材料和试剂

1。 15 ml管（GeneMate ，目录号C3394-1）

2. 500 ml烧瓶（VWR，目录号：89095-276）

3. 5 0 ml管（CELLSTAR，目录号：227270）

4. 125毫升烧瓶（VWR，目录号：89095-258）

5. 15毫升Corex玻璃管（Corning）

6. 1.7 ml无菌Eppendorf管（E ppendorf ，目录号：022431021）

7. Millex-GV针头过滤器单元，0.22 µm（Millipore-Sigma ，目录号：SLGV033RS）

8. HisTrap HP组氨酸标签的蛋白质纯化柱（GE Healthcare，目录号：17524701）

9. Hi-load 16/60 0 Superdex200 pg凝胶过滤色谱柱（GE Healthcare ，目录号：28989335）

10. Zeba旋转脱盐柱（Thermo Scientific，目录号：89893）

11. Amicon Ultra-4离心过滤器（Millipore-Sigma，目录号：UFC810008 ）

12. 主管E. 大肠杆菌DH5α细胞（New England Biolabs公司，目录号：C2987）

13. 主管E. 大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL细胞（安捷伦科技目录号：230280）

14. HEK293T细胞（ATCC，目录号：ACS-4500）

15. 质粒

pET-21a-BirA（Addgene，目录号：20857）
pAAV-DJ（Cell Biolabs，目录号：VPK-420-DJ）
pAAV-Helper（Cell Biolabs，目录号：VPK-400-DJ）
pAAV-GFP（Cell Biolabs，目录号：AAV-400）
pAAV荧光素酶（Cell Biolabs，目录号：AAV-321）
pAAV-mCherry（Cell Biolabs，目录号：VPK-410）
16. Luria-Bertani（LB）培养基（Quality Biological，目录号：10128-254）

17.卡那霉素（黄金生物技术，目录号：K-120）

18. 2x Phusion高保真PCR预混液（ Thermo Scientific，目录号：F531S）

19. 限制酶

FastDigest NheI（Thermo Scientific，目录号：FD0973 ）
FastDigest HindIII（Thermo Scientific，目录号：FD0504 ）
快速文摘 BglII（Thermo Scientific，目录号：FD0084 ）
FastDigest XhoI （Thermo Scientific，目录号：FD0694）
20. FastAP热敏碱性磷酸酶（Thermo Scientific，目录号：EF0654）

21. T4 DNA连接酶（Thermo Scientific，目录号：EL0014）

22. AccuGENETM 10x TBE缓冲区（Lonza，目录号：50843）

23. QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）

24. QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN，目录号：27106）

25. CompactPrep质粒Midi试剂盒（QIAGEN，目录号：12843）

26. 氯苯丙泊酚（Amresco，目录号：0230-100G）

27. 完整的蛋白酶抑制剂混合物（Roche ，目录号：4693159001 ）

28. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Gold Biotechnology，目录号：12481C）

29. EDTA （质量生物学，目录号：351-027-721 ）

30. 二甲基亚砜（DMSO）（ATCC，目录号：80713185 ）

31. 乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：229873）

32. E thanol （VWR，目录号：BDH 1156-4LP ）

33. 脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（Sigma-Aldrich ，目录号：D5025 ）

