材料和试剂

1.5毫升锥形管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129），高压灭菌
50 ml管（Corning，目录号：352070）
带25 G针的1 ml TB注射器（BD，目录号：309626）
1.2 ml冷冻管（Corning，目录号：430487）
P Ipette提示
1000 MYU 大号（VWR，目录号：16466-008 ）

100 MYU 大号（VWR，目录号：53510-070）

10 MYU 大号（VWR，C Atalog号：89368-974）

玻璃盖玻片（Corning ，目录号：2975245）
6至8周大的成年BALB / c 小鼠（Charles Rivers Bioscience或首选销售商）
股票细菌：肺炎链球菌血清型3应变能获得一种从美国组织培养物保藏中心（ATCC）（ATCC ，目录号：ATCC ® 6303）或肺炎链球菌2型菌株D39可以获得来自国家中心组织采集（国家组织收集中心，目录号：NCTC 7466）
甲型流感病毒（H1N1）可从ATCC：PR8（ATCC，目录号：ATCC VR-1469）或2009年大流行病毒（ATCC，目录号：ATCC VR-1894）
鸡蛋白中的白蛋白（Sigma，目录号：A2512）
血琼脂平板（Fisher Scientific，目录号：R01623）
氢氧化铝/ Rehydragel （Fisher科学，目录号：NC1105454）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号：20-012-027）
屋尘螨（HDM）提取物，冻干的Dermatophagoides pteronyssinus （ Stallergenes -Greer，编号B85）
托德·休伊特汤（BD，目录号249240）
甘油（MilliporeSigma ，目录号：G7893）
2 mg / ml卵清蛋白（OVA）溶液（请参阅食谱）
1 mg / ml HDM储备溶液（请参阅食谱）
肺炎链球菌细菌菌种（见食谱）

配套设备

25 0毫升烧杯（Corning，货号：1003250）
1升烧瓶（Corning，目录号：4980-1L）
搅拌棒（Fisher Scientific ，目录号：14-513-51）
EZ麻醉系统（Euthanex Corp）
ABSL-2生物安全柜
移液器套件（P20，P200，P1000 ）（Gilson，目录号：F167300）
异氟烷液体吸入（Henry Schein，目录号：1182097）
C 离心机（Eppendorf，型号：5810R）
中号Icroscope （奥林巴斯，型号：BX60）
微生物培养箱（新不伦瑞克科学公司，Excella E24孵化器摇床系列）
解剖仪器
镊子（Roboz 外科手术，目录号：RS-8120）

小号Cissors（Roboz 手术，目录号：RS-6808）

-80 °C冷冻室

程序

诱导卵清蛋白（OVA）诱导AAD
准备PBS中2 mg / ml的OVA储备溶液（配方1）。
解冻一小瓶OVA储备溶液并准备OVA /明矾鸡尾酒（每只小鼠需要100 µl鸡尾酒）。此混合物每100 µl接种物包含10 µg OVA和4 mg明矾。
OVA /明矾鸡尾酒：

70％1x PBS

25％氢氧化铝

5％OVA（2毫克/毫升）

OVA转/明矾谷碧Ktail进入1毫升的注射器并腹膜内（叶）注资1 Myueru到每只小鼠的日子-18 和-11（参见图1 和牛逼能1）。一个新的OVA /明矾鸡尾酒，才应进行每天。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902960--1356古一洋一812112 \无花果jpg \图1.jpg

图1.卵白蛋白（OVA）诱导的AAD流感H1N1病毒-肺炎链球菌三重激发模型。该原理图OVA诱导AAD和流感- 肺炎链球菌。合并感染小鼠三重挑战模型包括一种治疗腹膜内给小鼠（叶）用OVA在氢氧化铝（OVA /明矾）并在鼻腔内用OVA 攻击他们，然后感染流感病毒，肺炎链球菌（S. pneumoniae）和/或磷酸盐缓冲液（PBS）。

