材料和试剂

娜维斯E1和消耗材料
P ipette提示
培养皿，100毫米（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
1.5 ml离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-682-550）
15 ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-527-90）
50 ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-565-270）
泊尔® PES 米embrane d ISC ˚F ilters（Pall公司，目录号：60110）

生物材料
pAM1956，是鱼腥藻中的复制载体（Yoon和Golden，1998年）（Addgene ，质粒号：40251）
注意：pAM1956的图谱可在Addgene 上找到；https://www.addgene.org/40251/。

pAM1956-P psbA1 （对照质粒，可应要求提供）
pRL443（Elhai 等，1997）（Addgene ，质粒号：70261）
pRL623 （Elhai et al。，1997）（Addgene ，质粒编号：58494）
Anabaena P CC 7120（可从法国巴黎巴斯德研究所的巴斯德文化收藏（PCC）获得）
大肠杆菌DH5α：F - 的recA 41 恩达1 的gyrA 96 THI -1 HSD R17（RK - MK - ）SUPE 44 RELA λ Δ LACU 169（GIBCO-BRL）
大肠杆菌HB101：˚F - MCRB MRR hsdS20 （rB中- 的mB - ）recA13 leuB6 ARA-14 proA2 lacY1的galK2 XYL-5 MTL-1 rpsL20 （钐- [R ）glnV44 λ- （Promega公司，目录号：L2015）
大肠杆菌HB101-R2：携带pRL623（编码甲基化酶）和pRL443（接合质粒）的供体菌株（Elhai 等，1997; Banerjee 等，2012）

用于制备介质的化学品
MgSO 4 · 7H 2 O （Sigma - Aldrich，目录号：63138）
CaCl 2 · 2H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：C1016）
柠檬酸（Sig ma - Aldrich，目录号：251275）
柠檬酸铁铵（Sigma - Aldrich，目录号：RES20400-A7）
Na 2 -EDTA（Sigma - Aldrich，产品目录号：E5134）
Na 2 CO 3 （Sigma - Aldrich，目录号：1613757）
H 3 BO 3 （Sigma - Aldrich，目录号：B6768）
Mn 2 Cl 2 · 4H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：1375127）
ZnSO 4 · 7H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：1.08881）
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：M1003）
CuSO 4 · 5H 2 O （Sigma - Aldrich，目录号：C8027）
CoCl 2 · 6H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：1.02539）
NaNO 3 （Sigma - Aldrich，目录号：S5506）
NaHCO 3 （Sigma - Aldrich，目录号：S5761）
K 2 HPO 4 （Sigma - Aldrich，目录号：1551128）
NaCl （Sigma - Aldrich，目录号：63138）
胰蛋白（（酪蛋白水解产物）（Sigma - Aldrich，目录号：22090）
酵母提取物（Sigma - Aldrich，目录号：Y1625）
琼脂（f 或E. coli ）（Sigma - Aldrich，目录号：A1296）
细菌用琼脂（˚F 或鱼腥）（BD Diagonistics ，目录号：90000-767）
Co（NO 3 ）2 · 6H 2 O（Sigma - Aldrich，目录号：239267 ）
五水硫代硫酸钠（Sigma - Aldrich，目录号：217247）
BG11中号（请参阅食谱）
BG11琼脂板（请参阅食谱）
1 M TES（请参阅食谱）

分子生物学试剂
氨苄西林钠盐（Sigma - Aldrich，目录号：A9393）
氯霉素（Sigma - Aldrich，目录号：C0378）
硫酸卡那霉素（Sigma - Aldrich，目录号：60615）
新霉素三硫酸盐（Sigma - Aldrich，目录号：N1876）
向导® SV凝胶和PCR净化系统（Promega公司，目录号：A9281）
QIAGEN质粒迷你试剂盒（100）（Qiagen，目录号：A9281）
琼脂糖（Sigma - Aldrich，目录号：A9539）
Cfr9I位（XmaI位）（10U / μ 升）（赛默飞世尔科技，产品目录号：ER0171）
逆转录酶（Roche Diagnostics GmbH，目录号：38823100）
Ambion TM DNase I（无RNA酶）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2222）
吉布森装配预混料（NEB，目录号：E2611L）
苯酚（Sigma - Aldrich，目录号：P1037）
甘油（Sigma - Aldrich，目录号：G5516）
8-羟基喹啉（Sigma - Aldrich，目录号：252565）
Na 2 -EDTA （Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
醋酸钠（Sigma - Aldrich，目录号：S2889）
硫氰酸胍（Sigma - Aldrich，目录号：G9277）
盐酸胍（Sigma - Aldrich，目录号：G3272）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：X100）
PGTX解决方案（请参阅食谱；组成列于第12-19点）