34. Benzonase核酸内切酶（Millipore-Sigma，目录号： 1016540001）

35. M9CA中粉（Amresco ，目录号：J864-500G ）

36. 蛋白酶K溶液（Thermo Scientific，目录号：AM2546）

37. HiTrap DEAE Sepharose FF （GE Healthcare，目录号：17515401）

38. HiTrap AVB Sepharose HP （GE Healthcare，目录号：28421111）

39. 牛血清白蛋白，乙酰化（Promega，目录号：R3961）

40. 4-20％Tris-甘氨酸迷你凝胶（Thermo Scientific，目录号：XP04205BOX）

41. 考马斯亮蓝R-250 染色液（BIO-RAD，目录号：1610436）

42. 氯仿，HPLC级（Thermo Scientific，目录号：AA43685M1）

43. Slide-A-Lyzer透析盒（ Thermo Scientific，目录号：66380）

44. PBS（10x），pH 7.4（Quality Biological，目录号：50146771）

45. Lipofectamine 2000（Thermo Scientific，目录号：11668027）

46. QuickTiter AAV定量试剂盒（Cell Biolabs，目录号：VPK-145）

47. EZ-Link NHS-生物素试剂（Thermo Scientific，目录号：20217）

48. Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Scientific，目录号：10313039）

49. 氯化钠，5 M（质量生物学，目录号：351036491）

50. Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN，目录号：30210）

51. 生物素（西格玛奥德里奇，目录号：B4639）

52. ATP（西格玛奥德里奇，目录号：A1852-1VL）

53. pET-21a-BirA（Addgene，目录号：20857）

54. 胰蛋白（（GROWCELLS，目录号：MCMA-0901 ）

55. 酵母提取物（Affymetrix，目录号：8013-01-2 ）

56. 氯化钠（Affymetrix，目录号：21618-5KG ）

57. 葡萄糖（AMRESCO，目录号：0188-IKG ）

58. 娜2 HPO 4 （VWR，目录号：0404-2.5KG ）

59. KH 2 PO 4 （阿尔法·埃萨尔，目录号：11594 ）

60. Tris-HCl （质量生物学，目录号：351-006-101 ）

61. 咪唑（Alfa Aesar，目录号：11594 ）

62. 甲醇（VWR，目录号：BDH 1135-4LP ）

63. 乙酸（VWR，目录号：BDH3908-3.8LP ）

64. MgSO 4 （西格玛奥德里奇，目录号：M7506）

65. 摩尔的媒介（请参阅食谱）

66. 1 M IPTG （请参阅食谱）

67. HisTrap绑定缓冲区（请参阅食谱）

68. HisTrap洗脱缓冲液（请参见配方）

69. 凝胶过滤缓冲液（请参阅食谱）

70. SDS-PAGE脱色溶液（请参阅食谱）

71. M9CA介质（请参阅食谱）

72. PI-Mg缓冲液（请参见配方）

73. 头绑定缓冲区（请参阅食谱）

74. 头部洗脱缓冲液（请参见配方）

75. DNA包装缓冲液（请参见食谱）

76. PBS-MK缓冲液（请参阅食谱）

77. DMEM细胞培养完全培养基（请参阅食谱）

设备

移液器（VWR，目录号：89130898）
水浴（VWR ，型号：1217 ）
-80°C冰箱（Panasonic，型号：MDF-U76VC）
SS34转子（SORVALL）
GS3转子（SORVALL）
AM 2.18转子
PCR机（BIO-RAD，型号：T100热循环仪）
Sorvall RC-5C plus离心机（Thermo Scientific ，型号：Sorvall TM RC-5C plus ）
法国媒体（Thermo Scientific）
AKTA底漆系统（Amersham Biosciences）
AKTA快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（GE Healthcare，型号：UPC-900）
纳米d ROP 2000分光光度计（热科学，型号：纳米滴TM 2000 ）
摇动培养箱（New Brunswick Scientific，型号：Innova 43）
ChemiDoc影像系统（BIO-RAD，731BR02947）
MilliQ水机（Millipore-Sigma，批号：F8BA18025）
台式离心机（Eppendorf，型号：5415D）
高压灭菌器（Tuttnauer，型号：3870EA-B / L）
高速多功能离心机（Jouan，型号：MR-23i）

软件

ImageJ（国立卫生研究院影像，https：//imagej.nih.gov/ij/）
数量一软件（加利福尼亚州Bio-Rad）
SnapGene（GSL生物技术有限公司）

程序

质粒构建（3天）
Hoc和/或Soc可以有效地显示在T4衣壳上，作为AAV附件的链接器。在这里，我们构建了pET-28b-Soc和pET-28b-BAP-Hoc用于Hoc / Soc蛋白表达。此外，Ť 他比尔A-表达质粒pET-21a至生物素化酶BirA从Addgene公司购买（质粒没有。20857）。质粒pAAV-DJ（＃VPK-420-DJ），pAAV-Helper（＃VPK-400-DJ），pAAV-GFP（＃AAV-400），pAAV-荧光素酶（＃AAV-321）和pAAV-mCherry（＃VPK-410）购自Cell Biolabs。

pET-28b-Soc构建（3天）
根据制造商的规程，使用Thermo Fisher 2x Phusion高保真PCR预混液从RB69噬菌体基因组DNA扩增RB69 Soc基因片段（228 bp）（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F531S#/ F531S）。引物如下所示，其中带下划线的序列表示相应限制酶的识别序列：
Soc NheI转发：