表1.实验布局

组/治疗

卵

流感病毒

肺炎链球菌

老鼠数

1：PBS对照

PBS

PBS

PBS

5-8

2：仅限AAD

卵

PBS

PBS

5-8

3：仅AAD病毒

卵

病毒

PBS

5-8

4：仅AAD细菌

卵

PBS

细菌

5-8

5：AAD合并感染

卵

病毒

细菌

5-8

在第-4 天，解冻一小瓶OVA储液（在PBS中为2 mg / ml）。
将麻醉室放置在生物安全柜中，并按照制造商的说明用3％的异氟烷“预装”麻醉室。
将小鼠放到麻醉室中；一旦呼吸减慢，则准备好，这通常发生在麻醉室中1-2分钟后。
截至麻醉鼠标选择用一只手，一把抓住背部皮肤和定位的鼠标一身正气，面对你- 请参阅V IDEO 1 在Tibbitt和的Coquet （2016）。
用另一只手吸取50 µl（100 µg）的OVA储备液到鼻孔中。继续保持鼠标直立几秒钟，以完全吸收接种物；剧烈呼吸表明接种物已到达肺部。。
鼻内重复（在）OVA接种连续5天。多余的OVA可以保存在-20 ℃，但废弃后2-3个冻融循环。成功诱导AAD小鼠可以确认，通过测量气道变应性相关的细胞因子（白介素（IL）-5和IL-13），通过酶联免疫吸附测定（ELISA）评估OVA特异性抗IgE 抗体浓度，通过流式细胞术检测细胞向肺的浸润，通过组织学和/或气道对肺的损伤/炎症对乙酰甲胆碱的反应性（如我们的原始论文Roberts et al。，2019中所述）。

替代方法：屋尘螨（HDM）诱导的AAD

我们已经将HDM用作OVA的替代过敏原，并观察到了可比的结果（Roberts 等人，2019）。在流感病毒和随后的细菌感染之前，小鼠连续三天连续三天在鼻内接受HDM攻击（图2）。）：

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902960--1356古一洋一812112 \图jpg \图2.jpg

2.图HOUS E-尘螨（HDM）诱导AAD和流行性感冒肺炎链球菌混合感染。示意图中HDM-AAD诱导和随后的流感- 肺炎链球菌合并感染

准备在PBS中1 mg / ml的HDM储备溶液（配方2）。
在第-16 天，解冻一小瓶HDM储液（PBS中1 mg / ml）。
将麻醉室放置在生物安全柜中，并按照制造商的说明用异氟烷“预装”麻醉室。
将50 µl（100 µg）的HDM溶液吸移到每只小鼠的鼻孔中。继续保持鼠标垂直几秒钟，以完全吸收接种物。过量的HDM可以在-20 °C 下保存，但在2 °C 后可以丢弃-3冻融循环。
如上所述，在随后的几天重复HDM接种。

甲型H1N1流感病毒和肺炎链球菌共感染
注意：我们在实验室鸡蛋中生产了H1N1 A流感/加利福尼亚/ 4/2009（CA04）和A / PR8 / 34（PR8）的实验室库存，请参见病毒生长规程（Cottey等，2001； Zhao等。，（2018年）或从供应商处购买。

甲型H1N1病毒攻击

在最后一次OVA或HDM处理后的第7天，在ABSL-2机柜中工作，将H1N1流感病毒原液稀释到无菌1x PBS中每毫升200个噬菌斑形成单位（PFU）（最终剂量：在50 µl接种物中的10 PFU）每个鼠标）并保存在冰上。
将麻醉室放入生物安全柜中，并按照制造商的说明为异氟烷预填充麻醉室。
吸取50 µl稀释的流感病毒到每只小鼠的鼻孔中。继续保持小鼠直立几秒钟，以完全吸收接种物。
在流感感染之前或之后单独或成组称重小鼠。
每天称重，直到小鼠开始恢复体重。
注：小号。UB-致死性感染的老鼠就开始减肥大约3天，并会开始恢复在6-9天的平均值，小鼠通常损失约10 Pasento其起重量与低剂量流感病毒攻击。