设备

P ipetts
120毫米镊子（Ideal-Tek，目录号：36A-SA）
锥形瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB-500-150）
NanoDrop （Thermo Fisher Scientfic ，目录号：ND-1000）
凝胶记录仪（Bio - Rad，Gel Doc 2000成像系统）
荧光显微镜，激发滤光片BP470 / 40 nm，发射滤光片BP 525/50，Leica DFC360FX黑白相机（Leica C amera I nc。，目录号：DM5500B ）
光镜，100 / 1.3油物镜，徕卡DFC420 Ç相机（徕卡ç 相机我NC，目录号：DM2500）
PCR热循环仪（赛默飞世尔科技，Veriti ® 热循环仪）
紫外可见分光光度计（Analytik的耶拿AG，德国，SPECORD ® 205）
水浴超声波仪（Bandelin Souvrex NK51）
离心机（Eppendorf 5415R冷冻离心机）
培养箱（新泽西不伦瑞克TM 伊诺® 43）
真空过滤系统（Thermo Fisher Scientific，Nalgene TM 300-4100）
软件

ImageJ（美国国立卫生研究院，https://imagej.nih.gov/ij/ ）
慷慨（Biomatters Ltd.，https ://www.geneious.com ）

程序

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902930--1293 Amit Srivastava 828906 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 在鱼腥藻中构建asRNA 介导的基因敲低突变体的步骤示意图。缩写：Km，卡那霉素；Neo12.5，新霉素（12.5 µg / ml）；Neo25，新霉素（25 µg / ml）；npt ，新霉素磷酸转移酶；bla ，β-内酰胺酶；猫，氯霉素乙酰转移酶。

注意：仅在无菌条件下进行蓝细菌培养物的处理。

A.DNA 操作

设计（a）启动子，例如P psbA1 （alr4866 ；编码Photosystem II蛋白D1）和（b）反向定向靶基因的引物（以下称为GENE ），并通过PCR扩增DNA片段。图1A说明了本节中的所有步骤。可以手动设计引物，也可以使用Geneious （https://www.geneious.com）等程序设计引物。表1列出了用于构建和确认鱼腥藻alr0277 基因敲除突变体的引物（Srivastava et al。，2017）。
注意：在该协议中，使用了制造商描述的Gibson组件（Gibson等，2009）。Gibson组装方法中的引物设计不需要在引物中添加限制位点。