5 ' - GCATCC GCTAGC GGTGGTTATGTA 甲ACATCAAA-3 ' 。

Soc XhoI反向：

5 ' - GTG CTCGAG CACCACTTACTGGTGTAGGGGTAAAC-3 ' 。

向每个PCR样品中添加1/10体积的10x DNA上样缓冲液，并将50μl反应上样至1.5％琼脂糖-TBE凝胶上，并通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。此外，加载100 bp的DNA标记以进行大小验证。
使用干净的刀片切割预期大小的DNA条带，并根据制造商的规程使用QIAGENQIA快速凝胶提取试剂盒纯化Soc DNA。
按照制造商的说明，在37°C下孵育4小时，用NheI和XhoI消化1μg纯化的Soc PCR产物。同时，在37°C下用NheI和XhoI 消化1μgpET-28b载体质粒4 h。
为了防止在连接期间载体重新环化，D ephosphorylate 5 ' 消化的的-ends含1μlFast AP Thermos敏感碱性磷酸酶的pET-28b无需更改限制酶缓冲液，并在37°C下孵育40分钟。
分别使用1.5％和1％琼脂糖凝胶电泳分离消化的Soc插入片段和pET-28b载体。然后根据制造商的说明使用QIAGENQIA快速凝胶提取试剂盒进行纯化。将消化后的插入片段和载体保存在-20°C直至需要。
使用T4 DNA连接酶在22°C下2小时（在水浴中）以5：1 的摩尔比连接插入物和载体。准备不带插入片段的载体骨架作为阴性对照，以评估载体的再循环。
根据制造商的说明，使用热激法用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在卡那霉素LB平板上于37°C 孵育过夜。
挑2-3单菌落并接种各成补充用3ml LB培养基50 微克/ ml卡那霉素在15个毫升试管中。将试管在摇动培养箱中于220 rpm和37°C孵育过夜。使用QIAGEN质粒迷你试剂盒按照制造商的规程从上述培养物中纯化质粒DNA 。
用T7和T7ter测序引物克隆序列，以确认Soc序列正确插入pET-28b主链。所得的pET-28b-Soc质粒应在Soc的NH2-和COOH-末端均包含六组氨酸标签。
pET-28b-BAP-Hoc的构建（3天）
使用2x Phusion高保真PCR预混液和以下三个引物进行两轮PCR反应以从T4基因组DNA扩增BAP-Hoc。带下划线的序列表示各个限制酶的识别序列。
BAP-Hoc转发1：

5 ' -ATCGAGTGGCACGAGGGTCTTTCGATGACTTTTACAGTTGATATAACTCC-3 '

BAP-Hoc NheI转发2：

5 ' -TTCTA GCTAGC GGTCTTAACGACATCTTCGAGGCACAGAAGATCGAGTGGCACGAGGGTCTTTCG-3 '

BAP-Hoc HindIII 反向：

5 ' -ATA AAGCTT TTATGGATAGGTATAGATGATACCAGTTTC-3 '

为了用生物素标记Hoc蛋白，我们将生物素受体肽（BAP）遗传融合到Hoc的N端。通过使用BAP-Hoc Forward 1和BAP-Hoc HindIII反向引物将Hoc融合到BAP序列的一部分来执行第一轮PCR。使用BAP-Hoc NheI正向2和BAP-Hoc HindIII反向引物通过第二轮PCR获得全长BAP-Hoc（1,197 bp）。

用Nhe I和Hind III 消化的BAP-Hoc PCR产品和pET-28b载体。然后，根据S teps A 1b至A 1j 将消化的BAP-Hoc片段亚克隆到pET-28b载体中。所结果的pET-28b-BAP-Hoc质粒应包含与BAP的Hoc读框融合，Hoc NH2末端的15-aa载体生物素受体肽（GLNDIFEAQKIEWHEHE），以及在COOH末端的六组氨酸序列特设

