Try

1 克酵母提取物

0.1 克氯化钠

37.2毫克氯化钾

一个utocrave

1毫升1 M氯化镁2

1毫升1M硫酸镁4

2毫升1 M葡萄糖

在-20存储℃下等分后

致谢

我们感谢Masaya Imoto 博士和Etsu Tashiro 博士（日本庆应义Science大学科学技术学院）提供VCP表达载体。我们感谢RIKEN NPDepo 的成员提供了化学文库，感谢Na oki Kato 博士（RIKEN）进行的讨论，感谢Harumi Aono （RIKEN）和Emiko Sanada （RIKEN）在研究过程中提供的持续技术帮助。这项研究得到了JSPS KAKENHI（授权号JP16H06276，JP17H0641 2，JP17K07783，JP18H05503，JP18K05366，JP18H02555，JP19H05302）和AMED（授权号JP19cm0106112）的部分资助。该协议改编自先前描述的工作（Sasazawa 等，2012）。

利益争夺

作者没有竞争利益可言。

参考文献

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