表1.用于构建和确认鱼腥藻中alr0277 基因敲低突变体的引物（Srivastava et al。，2017）

底漆

取向

顺序（5 ' 至3 ' ）

用于构建对照质粒（pAM1956-P psbA1 ）的引物

PpsbA1-P1

向前

CCTGCAGGTCGACTGCTAGAGGCATCAATTCGAGCTCGGTACGGATTCCCAAAGATAGGG

PpsbA2-P2

相反

CATATGTATATCTCCTTCTTAAATCTAGAGGATCCCCGGTTTTTTATGATTGCTTTGGATTTG

用于构建表达asRNA 的重组质粒的引物（pAM1956-as_alr0277）

asAlr0277-P1

向前

CCTGCAGGTCGACTGCTAGAGGCATCAATTCGAGCTCGGTACGGATTCCCAAAGATAGGG

asAlr0277-P2

相反

GTAATGCCTACTGGTTCATAGTTTTTTATGATTGCTTTGG

asAlr0277-P3

向前

CCAAAGCAATCATAAAAAACTATGAACCAGTAGGCATTAC

asAlr0277-P4

相反

CCTTCTTAAATCTAGAGGATCCCCGGATGGCAGCAAGTGAGTCC

用于确认反义（as_alr0277）表达的引物

RT-asAlr0277-P1

向前

GCCGGTGTGTAATTGAACCA

RT-GFPmut2-P2

相反

CACCCTCTCCACTGACAGAG

用于确认基因（alr0277 ）转录抑制的引物

RT-Alr0277-P1

向前

GAGTTACCACAAGGGAATTTTTATATG

RT-asAlr0277-P2

相反

GCCGGTGTGTAATTGAACCA

在半定量PCR分析中用作对照基因（rnpB ）的引物

RT-rnpB-P1

向前

ACTCTTGGTAAAAGGGTGCAAAGGTG

RT-rnpB-P2

相反

AACCATAGTTCCTTCGGCCTTGCT

线性化promoterless- gfpmut2 含有复制穿梭载体pAM1956（尹和金，1998）使用XmaI位的限制酶。
在1.5％（w / v）琼脂糖凝胶上检查所有三个片段的所需大小，然后通过凝胶纯化回收。在NanoDrop 仪器上测量纯化片段的浓度和纯度。
在Gibson组装反应（包含酶：T5外切核酸酶，Phusion DNA Polym 擦除酶和Taq DNA连接酶）中结合启动子asGENE 和线性化质粒（pAM1956-X maI），并按照制造商的说明进行操作。
变换连接混合物到感受大肠杆菌HB101，传播上的LB琼脂平板（1.5 ％琼脂），补充有卡那霉素（50 μ 克/ 毫升），并等待菌落在37生长过夜 ℃。感受态大肠杆菌HB101细胞可以通过用CaCl 2 处理来制备（Sambrook 等，2006）。
一旦菌落出现，它们可以通过菌落PCR通过使用P的正向引物证实psbA1 和反向引物asGENE 。

B. 重组鱼腥藻菌株的构建

生长鱼腥在25ml BG11培养基（Rippka 等人，1979）（配方1）在连续光照（40 μ 摩尔相片纳秒/ 米2 / S）在30 ℃下和以150rpm振荡4-5天，直到它处于指数阶段（OD 730〜0.5 ）。本节中的所有步骤在图1B中进行了说明。
通过在室温下以4,00 0 xg离心10分钟收集细胞，并将细胞沉淀重悬于150 ml锥形瓶中的25 ml BG11培养基中。
通过使用水浴超声仪对培养物进行60-120 s的超声处理来破坏细丝，使其平均3-5个细胞长度，并通过明场显微镜对其进行确认。
生长第一天Ë断裂长丝在连续光照（40 μ 摩尔光子/ 米2 / 在3秒）0 ℃，并在150rpm下振荡。
在同一天，接种在步骤5（A部分）中构建的带有货物质粒（Km R ）的大肠杆菌HB101 的菌落，以及带有pRL443（Ap R ）的大肠杆菌HB101-R2的菌落。pRL623（厘米- [R ）在2ml LB肉汤与50 μ 克/ ml卡那霉素和100 μ 克/ ml氨苄青霉素+ 25 μ 克/ ml氯霉素分别在37 12-16小时℃下以200rpm。
第二天，子接种100 μ 升的上述的过夜生长的培养物的大肠杆菌菌株于5ml补充有合适的抗生素的新鲜LB液体培养基，并允许它们生长，直到它们达到指数期（OD 600 〜0.5）。
通过在25 °C（室温）下在台式离心机中以4,000 xg 离心10分钟收获5 ml培养物。
用1ml LB洗细胞沉淀三次，以彻底去除抗生素，然后添加200 μ 升LB以重悬浮在两种颗粒。不要涡旋细胞，如果需要，请使用无菌移液器轻轻重悬大肠杆菌细胞。
关于配合实验中，混合100 μ 升HB101承载货物质粒用100 μ 升在室温下HB101-R2（窝藏pRL443和pRL623）和温育30分钟（试验组）。对于阴性对照，混合100 μ 升与100 LB μ 升HB101-R2，并在室温下搅拌30分钟（对照组）进行培养。
注意：我们使用的大肠杆菌菌株（HB101）包含质粒pRL443和pRL623，这与原始方法（Elhai and Wolk ，1988）不同，原始方法是一个菌株包含接合质粒（pRL443），其他菌株包含辅助质粒质粒（pRL623）和货物质粒。