蛋白质表达，纯化和修饰（4天）
Soc和BAP-Hoc蛋白表达和纯化（3天）
使用热休克方法根据制造商的方案，将15 ng pET-28b-Soc或pET-28b-BAP-Hoc转化为20μlBL21-CodonPlus（DE3）-RIPL感受态细胞。BL21- CodonPlus（DE3）-RIPL细胞包含与ColE1兼容的，基于pACYC的质粒，该质粒对蛋白质表达具有氯霉素抗性。将转化细胞铺在LB-卡那霉素/氯霉素平板（50μg/ ml卡那霉素和30μg/ ml氯霉素）上，并在37°C下孵育过夜。
挑选一个菌落，接种到500 ml烧瓶中，该烧瓶中含有50 ml摩尔培养基，其中含有50μg/ ml卡那霉素和30μg/ ml氯霉素。在220 rpm和37°C的振荡培养箱中孵育过夜。
将20 ml的过夜培养物接种到1 L的含有50μg/ ml卡那霉素和50μg/ ml氯霉素的摩尔培养基中。在220 rpm和37°C下孵育培养物，直到细胞密度达到OD 600 = 0.4-0.5。然后，在加入IPTG之前，在摇瓶中以220 rpm的速度将培养物的温度冷却至28°C 40分钟。
加入1ml 的1M IPTG至1个培养物（终浓度1mM）的和我在28℃和220řncubate 2-3小时时用于诱导蛋白质表达。
通过使用500 ml离心瓶和Sorvall RC-5C的GS3转子加7,000 rpm（8,288 xg ）在4°C 下离心10分钟，离心培养物来收集诱导的细胞。弃去上清液，将沉淀保存在-80°C直至纯化。
用50 ml HisTrap结合缓冲液重悬沉淀，其中含有一丸完整的蛋白酶抑制剂混合物或冰。用法国压力机以10,000 psi的压力裂解细胞两次。
使用30 ml管和SS34转子在Sorvall RC-5C中离心细胞裂解液，然后在4°C 下以18,000 rpm（38,724 xg ）离心30分钟。
丢弃沉淀并收集含有可溶性Soc或BAP-Hoc蛋白的上清液。在加载到HisTrap柱上之前，通过0.22μmMillipore过滤器过滤上清液。
在AKTA-prime系统上设置1 ml HisTrap HP色谱柱。用30 ml水洗涤色谱柱，然后用30 ml HisTrap结合缓冲液洗涤以平衡色谱柱。
将过滤的上清液以1 ml / min的流速上样到HisTrapHP柱上（流速增加将降低蛋白质与柱的结合。），然后用50 ml HisTrap结合缓冲液洗涤上样的柱。
在AKTA-prime系统上设置HisTrap HP色谱柱的洗脱程序。参数如下：浓度（缓冲液B百分比）：0；渐变长度：40；目标（缓冲液B的百分比）：100；流量：1毫升/分钟；分数基础：ml; 分数大小：1；压力极限：0.3。使用用于泵A的HisTrap结合缓冲液和用于泵B的HisTrap洗脱缓冲液，以20-400 mM线性咪唑梯度洗脱His-tag蛋白。
收集并合并峰级分，并按照制造商的规程使用Amicon Ultra-4离心过滤（Soc的截留值为3 kDa，BAP-Hoc的截留值为10 kDa）将收集的水浓缩至4-5 ml。
设置AKTA快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统以通过尺寸排阻色谱法以及脱盐Soc或BAP-Hoc蛋白进一步纯化。用150 ml凝胶过滤缓冲液洗涤Hi-load 16/600 Superdex 200色谱柱。将浓缩的His-tag蛋白（4-5毫升）以1.0毫升/分钟的流速和最高0.5 MPa的压力加载到Hi-load 16/600 Superdex 200色谱柱上。
根据分子大小从凝胶过滤洗脱液中收集并收集峰级分，并使用Amicon Ultra-4离心过滤进行浓缩。
通过SDS-PAGE检查纯度和量化使用SOC和BAP-HOC蛋白的浓度纳米d ROP 。浓度测量参数如下：Soc，分子大小10.5KDa，消光系数11,460，Abs 0.1％（＝1g / L ）1.088。BAP-Hoc，分子大小44.9 KDa，消光系数70945，Abs 0.1％（= 1 g / L ）1.580。分装浓缩蛋白并储存在 -80°C直到需要。
Soc蛋白生物素化（4小时）
生物素N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯是最流行的生物素化试剂类型。NHS活化的生物素与蛋白质的伯氨基（-NH2）（赖氨酸残基的侧链和每个多肽的N-末端）有效反应，形成稳定的酰胺键。