继发性肺炎链球菌

流感病毒感染后第8天，在ABSL-2柜子中，解冻一小瓶冷冻的肺炎链球菌（配方3），然后将其在1.5 ml锥形管中依次稀释，用无菌1x PBS稀释至亚致死剂量，并保存在冰上。
对于我们的3型肺炎链球菌A66.1株库存，对于非流感感染的小鼠，100-50 0集落形成单位（CFU）是亚致死剂量，对于流感感染的小鼠，则是90-100％致死率。
对于我们的2型D39血清型存量，1 x 10 5 CFU对流感感染的小鼠具有致死性，而对非流感感染的小鼠则具有亚致死性。
为了量化最初的细菌输入量，请从连续稀释的试管中吸取100 µl细菌到血琼脂平板上（每个平板的剂量为100-300 CFU ），并保存在37 °C保温箱过夜– 第二天在平板上计数CFU的数量，以确定实际的感染剂量。
如上所述，使用异氟烷麻醉小鼠。
通过向鼻孔吸取50 µl的细菌感染小鼠。
监视小鼠的生存或牺牲并收获支气管肺泡灌洗液和/或肺，以分析细胞结构，细胞因子产生和/或组织学，以了解肺部结构。
注意：非AAD流感病毒- 肺炎链球菌感染的小鼠在细菌攻击后的1-3天会死于感染。我们通常在第16天（S 后1天）监测存活或收集支气管肺泡灌洗液和/或肺组织进行分析。肺炎感染）以评估细菌负担，细胞因子表达，肺损伤和/或细胞浸润（如Roberts等，2019 ，我们的原始论文所述）。

RECIP 居

2 mg / ml OVA溶液
在一个250 毫升的烧杯中，加入200毫克的OVA （鸡蛋中的白蛋白），并用1x PBS 使其体积达到100毫升
将搅拌棒放入混合物中，在室温下搅拌10分钟
将1 ml等分试样放入1.5 ml锥形管中，并储存在-20 °C
1 mg / ml HDM储备溶液
在25 0 ml的烧杯中，加入100 mg冻干的HDM提取物，并用1x PBS 将体积增加至100 ml
将搅拌棒放入混合物中，在室温下搅拌10分钟
将1 ml等分试样放入1.5 ml锥形管中，并储存在-20 °C
注意：在分装过程中轻轻旋转溶液以防止HDM沉降。

肺炎链球菌细菌原种
第一天：

在血琼脂平板上划线从ATCC获得的冷冻细菌，并在37 °C的微生物培养箱中孵育过夜
通过将15 g的Todd-Hewitt培养基和蒸馏的H 2 O混合至最终体积为500 ml，准备并高压灭菌500 ml的Todd-Hewitt肉汤

第二天

在3 ：00 PM ，创建发酵剂培养物增加一只细菌菌落5毫升托德休伊特肉汤，并允许培养生长，无晃动在37 ℃，直到5 ：00 PM
在5:00 PM ，将300 ml Todd-Hewitt肉汤添加到1 L 烧瓶中，并接种5 ml发酵剂培养物，并将其置于37 °C的微生物培养箱中，不摇动使其过夜培养

第三天

在300毫升1000转移过夜培养物于50ml管中并离心XG 在4 35分钟℃下。弃去上清
将每个沉淀重悬于10 ml PBS中并涡旋使其破碎，用PBS将体积升至45 ml
重复离心并丢弃上清液
重复BC步骤（第3天），再进行2次
第三次旋转之前，合并等分试样（向每个试管中加入10毫升，涡旋，然后合并）
最后一次洗涤后，加入2 ml 15％甘油/ Todd-Hewitt肉汤，并轻轻上下移液重悬沉淀，使最终体积达到4 ml
注意：这通常导致每毫升1 x 10 9 -5 x 10 9 CFU的浓度。

将等分试样加到盖玻片上，并在显微镜下检查细菌，以确保大多数是单细胞而不是长链。
等分130 亩升向1.2毫升冷冻管的管和储存等分试样在-80 ℃下。

第四天：

要滴定细菌原液，解冻一小瓶原液
在1.5 ml锥形管中的PBS中连续稀释10倍（稀释-1至-8）
将-4至-8稀释液铺在血琼脂平板上，并在微生物培养箱中孵育过夜
第二天，用100-300个菌落计数平板并计算浓度。例如，如果-6平板上有100个菌落，则储备量为：（100 CFU计数/ 0.1ml平板）x 10 6 稀释= 1 x 10 9 CFU / ml原料浓度

致谢

精简协议是一个此前公布的罗伯茨等人。（2019）。YF得到了支持由美国肺脏协会生物医学研究基金（RG341974），并支持由美国心脏协会的科学家开发格兰特（17SDG33630188 ）和美国国立卫生研究院（1R56AI146434-01 ）。

竞争利益

我们没有任何利益冲突。

道德规范

动物护理和实验方案是根据《 NIH 实验动物的护理和使用指南》进行的，并得到奥尔巴尼医学院的机构动物护理和使用委员会的批准（协议编号17-03006，05/19 / 2017-05 / 19/2020 ）。

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