同一天，通过在室温下以4,000 xg离心10分钟收获15 ml 鱼腥藻培养物。将细胞沉淀重悬于1 ml BG11中，将细胞转移至1.5 ml Eppendorf管中，然后在室温下以6,000 xg离心1分钟。重悬在400粒料μ 升2×BG11的; 然后将细胞平均分为两个试管。
混合200 μ 升的鱼腥resuspe nsion用200 μ 升的配合大肠杆菌分别混合物（实验组）或对照混合物（对照组），和在室温下孵育和低光（20 μ 摩尔光子/ 米2 / s）过夜。
传播夫妻混合物到高压灭菌的小号upor ® PES膜盘过滤器（苏泊尔-800，0.8 μ 米放置在BG11琼脂含有12.5板（1.5％琼脂，配方2），47 MM）μ 克/ ml新霉素，在30温育℃，用连续的低光照（20 μ 摩尔光子/ 米2 / S）。
所述膜转移到新鲜BG11琼脂平板上（25 μ 克/ ml新霉素）每第四天，直到新霉素抗性菌落之后15-20天逐渐显现。
在荧光显微镜下观察鱼腥藻菌落，并选择发出GFP荧光的菌落（100x / 1.3油物镜，激发滤光片BP 470/40 nm和发射滤光片BP 525/50 nm ）进行进一步实验。
拾取用无菌接种环或牙签和接种所需的菌落到含有250无菌玻璃试管（3-4毫升总体积）微升BG11培养基的25 μ 克/ ml新霉素。保持此管在连续低光照（20 μ 摩尔光子米2 / S）。3-4天后，在一次生长视觉增加观察到的，添加另一个250-500 微升的BG11培养基（25 μ 克/ ml新霉素）。一旦该培养物的OD 730 达到0.3-0.4，就将细胞转移到5 ml含有新霉素的BG11培养基中（在25 ml无菌玻璃管中），如上所述。现在，管可以被放置在40连续光照明μ 摩尔光子/ 米2 / 秒。足够的生长，观察到（OD后730 〜0.6-1.0），可以将细胞转移到含有25ml BG11培养基150ml的无菌锥形瓶中（25 μ 克/ ml新霉素）。现在，可以根据需要在上述培养基中对细胞进行传代培养，以进行常规维护或进行实验。所有这些步骤都可以在24-26执行 ° Ç 。

C. 确认asRNA 的表达和靶基因的下调

要通过半定量PCR方法确认asRNA 的表达，请设计asGENE 内部的正向引物和gfpmut2 基因内部的反向引物。要确认目标基因的下调，请从基因组中存在但反义构建体中不存在的目标基因的上游序列设计正向引物，以便可以从源自GENE mRNA的cDNA中选择性扩增而不是从其基因中扩增核糖核酸。图1C说明了本节中的所有步骤。
注意：逆转录酶反应后，使用常规PCR进行扩增。然而，qRT -PCR也可以用于评估野生型和敲低菌株之间mRNA表达的差异，这是一种更为敏感的技术。备选地，如果可获得抗被击倒的蛋白质的抗体，则也可以采用蛋白质印迹法来监测蛋白质含量的减少。