根据制造商的说明，使用10 ml Zeba 旋转脱盐柱（7K MWCO）用1 x PBS缓冲液（pH 7.4）交换Soc蛋白凝胶过滤离子缓冲液（Tris缓冲液）。避免使用含伯胺（例如Tris或甘氨酸）的缓冲液，因为它们会与生物素化反应竞争。Tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质必须交换为pH 7.2-8.0的无胺缓冲液。使用Amicon Ultra-4离心过滤器将PBS缓冲液中的Soc蛋白浓缩至〜5 mg / ml。
从-20°C的储存中取出小瓶NHS-Biotin试剂，并在打开前完全平衡至室温30分钟，以避免水分在容器内凝结。 NHS-生物素试剂对水分敏感。
在即将使用之前，将2.0 mg NHS-生物素试剂溶解在590μl的二甲基亚砜（DMSO）溶剂中，以制备10 mM的溶液。
加 500μ升的10mM生物素试剂溶液于500微升5mg / ml的蛋白质志溶液（20倍摩尔过量）。在冰上孵育反应2小时。
根据制造商的方案，使用10 ml Zeba旋转脱盐柱（7K MWCO）纯化标记的Soc蛋白。最后，用1 x PBS缓冲液（pH 7.4）洗脱Soc-生物素蛋白。分装标记的蛋白质，并在-80°C下储存直至需要。
Hoc -BAP-生物素-抗生物素蛋白（HBBA）生产（8小时）
用1x PBS-MgCl 2 缓冲液（pH 7.4）交换Hoc-BAP蛋白凝胶过滤缓冲液根据制造商的说明，使用10 ml Zeba 旋转脱盐柱（7K MWCO）。
在存在0.3 mM生物素和5 mM ATP的情况下，向30μMHoc-BAP单体中添加1μM重组BirA连接酶，以进行Hoc-BAP生物素化。让反应在室温下进行3小时，并在摇动平台上轻轻混合以形成Hoc-BAP-生物素（HBB）。
使用10毫升Zeba旋转脱盐柱（7K MWCO）除去过量的生物素。通过链霉亲和素-HRP Western印迹分析确认生物素化。
将Hoc-BAP-生物素与抗生物素蛋白以1：3的比例在4°C下孵育1小时，以形成Hoc-BAP-生物素-亲和素复合物。
设置AKTA - FPLC系统。用150 ml凝胶过滤缓冲液洗涤Hi-load 16/600 Superdex 200色谱柱。将包含HBB，HBBA，抗生物素蛋白，BirA和Hoc-BAP 的生物素化反应混合物以1.0 ml / min的流速上样至Hi-load 16/600 Superdex 200色谱柱。
根据分子大小从凝胶过滤洗脱液中收集并合并HBBA的峰级分，并使用Amicon Ultra-4离心过滤进行浓缩。检查的通过SDS-PAGE纯度。分装浓缩的蛋白质，并在-80°C下储存直至需要。

噬菌体T4头产生（3天）
条纹出的甘油原液E. 大肠杆菌在LB琼脂平板P301细胞，并离开它在37 ℃下过夜。挑选一个菌落，并在125 ml烧瓶中接种到20 ml无菌LB + M9A培养基（LB和M9A等体积）中。在37 °C下生长6-8小时。
将5 ml新鲜的E. coli P301培养物以1：100的稀释度接种到LB + M9A培养基（500 ml）中。松开瓶盖以允许通气，然后在37°C的振荡培养箱中使培养物生长至4 x 10 8个细胞/ ml 的密度（在细胞计数器中，如果每个小方块有5个细胞/ ml，则细胞密度为相当于10 8个细胞/毫升）。
在M 处用10琥珀色13琥珀色hoc-del.soc-del 突变体T4 感染培养物。Ø 。我。（噬菌体的添加量/每个细菌细胞的数量）为4。应注意，噬菌体T4对人细胞没有嗜性，没有已知的毒性或致病性，并且不显示预先存在的免疫力。据报道，T4噬菌体在人体内的安全性。这涉及简单地将计算量的噬菌体溶液加入细菌培养物中。在添加噬菌体溶液时混合培养物，以使噬菌体均匀地分布在培养物中。将培养物放回振荡培养箱中5分钟。
在相同的MOI下重复感染。如上所述（第二次T4感染）。将培养物放回摇动培养箱中，再培养32分钟。在第30分钟，在显微镜下快速检查细胞数，以查看细胞数是否开始减少。如果细胞数少于4 x 10 8 细胞/ ml，只需停止感染并离心即可。如果细胞数量没有变化，则将培养液在37 °C下放置1-2分钟以上（D 放置不超过35分钟。细胞会裂解）。RES ERVE的SORVALL离心机的时间提前，这样它可当你需要它。
平均分配到两个500 ml离心瓶中。使用GS3转子在Sorvall RC-5C中于4°C 以7,000 rpm （8,288 x g ）离心细胞12分钟。丢弃上清液。
向沉淀物中加入50 ml PI-Mg缓冲液（每瓶25 ml）加20μg/ ml DNAaseI。通过重复移液重悬粘性颗粒。添加1米在升氯仿孵育在37℃下30分钟一摇床以220rpm 于裂解细胞和消化DNA。
通过以4,300 x g 或12分钟离心来收集上清液。丢弃沉淀。将上清液转移到四个15 ml Corex玻璃管中（小心用一次性移液器移出上清液）。使用Sorvall RC-5C中的SS34转子加上18,000 rpm（38,724 xg ）在4°C 下离心45分钟（使用橡胶适配器），离心上清液。丢弃上清液。颗粒主要包含T4病毒头。
向每个沉淀添加500μlPI-Mg缓冲液。将沉淀在4°C下放置过夜。重悬沉淀。用移液器尖端将沉淀打碎，轻轻重悬。将四管沉淀物移入一根管中。
进行第二轮低速和高速离心。用1 ml PI-Mg缓冲液重悬沉淀。然后加入50 ml的头部结合缓冲液（无NaCl ）用于DEAE柱纯化。
使用0.22μm的过滤器过滤样品。将样品上样到5毫升DEAE柱中（1毫升/分钟），该柱用100-150毫升头部结合缓冲液（无NaCl）。在头部结合缓冲液中以0 mM至300 mM NaCl（40 ml）的线性梯度洗脱。收集峰级分（每个1 ml）。
使用Amicon Ultra-4离心过滤法浓缩纯化的水头。
通过SDS-PAGE检查纯度和浓度。将1/5体积的T4头或BSA标记物与5x SDS上样缓冲液混合，煮沸10分钟。将1、2、3和4μlT4头以及1、2、4和8μgBSA装入4-20％Tris-Gly SDS-PAGE凝胶上，并根据制造商的说明电泳。
用考马斯亮蓝R-250染色溶液对凝胶染色，微波1分钟，并在室温下摇动30分钟。
除去染色溶液，加入脱色溶液，微波1分钟，并在室温下摇动直到背景变干净。
根据制造商的说明，使用ChemiDoc Imaging Systems扫描蛋白质凝胶，并使用Quantum One软件量化蛋白质条带。根据Microsoft Excel生成的BSA标准曲线计算T4头的浓度。
分装T4头，并在-80°C下储存，直到需要为止。

T4头的体外DNA包装和蛋白质展示（2天）
T4 DNA包装（1天）
使用QIAGEN质粒midi试剂盒按照制造商的规程从相应的大肠杆菌培养物中制备质粒DNA pAAV-GFP或pAAV-荧光素酶。
根据制造商的规程，使用限制性酶XbaI或BglII将T4头包装的pAAV-GFP或pAAV-荧光素酶线性化。
纯化线性质粒DNA。
将一体积的8 M乙酸钠（-20°C）加入酶切反应中。
加入两体积的室温异丙醇，在冰上放置30分钟。
于18,000 rpm（38,724 xg ）离心30分钟4°C。
丢弃上清液，并用70％乙醇冲洗。
在4 °C 下以18,000 rpm（38,724 xg ）离心30分钟。
弃去上清液并风干沉淀（20分钟），然后将沉淀溶解在DNA洗脱缓冲液中。
量化使用线性化的质粒DNA的浓度纳米d ROP 。
执行体外DNA包装。每20μl反应混合物包含3μM全长gp17线性质粒DNA（DNA ：heads = 20：1、2。4微克的pAAV-GFP或2.8微克的pAAV萤光素酶），2 微升10X缓冲包装，并高压灭菌MilliQ水。将混合物在37 °C下孵育5分钟。然后添加2 x 10 10 T4头并在37°C下孵育30分钟。
将1μl苯甲酸酶核酸酶添加到包装反应中，并在37°C下孵育20分钟，以去除过量的未包装DNA。
检查T4磁头的包装效率。通过在65°C下用50 mM EDTA，0.5μg/μl蛋白酶K和0.2％SDS处理30分钟，释放出衣壳化的抗核酸酶的DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析包装的DNA。
使用Quantity One软件定量包装的DNA的数量。将包装效率定义为每个T4包装的DNA分子数量。
将包装了DNA的T4放在冰上以进行进一步的蛋白质展示测定。
T4蛋白释放（1天）
添加SOC-生物素或HBBA蛋白（20：1成比例SOC生物素到T4 870 SOC-结合位点; 20：1倍的比例HBBA至T4 155特设结合位点）（福金等人，2004）吨Ô 如上所述，将DNA包裹的T4头固定，轻轻涡旋混合，并在4°C下孵育1小时。
使用JouanMR-23i离心机或类似装置中的AM 2.18转子在4°C 下以18,000 rpm（32,150 x g ）结合的Soc-生物素或HBBA蛋白沉淀T4头部1小时。
丢弃上清液以除去未结合的蛋白质。
用1 x PBS缓冲液洗涤含有结合的Soc-生物素或HBBA蛋白的T4头沉淀两次。
将沉淀在4°C下孵育过夜，然后重悬于1x PBS中。
按照S teps C 12至C 15 中的步骤，通过SDS-PAGE分析蛋白质展示的T4头。确定每个泳道的Soc-生物素或HBBA和gp23 *（主要衣壳蛋白）条带的密度体积，并计算使用已知的gp23 *拷贝数，每个衣壳中的Soc-生物素或HBBA 分子的拷贝数，即每头930拷贝。