滤波器20毫升指数期（OD的730 〜0.5）鱼腥在膜过滤器培养（泊尔® PES 米embrane d ISC ˚F ilters- 小号upor-800，0.8 μ 米，47个1mm），使用真空泵组件收获细胞。可替代地，细胞也可以通过离心分离（4收获，000 ×g离心，10分钟）和试剂如TRI试剂（Sigma）/ Trizol试剂（Invitrogen公司）可以使用制造商的方案被用于分离总RNA。
使用镊子和涡旋将装有滤池的细胞插入装有PGTX溶液的小瓶中（请参阅“食谱”），直到滤池破碎成小薄片并与苯酚正确混合。将样品放在冰上。
立即将样品冷冻在液氮中，储存在-80 °C，并按照Pinto 等人的描述准确地进行RNA提取。（2009）。
在变性甲醛甲醛琼脂糖凝胶（1.5-2.0 ％w / v琼脂糖）上检测RNA 。用溴化乙锭染色后，完整的总RNA在迁移时将显示清晰的23S和16S rRNA清晰条带。按照制造商所述，使用NanoDrop 仪器测量RNA浓度和纯度。
用DNase I酶处理RNA（通常是原始库存的1:10稀释液），然后根据制造商的说明用DNase灭活剂灭活DNaseI 。
RNA制品的DNA污染不一定通过凝胶电泳或类似方法检测。要测试是否不存在可检测量的基因组DNA，请使用稀释的RNA样品作为PCR模板，并使用组成型基因rnpB的引物对进行PCR 。使用NanoDrop 仪器测量RNA浓度和纯度。
使用cDNA逆转录酶与1准备μ 克RNA为模板以及0.5 μ 中号的随机引物，按照生产商的说明进行操作。
PCR 在不同的PCR反应中使用特异性引物，扩增管家基因rnpB 的小片段作为对照和目标基因，将循环数从25增加到36。
在琼脂糖凝胶上检测PCR产物并记录图像。
使用ImageJ软件测量PCR带的强度比较成绩单水平。

数据分析

可以使用ImageJ软件（NIH，美国，https：//imagej.nih.gov/ij/）对基因表达数据进行如下分析：

用凝胶记录仪记录凝胶图片并“反转”图像颜色，以使cDNA条带显示为黑色。在ImageJ软件中打开最终的凝胶图像文件（tiff）进行分析。
图像中的所有波段都应单独选择。选择“矩形”选择工具以选择最宽的波段作为第一波段。所选区域的高度应几乎是此范围的两倍。
通过按CTRL + 1 将选中的框标记为第一个。结果，数字1将显示在选中的框内。
将指针（光标）移动到第一个选定的框内，单击并将框区域拖到图像中的下一个区域。
通过按CTRL + 2将选中的框标记为第二个。数字2将显示在选择框内。
重复步骤小号4和5 来选择图像中的频带的其余部分。
选择所有频段后，按CTRL + 3以显示每个频段的直方图。
要测量每个峰下方的面积，请首先通过选择“绘制线”工具在每个直方图的最下部绘制一条线来分离直方图的峰。然后选择“魔术棒”工具并在直方图中单击。所选区域将以黄色框出轮廓，并出现“结果”窗口。
结果窗口将显示每个条带的定量强度（值）。

峰的大小将记录为整个突出显示的峰的总大小的百分比。测试基因的峰值百分比应除以管家基因（对照基因）的峰值百分比，以证明每个实验基因表达的相对百分比。相对表达应一式三份进行，并应考虑每个样品的平均值，标准差，最小值和最大值进行统计分析。有关ImageJ过程的详细信息，请参阅用户手册第30.13节（Ferreira和Rasb ，2012年）。

笔记

为了与如上所述构建的敲除菌株进行适当比较，建议通过与野生型鱼腥藻缀合来构建对照菌株，该质粒仅包含p psbA1 启动子，并与pAM1956中的无启动子gfpmut2 基因融合（即，矢量控制）。

菜谱

BG11介质（从Rippka 等人，1979年修改）
注意：此培养基用于种植鱼腥藻。

准备每种储备溶液200 ml ，100 ml微量元素储备溶液和50 ml 1 M NaHCO 3 （分别为表2 ，表3 和表4 ），并通过高压灭菌进行灭菌。
注意：柠檬酸和柠檬酸铁应在室温下避光保存；其他溶液应在4 °C下储存。网络滤波器消毒微量元素和NaHCO 3 股。