重组腺相关病毒（AAV）的产生和生物素化（6天）
AAV生产（5天）
转染前一天，板之间的足够的HEK293T细胞（〜3×10 6 ，12毫升DMEM完全培养基）至100mm的细胞培养皿上实现转染当天70-80％汇合。
使用载体比例为1：1：1的pAAV rep / cap表达载体，pAAV-荧光素酶和pAAV-Helper共转染细胞（15μgpAAV-DJ：15μgpAAV-荧光素酶：15μgpAAV-Helper）根据制造商的协议使用Lipofectamine 2000。
七十二小时转染后，加入240微升的0.5M EDTA（至最终10 mM的），以在12个的10ml DMEM培养物并孵育在室温下5分钟。轻轻摇动培养皿几次，并在50 ml无菌试管中收集所有培养基，包括细胞。
将细胞悬液以150 xg离心5分钟。除去上清液，将细胞沉淀重悬于0.5 ml无菌1x PBS中。
将细胞悬液交替放置在37°C的干冰/乙醇浴和水浴中，将其冻结并解冻四次。通过离心在10,000rpm除去细胞碎片X 克为10分钟，收集上清液作为AAV粗裂解物。
根据制造商的说明（GE Healthcare，IL），通过HiTrap AVB Sepharose HP色谱柱纯化AAV。收集和合并峰馏分。
按照制造商的方案，在Slide-A-Lyzer透析盒中针对PBS-MK缓冲液透析AAV库过夜。使用Amicon Ultra-4离心过滤（截留分子量100 KDa）浓缩AAV颗粒。根据制造商的说明，使用QuickTiter AAV定量试剂盒（Cell Biolabs，CA）确定AAV效价。分装并在-80°C下保存纯化的AAV。
AAV生物素化（1天）
从-20°C的储存中取出小瓶NHS-Biotin试剂，并在打开前完全平衡至室温30分钟，以避免水分在容器内凝结。
即将使用前，将4.0 mg NHS-生物素试剂溶解在590μlDMSO溶剂中以制备20 mM溶液。
将590μl20mM生物素试剂溶液添加到500μlAAV溶液中（约10 12个颗粒）。在冰上孵育反应2小时。
加入100 mM甘氨酸淬灭生物素试剂。
按照制造商的操作规程，在Slide-A-Lyzer透析盒中将标记的AAV对PBS-MK缓冲液进行透析过夜，以去除过量的生物素试剂和副产物。通过链霉亲和素-HRP Western印迹分析确认生物素化。分装贴有标签的AAV，并储存在-80°C直到需要。

T4-AAV杂种载体产物离子（1天）
将1 ml Ni 2+ -NTA（亚硝基三乙酸）琼脂糖小珠分配到1.7 ml无菌Eppendorf管中。将珠子以100 x g 离心1分钟。除去上清液，并用1 ml HisTrap结合缓冲液洗涤珠沉淀3次。洗涤后，将微珠沉淀重悬于0.1 ml HisTrap结合缓冲液中。
将0.2 ml 10 12 T4-Soc-生物素或T4-HBBA颗粒加入 Ni 2+ -NTA琼脂糖珠，在4°C轻轻摇动孵育1小时。
将混合物以100 x g 的速度离心30 s。除去上清液，并用1 ml HisTrap结合缓冲液轻轻洗涤T4-Soc-生物素或T4-HBBA结合的磁珠五次。洗涤后，将微珠沉淀重悬于0.1 ml HisTrap结合缓冲液中。
对于T4-Soc-AAV组装，将抗生物素蛋白溶解在HisTrap结合缓冲液中，然后添加到T4-Soc-生物素结合的磁珠（抗生物素蛋白与T4 870 soc结合位点的1：1）中。在4°C下轻轻摇动孵育20分钟。将混合物于100离心 xg 30 s。去除上清液，并用1 ml HisTrap结合缓冲液轻轻洗涤T4-Soc-生物素-亲和素结合的磁珠五次。洗涤后，将磁珠重悬于0.1 ml HisTrap结合缓冲液中。
将生物素标记的AAV载体（子标题E-2）（AAV与T4颗粒的比例为4：1）添加到固定有T4-Soc-生物素-亲和素或T4-HBBA的珠子上，并在4℃轻轻摇动孵育30分钟℃。
除去上清液，并用1 ml HisTrap 结合缓冲液轻轻洗涤T4-Soc-AAV或T4-Hoc-AAV结合的珠子五次。洗涤后，将微珠沉淀重悬于0.1 ml HisTrap洗脱缓冲液中。在4°C下轻轻摇动孵育5分钟。
按照制造商的方案，在Slide-A-Lyzer透析盒中将PBS-MK缓冲液中的T4-AAV杂交病毒复合载体透析过夜。分装并储存在-80 °C直到需要。

数据分析

Soc有五个赖氨酸，它们提供伯胺基。因此，纯化的Soc蛋白可通过NHS-生物素试剂活化而有效地生物素化，这一点已得到证实。西方用链霉亲和辣根PE印迹roxidase（HRP）抗生物素（参见我们原来的图2A和2B 科学进展研究文章）（朱等人，2019）。
生物素受体肽BAP（G 大号NDIFEAQKIEWHE）遗传融合至T4特设的N末端。生物素连接酶（生物素化酶BirA），其特异性识别BAP单个赖氨酸残基（L），高效率地生物素化的BAP-HOC蛋白在presen CE 的ATP和生物素（Schatz的，1993）（参见图3C和S1A在我们最初的科学进展重新搜索文章）。修饰的BAP-Hoc结合抗生物素蛋白的能力表明了生物素化（请参见我们原始的《科学进展》研究文章中的图S1B ）。此外，由于Hoc-抗生物素蛋白复合物与其他副产物之间存在显着的分子大小差异，最终通过尺寸排阻色谱法纯化了所需的Hoc-抗生物素蛋白复合物（参见我们最初的《科学进展》研究文章中的图S1C和S1D ）（Zhu 等。，2019）。
重组的AAV-DJ载体是单一2型/ 8型/ 9型嵌合体，在培养中的表现优于八种标准AAV血清型（Grimm 等，2008）。采用三质粒转染和HiTrap AVB Sepharose HP色谱柱或碘克沙醇梯度超速离心来生产和纯化重组AAV-DJ载体。VP1，VP2和VP3亚基以1：1：10的比例组装成完整的60聚体AAV衣壳。VP亚基通过生物素-NHS试剂用生物素标记。使用HRP-链霉亲和素的蛋白质印迹表明在生物素-AAV-DJ载体中存在与VP亚基偶联的生物素，而在未标记的载体中未检测到VP亚基条带（请参见我们原始的《科学进展》研究文章中的图S3A和S3B ）（朱）等，2019）。
将T4-Soc-Soc-抗生物素蛋白或T4-HBBA颗粒通过存在于Soc末端的六-组氨酸标签固定在镍珠柱上。该色谱柱可通过T4 Soc-抗生物素蛋白或HBBA桥分子有效捕获生物素化的AAV，并同时去除流通物中未结合的AAV。最后用咪唑洗脱杂合的T4-AAV纳米颗粒，并用PBS-MK缓冲液透析。通过蛋白质印迹，流通中的AAV量和透射电子显微镜（TEM）证实了T4-AAV纳米颗粒的形成（请参见我们原始的Science Advances 研究文章中的图3和S3 [ Zhu 等，2019 ] ）。

菜谱

摩尔的媒介
20克胰蛋白p

15甘菊提取物

8克氯化钠

2克葡萄糖

2克Na 2 HPO 4

1克KH 2 PO 4

将MilliQ H 2 O 添加到1 L

1 M IPTG
238毫克IPTG

将MilliQ H 2 O 加入1毫升
分装并储存在-20°C
HisTrap结合缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 8.0

300毫米氯化钠

20 mM咪唑

储存在4°C

HisTrap洗脱缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 8.0

300毫米氯化钠

400 mM咪唑

储存在4°C

凝胶过滤缓冲液
20毫米Tris-HCl pH 8.0

100毫米氯化钠

储存在4°C

SDS-PAGE脱色溶液
400毫升甲醇

100毫升乙酸

800毫升MilliQ水

M9CA中等
12.5克M9CA 中等粉末

将MilliQ H 2 O 添加到1 L

PI-Mg缓冲液
22毫米KH 2 PO 4

70 氯化钠

1毫米MgSO 4

26 mM Na 2 HPO 4

头绑定缓冲区
50 mM的Tris-HCl pH 8.0

5毫米MgSO 4

储存在4°C

头洗脱缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 8.0

5毫米MgSO 4

300毫米氯化钠

储存在4°C

DNA包装缓冲液
300 mM Tris-HCl pH 7.5

30毫米MgSO 4

1 M氯化钠

10毫米ATP

储存在-20°C

PBS-MK缓冲液
1x PBS（pH 7.4）

1毫米氯化镁2

2.5毫米氯化钾

储存在4°C

DMEM细胞培养完全培养基
435毫升DMEM

50毫升FBS

10毫升1 M HEPES

5毫升100x青霉素/链霉素

储存在4°C

致谢

这项工作是由NIAID / NIH授予AI111538，在由国立卫生研究院授予AI081726和NSF授予MCB-0923873到VBR部分该协议是由适于支承和我们的预viously出版工作（诸等人，201 9 ）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

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