要准备1 L BG11培养基（1x），则每200x st 加入5 ml 。玉珠溶液和964毫升Milli-Q水将1ml微量元素储备溶液（1000倍）

表2 。适用于BG11媒体的储备液（200x）

物质

克/摩尔

克/升在1× 米edium

1x介质中的糖度

200x储备溶液，g / L

200x储备液，g / 200 ml

200x储液中的摩尔比

硝酸钠3

84.99

1.5

17.65毫米

300

60

3.53百万

K 2 HPO 4 · 3H 2 O

228.21

0.04

175.3 μ 中号

8

1.6

35毫米

MgSO 4 · 7H 2 O

246.48

0.075

304.3 μ 中号

15

3

60毫米

氯化钙2 · 2H 2 O

147.02

0.036

244.8 μ 中号

7.2

1.44

49毫米

柠檬酸

柠檬酸铁（III）

192.13

0.006

31.2 μ 中号

1.2

0.24

6.25毫米

244.94

0.006

24.5 μ 中号

1.2

0.24

4.9毫米

Na 2 -EDTA

292.24

（372.24）

0.001

3.42 μ 中号

0.2

0.04

（0.051克）

0.68毫米

Na 2 CO 3

105.99

0.04

377.4 μ 中号

8

1.6

75.5毫米

注意：改良的BG11介质可调节以下试剂的水平：

Na 2 CO 3 ：修改：0.04 g / L；原稿：0.02克/升

Co（NO 3 ）2 · 6H 2 O：修改：0.078 g / L；原始：0.0494克/升

表3 。微量元素原液（1,000x）

物质

克/摩尔

1 M 培养基中的μM

1,000x储备溶液，g / L

1,000x储备溶液，每100毫克毫克

^ h 3 BO 3

61.83

46.3

2.86

286

MnCl 2 · 4H 2 O

197.91

9.2

1.81

181

ZnSO 4 · 7H 2 O

287.53

0.77

0.222

22.2

Na 2 MoO 4 · 2H 2 O

241.95

1.6

0.390

39

CuSO 4 · 5H 2 O

249.7

0.32

0.079

7.9

Co（NO 3 ）2 · 6H 2 O

291.04

0.267

0.078

7.8

表4 。1 M NaHCO 3 储备溶液

物质

克/摩尔

在1x培养基中的g / L

1M培养基中的毫米

1M储备溶液，g / L

1M储备溶液，g / 50 ml

稀释系数

碳酸氢钠3

84.01

0.42

5

84

4.2

1：200

BG11 1.5 ％（w / v）琼脂板
要在1,000 ml瓶中制备500 ml 2x浓缩Bacto TM 琼脂，请在500 ml Milli-Q水中添加30 g Bacto TM 琼脂
然后通过添加464 ml Milli-Q水和5 ml每种200x储备液，1 ml微量元素储备液（1,000x）在500 ml瓶中制备2x BG11培养基
此外，添加3 g / L 五水硫代硫酸钠并添加10 ml pH 7.6-8.2的1 M（1：100）TES
高压灭菌2x BG11培养基和2x琼脂
将两种溶液冷却至大约50℃时合并。无菌罩下60°C
在倒板之前，添加NaHCO 3 至终浓度为5 mM
如果需要，添加抗生素
注意：板应厚（对于直径为100 mm的板，请使用30-40 ml BG11琼脂），因为蓝细菌的生成时间长，并且在整个孵育过程中水会蒸发。另外，板也可以用石蜡膜密封。

TES缓冲液
要准备1 M TES缓冲液，请在750 ml Milli-Q水中添加229.25 g TES [[（N- {Tris（羟甲基）甲基} -2-氨基乙磺酸]]
广告只是至pH 8.2使用10N NaOH将
用dH 2 O 填充至1 L的最终体积
过滤消毒（推荐）或高压灭菌器
储存在4 °C
PGTX解决方案（100毫升）
苯酚39.6克

甘油6.9毫升

8-羟基喹啉0.1克

Na 2 - EDTA 0.58克

醋酸钠0.8克

硫氰酸胍9.5 g

盐酸胍4.6克

海卫一X-100 2毫升

称量PGTX解决方案的所有成分，并将dH 2 O加入100 ml
溶液应在50-60搅拌℃下吨o创建均匀的溶液
该混合物在室温下形成单相溶液
溶液的最终pH应达到〜4。2无需任何手动调整

致谢

该协议是基于出版物“DNA的接合转移到蓝藻”（Elhai 和德沃尔克，1988）和“替代σ因子的下调SigJ 赋予光保护表型鱼腥藻PCC 7120”（塔瓦等人。，2017）。这项工作得到了新德里科学技术部（DST）的支持（由AKT，AB和AS批准）。AS还得到了德国学术交流服务（DAAD）和捷克共和国教育，青年与体育部的支持（项目LO1416）。

利益争夺

作者没有利益冲突要声明。

[R eferences

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